姜黄素对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用及机制探究

姜黄素对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用及机制探究一、引言1.1研究背景与意义宫颈癌作为全球范围内严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，其发病率在女性生殖系统肿瘤中位居前列。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，全球宫颈癌新发病例约60.4万，死亡病例约34.2万。在中国，每年约有10.6万新发病例，约4.8万死亡病例，且发病呈年轻化趋势，给患者家庭和社会带来了沉重的负担。宫颈癌的发生与多种因素相关，其中高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是主要病因，尤其是HPV16和HPV18型。从感染HPV发展为宫颈癌通常需要经历较长的过程，这期间涉及多个基因的异常表达和细胞信号通路的紊乱，如p53基因、Rb基因等抑癌基因的失活，以及PI3K/AKT、MAPK等信号通路的异常激活。目前，宫颈癌的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗等，但这些治疗方法存在一定的局限性，如手术创伤大、放疗和化疗的毒副作用严重，且对于晚期和复发转移的患者疗效不佳，因此，寻找新的治疗方法和药物具有重要的临床意义。姜黄素（Curcumin）是从姜科植物姜黄根茎中提取的一种天然多酚类化合物，具有广泛的生物学活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等。近年来，越来越多的研究表明，姜黄素在肿瘤防治方面展现出巨大的潜力，对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导凋亡、抑制侵袭和转移等作用。其作用机制涉及多个层面，包括调节细胞周期相关蛋白、诱导细胞凋亡相关蛋白表达、抑制肿瘤血管生成、调节肿瘤微环境等。在宫颈癌研究领域，已有研究报道姜黄素能抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖，但具体的作用机制尚未完全明确，仍需深入研究。本研究旨在探讨姜黄素抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖的相关作用机制，通过体外实验观察姜黄素对HeLa细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响，并从分子水平探究其潜在的作用靶点和信号通路，为姜黄素在宫颈癌治疗中的应用提供理论依据和实验基础，有望为宫颈癌的治疗提供新的策略和药物选择。1.2研究目的与内容本研究旨在深入探究姜黄素抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖的具体作用机制，为宫颈癌的治疗提供新的理论依据和潜在治疗策略。围绕这一核心目的，研究内容主要涵盖以下几个方面：姜黄素对HeLa细胞增殖的影响：采用MTT法检测不同浓度姜黄素在不同作用时间下对HeLa细胞增殖的抑制率，绘制细胞生长曲线，明确姜黄素抑制HeLa细胞增殖的剂量-效应关系和时间-效应关系。利用细胞计数法，在显微镜下对不同处理组的HeLa细胞进行计数，直观反映细胞数量的变化，进一步验证姜黄素对细胞增殖的抑制作用。通过克隆形成实验，观察HeLa细胞在姜黄素作用后形成克隆的能力，评估姜黄素对细胞长期增殖能力的影响。姜黄素对HeLa细胞凋亡的影响：运用流式细胞术，采用AnnexinV-FITC/PI双染法，检测姜黄素处理后HeLa细胞凋亡率的变化，分析凋亡细胞在不同时期（早期凋亡和晚期凋亡）的分布情况。利用Hoechst33258染色，在荧光显微镜下观察HeLa细胞核形态的变化，如细胞核浓缩、碎裂等凋亡特征，直观判断细胞凋亡情况。通过Westernblot法检测细胞凋亡相关蛋白，如Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax）、Caspase家族蛋白（Caspase-3、Caspase-9）等的表达水平，从分子层面探究姜黄素诱导HeLa细胞凋亡的机制。姜黄素对HeLa细胞周期的影响：同样使用流式细胞术，通过PI单染法检测姜黄素处理后HeLa细胞周期各时相（G0/G1期、S期、G2/M期）的分布比例，分析姜黄素对细胞周期的阻滞作用。采用RT-PCR法检测细胞周期相关蛋白，如Cyclin（CyclinD1、CyclinE）、CDK（CDK2、CDK4）、p21、p27等的mRNA表达水平，以及Westernblot法检测其蛋白表达水平，探究姜黄素影响细胞周期的分子机制。姜黄素作用的分子机制研究：基于前期研究及相关文献报道，筛选与姜黄素抑制HeLa细胞增殖、诱导凋亡和影响细胞周期可能相关的信号通路，如PI3K/AKT、MAPK、NF-κB等信号通路。采用Westernblot法检测这些信号通路中关键蛋白的磷酸化水平和表达水平，如PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κBp65、p-NF-κBp65等，明确姜黄素对这些信号通路的激活或抑制作用。利用siRNA干扰技术或特异性抑制剂，阻断相关信号通路，观察姜黄素对HeLa细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响是否发生改变，进一步验证信号通路在姜黄素作用机制中的关键作用。通过基因芯片技术或蛋白质组学技术，全面分析姜黄素处理前后HeLa细胞中基因表达谱或蛋白质表达谱的变化，筛选出差异表达的基因和蛋白质，深入挖掘姜黄素作用的潜在分子靶点和新的作用机制。1.3研究方法与技术路线研究方法：细胞培养：将人宫颈癌HeLa细胞培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%CO₂及饱和湿度的培养箱中常规培养，定期换液和传代，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。MTT法检测细胞增殖：将HeLa细胞以一定密度接种于96孔板，培养24h后，加入不同浓度（如0、5、10、20、40、80μmol/L）的姜黄素，分别作用24h、48h、72h。每个浓度设置5个复孔，同时设置空白对照组（只加培养液）和阴性对照组（加细胞和培养液但不加姜黄素）。在培养结束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h后，弃去上清液，加入150μLDMSO，振荡10min使结晶充分溶解，用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。根据公式计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%，绘制细胞生长曲线。细胞计数法：将HeLa细胞接种于6孔板，培养24h后加入不同浓度姜黄素，作用相应时间。用胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，取适量细胞悬液与等体积的台盼蓝染液混合，在显微镜下用血细胞计数板计数，计算细胞数量，比较不同处