【《环介导恒温扩增技术(LAMP)发展研究国内外文献综述》5400字】

环介导恒温扩增技术(LAMP)发展研究国内外文献综述1.1环介导等温扩增技术(LAMP)的反应体系环介导等温扩增技术(Loop-

mediated

Isothermal

Amplification,LAMP)，是针对目标基因的6个区域设计出4条特异性引物，在恒温条件下(65℃左右)加入链置换DNA聚合酶，可在1h之内完成核酸扩增反应，将目标DNA片段扩增109～1010倍，具有恒温快速扩增和高特异性的特点REF_Ref20152\n\h[48]。(1)引物：LAMP技术的引物设计是反应的关键，它的设计很巧妙。设计的总体原则是提高核酸扩增的效率和特异性，它要求四种特异性引物与靶基因序列上的6个不同区域完全匹配后才能进行核酸扩增反应。引物由目标DNA序列及其互补碱基序列构成，分为2条内引物和2条外引物。内引物IP和BP含有2个显著区域，IP含有区域F1的互补序列F1c和F2区域的靶序列；BP含有区域B1的互补序列B1c和B2区域的靶序列。在反应开始的阶段要将4条特异性引物与目标DNA的相应区域进行契合是十分重要的一个步骤，所以要选择一定的温度范围，以便不同序列和不同大小的引物可以进行融合REF_Ref20302\n\h[49-50]。内引物(F2和B2)引导的合成反应所需的温度显然高于外引物(F3和B3)所引导的合成反应，这就可以保证内内引物可以更早的结合到目标DNA序列上，这个最适合温度一般设定为63℃左右REF_Ref20416\n\h[51]。(2)模板DNA：因为对于LAMP技术来说，其中有一步限速反应，这就是链置换DNA合成反应，因此LAMP反应的效率由模板DNA的大小来决定。模板DNA一般控制在130～200bp

DNAs最为合适。(3)链置换DNA聚合酶：由上可知链置换DNA合成反应是LAMP反应的限速反应，链置换DNA聚合酶就是此反应步骤的限速酶，因此链置换DNA聚合酶是控制扩增速率的一个关键性因素，当模板DNA少于10～23mol，链置换DNA聚合酶对于扩增反应是最好的。(4)缓冲液：缓冲液可以破坏DNA双螺旋结构，从而显著的提高LAMP技术的扩增效率。1.2环介导等温扩增技术(LAMP)的反应步骤第一步:在恒温条件下一般是65℃左右，目的序列上的e和正向内引物FIP的2区段碱基互补配对，此时的模板DNA双链处于动态平衡的状态，同时启动链置换DNA的合成，在链置换DNA聚合酶的作用下，以F2区段的3＇末端为起点开始。第二步:在链置换活性DNA聚合酶的作用下，开始合成模板DNA的互补链，并以F2区段的3＇端为起点。第三步:正向外引物F3和目的序列F2c区段的F3c碱基序列互补，以F3区段的3＇末端开始，在链置换活性DNA聚合酶的作用，一同开始置换由FP引物引导合成的DNA链，同时一头开始合成新的DNA链，就这样一直向前延伸。第四步:在最后形成双链，分别由引物F3引导合成的DNA链和DNA模板链形成。第五步:由前几步可知，在置换酶的作用下，正向引物2区段引导合成的DNA链被正向引物F3区段引导合成的链进行了置换反应，变成了DNA单链，而这条DNA单链的5＇末端存在有F1c和F1区段与之互补的段。第六步:5＇末端F1c和F1区段的互补段，可以自身进行碱基互补配对，形成一个形似环状的结构。而在另一端以B2区段的3＇端为起点，反向的内引物BIP可以和此DNA单链碱基互补配对形成互补双链。在合成双链的同时环状结构被打开，此时引物BIP的外侧插入一个反向外引物B3，并与B3c碱基序列进行互补配对。第七步:由B3的3＇末端开始，在置换酶的作用下，反向内引物BIP引导合成的DNA链，同时一头开始合成新的DNA链，就这样一直向前延伸。最终和引物B3所引导合成DNA链形成双链。第八步:在置换酶的作用下，引物B3将之前由引物BP所引导合成DNA链进行链换反应，产生一条DNA单链，这条单链的两端有碱基互补序列。他们可自己进行碱基互补配对，形成另一个形似环状的结构。此时的DNA链呈现出一个哑铃状的结构这个哑铃状结构就是LAMP核酸扩增反应的起始结构。到目前为止，以上所有的步骤都是为了形成哑铃结构，为开始进行LAMP核酸扩增反应做准备，如图1-2所示。图1-2LAMP技术原理图1Fig.1-2SchemeofLAMPreaction1第九步:以下是LAMP核酸扩增反应循环:在哑铃状结构中，由3＇末端的FIP区段开始，以自身DNA链为模板，进行DNA链的合成和延伸。就在此时，引物FP的F2区段与环上单链F2c杂交，开启新一轮的链置换反应。首选将之前区段合成的DNA双链解离成单链。在解离出的单链3＇末端上有存在B1c和B1的碱基互补序列，同样他们自身可以发生碱基互补配对，从而再次形成环状结构，然后由3＇末端的B1区段开始，以自身DNA链为模板，进行DNA链的合成和延伸REF_Ref20625\n\h[54]。而此时解离FP区段的互补链，解离出的单链两端分别有F11c区段和B1/B1c区段两区段互补，这就可以使其自身发生碱基配对，又形成哑铃状结构，但此时形成的哑铃结构正好与之前在第八步中形成的哑铃结构相反。同样的继续由3＇末端的B1区段开始，以本身的DNA链为模板，进行DNA链的合成和延伸。而此时此刻，引物BP的B2区段与环上单链B2c杂交，开启新一轮的链置换反应。经过与之前相同的过程，又形成环状结构。经过前几个过程，周而复始在同一条链上互补序列形成大小不一的结构，完成核酸扩增，如图1-3所示。图1-3LAMP技术原理图2Fig.1-3SchemeofLAMPreaction21.3环介导等温扩增技术(LAMP)产物的检测方法(1)肉眼观察法：LAMP反应具有高效性，在核酸大量扩增合成的时候，溶液中镁离子结合与焦磷酸根离子（从dNTPs中析出）结合，产生白色沉淀物，即副产物焦磷酸镁REF_Ref20739\n\h[55]。因此我们可以直接在反应结束后肉眼观察白色沉淀的产生情况，根据是否形成副产物焦磷酸镁沉淀来定性判断反应是否发生LAMP反应，或者通过仪器来检测反应液的浊度变化情况，从而进行实时定量测定。本研究就是采用观察浊度曲线情况来进行试验的实时定量测定。虽然在常规的PCR反应时也能够产生焦磷酸盐或焦磷酸盐离子，但由于PCR反应它扩增效率较LAMP来说比较低，焦磷酸盐或焦磷酸盐离子的生成量比较小，即白色沉淀产生量不大，因此很难直接通过肉眼观察到白色沉淀进行产物测定。(2)添加荧光染料法：对LAMP反应进行实时定量检测也可以通过添加荧光染料的方法。也就是说向整个反应体系里添加荧光染料比如溴化乙锭、SYR、Green等，使得反应结果进行荧光呈色，然后可以通过观察反应体系里的荧光强弱变化来判断扩增反应的是否发生和发生程度，我们还可以通过检测仪器来对混有荧光燃料的反应产物进行测定，从而实现反应结果的实时定量测REF_Ref20841\n\h[56]。例如我们将1µSYBR-GreenⅠ荧光染料(只与双链DNA中的小沟进行结合)添加到整个LAMP反应体系中，当出现扩增产物的时候，荧光染料便与DNA小沟双链进行结合进行染色，通过肉眼可观察到荧光染料的颜色由原来的橘黄色变为绿色，同时也可以使用手持紫外线灯(320nm)照射完成观察进行荧光检测。在1个LAMP体系里，荧光信号的强弱就代表了双链DNA分子的数量多少，也可以用实时定量PCR仪进行荧光强度测定，进一步实现定量检测的目的。(3)琼脂糖凝胶电泳法：我们通过之前反应扩增原理可以知道，LAMP扩增反应最后产生一个像花椰菜一样的茎环DNA混合物，其原理是是在退火过程中在同一条链上目标序列的反向重复反复交替从而形成的一个多重环状形似花椰菜的一个结构REF_Ref20955\n\h[57]。所以，在用2％的琼脂糖凝胶进行电泳的时候，LAMP核酸扩增反应最终产物由于结构原因在结果上呈现的是典型的阶梯状条带，而非常见的一条单链条带。我们可以通过观察梯形条带，从而更准确的了解LAMP反应发生的情况。如果用限制性核酸内切酶剪切LAMP最终产物后，再利用琼脂糖凝胶进行电泳可出现一条单一目标序列条带。(4)特异性可视化检测：如果运用上述的检测方法检测的话，就只能得到2种结果:显示扩增或者显示不扩增。所以如果在LAMP核酸扩增反应过程中一旦发生了非特异性的核酸扩增，我们就无法进行鉴别了。因此，众多研究者们又对产物的特异性进行了大量的研究。2006年MoriREF_Ref21324\n\h[58]等通过加入探针和阳离子聚合物对LAMP核酸扩增产物进行了特异性可视化检测的试验研究。如果在LAMP反应体系中加入特异性探针，而这些探针带有不同的荧光素，这些探针可以与反应的产物进行特异性结合，同时在反应结束后加入阳离子聚合物（聚乙烯亚胺），而这些和探针特异性结合的反应产物与这些阳离子聚合物结合后形成了P聚合物，这个P聚合物不溶于水而且可以释放出其特异性探针所对应的荧光，利用荧光监测装置就可以肉眼的情况下进行荧光观察，来判断扩增反应的特异性。1.4环介导等温扩增技术（LAMP）的优点(1)可以直接扩增RNA:可以通过添加逆转录酶，实现将DNA扩增到RNA的结果，就是在扩增脱氧核糖核酸体系中添加一些逆转录酶，同时需要加入适当的抑制剂比如抑制RNA酶的抑制剂，就可以将DNA逆转录为RNA，继续扩增就可以实现RNA的一步扩增。(2)操作简单:LAMP反应对温度要求不高，在恒定的温度下反应就可以很好的进行，同时反应时不需要反复进行温度循环，也不需要加入什么特殊的试剂就可以完成。(3)快速高效：整个扩増反应只需要在1小时以内就可以扩增到原来的109~1010倍，耗时短。(4)特异性强：LAMP技术是针对目标基因的6个区域设计出了4种特异性的引物，而且目标基因的这6个区段顺序也是有固定的规定的，因此理论上来讲LAMP技术扩增反应的特异性十分高，我们也可以根据特异性引物引导的扩增反应是否发生从而判断所要检测的目标基因是否存在，也就是说可以设定某细菌或者病毒的特异性引物，观察扩增与否来对于该细菌或病毒进行定性检测。(5)灵敏度高:因为反复大量的扩增反应，可以在短时间内将微量的目标基因扩增到大量，足以通过仪器检测出来的程度，因此将该技术应用于检测微量目的病原菌上，可以达到在极少目标菌含量的检测目的。(6)检测简便，污染小:检测结果可以直接通过仪器检测荧光信号或者浊度曲线的变化来确定有没有发生特异性扩增反应，进行实时测定。同时整个试验过程中均不需要开盖，采用闭管式扩增，从而避免了开盖造成的气溶胶污染现象。1.5环介导等温扩增技术（LAMP）的应用由于LAMP技术具有灵敏度高、特异性强、快速高效、操作简单等特点，此方法在多个领域均有广泛应用前景，比如食品卫生检验、临床疾病的诊断、农业、医药卫生监测等，在这里我们主要探讨一下LAMP技术在食品安全检测中的一些应用：2003年MaruyamaREF_Ref21582\n\h[59]等将LAMP技术和原位杂交技术相结合，用于检验带有stx2基因的Ecoli57:H7，这种结合的方法克服了原位PCR的一些缺点，LAMP技术在恒温条件下尤其是相对较低的温度下，可以减少对细胞的破坏，有利于应用荧光抗体对细胞进行进一步的鉴定，并且其产物结构的特殊性防止了产物泄露到细胞外。在扩增中，还可以使用荧光抗体标记，结果的检测更加准确。研究还发现，LAMP技术的背景颜色较浅。2005年，SongREF_Ref14953\n\h[60]等用LAMP技术对EIEC和志贺氏菌的同源基因ipaH进行检测，从病人的腹泻样便中分离出38株肠病原体，利用LAMP技术对其进行特异性检测，试验结果表明LAMP方技术对所有的志贺氏菌及EIEC呈阳性，对其他菌呈阴性。除此之外，LAMP技术还可应用于食品中金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌回等许多细菌的检测，结果均显示出了该方法的较高特异性和较高的灵敏度。LAMP方法的优势除了较高的特异性和灵敏度外，还有操作简单的优势，反应对仪器设备要求比较低，拥有一台水浴锅或恒温箱就能够进行试验反应，同时该方法观测试验结果的方法也十分简单，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或者绿色荧光的生成就可判断反应是否发生，十分简便快捷高效，特别是适合口岸现场快速诊检测的要求，这正是今后研究工作发展的方向和要考虑的关键点，可以为提高口岸食品快速检测工作效率提供有力技术支撑。参考文献TongS,DavisJS,EichenbergerE,etal.StaphylococcusaureusInfections:Epidemiology,Pathophysiology,ClinicalManifestations,andManagement[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2015,28(3):603-661.东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001,246-247.方太松,王军,王晔茹,吴瑜凡,刘阳泰,王翔,董庆利.我国熟肉制品中金黄色葡萄球菌污染状况Meta分析[J].生物加工过程,2020,1803:386-391.陈琼,董华夏,戴小芳,刘萍,晏涛,郦娟.畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌可视化LAMP检测方法的研究[J].食品工业科技,2020,4120:235-240+245.QuiteriaJ,DCid,SanzR,etal.InfluenceofageofthedonorsheeponthephagocytosisofStaphylococcusaureussubspeciesanaerobiusandSaureusbyneutrophils-ScienceDirect[J].ResearchinVeterinaryScience,1996,61(3):231-233.李琼琼,范一灵,宋明辉,施春雷,杨美成.食源性金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法[J].食品安全质量检测学报,2016,702:555-560.胡金强,雷俊婷,白艳红,魏向珂,景建洲,高辉,孙新城,董彩文,耿尧,姜春鹏.食品中金黄色葡萄球菌PCR-ELISA检测技术建立[J].食品工业科技,2016,3720:63-67.

A,JindaiFan,etal.

PreliminarytreatmentofbovinemastitiscausedbyStaphylococcusaureus,withtrx-SA1,recombinantendolysinofS.aureusbacteriophageIME-SA1[J].VeterinaryMicrobiology,2016,191:65-71.MoriY,NagamineK,TomitaN,etal.Detectionofloop-mediatedisothermalamplificationreactionbyturbidityderivedfrommagnesiumpyrophosphateformation.[J].BiochemBiophysResCommun,2001,289(1):150-154.刘邦慧.金黄色葡萄球菌Rsp调控毒力基因表达的分子机制[D].中国科学技术大学,2020.汪慧春.面包虾中金黄色葡萄球菌生长预测模型的建立[D].广东海洋大学,2015.李天铭.AraC家族转录调节蛋白Rsp对金黄色葡萄球菌毒力的调节及机制[D].复旦大学,2014.颜文光.不同来源金黄色葡萄球菌的肠毒素基因分布与SCCmec，spa及MLST分型研究[D].扬州大学,2015.许振伟,韩奕奕,孟瑾,郑小平,邹明辉.熟食肉制品中金黄色葡萄球菌风险评估基础研究[J].包装与食品机械,2012,3005:40-43.黄忠民,李媛媛,艾志录,王娜,潘治利,谢新华,范会平,索标.甜菜碱对金黄色葡萄球菌生长的影响及其抑制模型的建立[J].中国食品学报,2014,1410:42-48.UmedaK,NakamuraH,YamamotoK,etal.MolecularandepidemiologicalcharacterizationofstaphylococcalfoodborneoutbreakofStaphylococcusaureusharboringseg,sei,sem,sen,seo,andselugeneswithoutproductionofclassicalenterotoxins.[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2017,256:30-35.AbrahamJ,MansourC,VeledarE,etal.Staphylococcusaureusbacteremiaandendocarditis:theGradyMemorialHospitalexperiencewithmethicillin-sensitiveSaureusandmethicillin-resistantSaureusbacteremia.[J].AmericanHeartJournal,2004,147(3):536-539.王林会.基于荚膜及外毒素的免疫策略防治金黄色葡萄球菌感染效果研究[D].大连理工大学,2013.TiradoC,SchmidtK.WHOSurveillanceProgrammeforControlofFoodborneInfectionsandIntoxications:Prelim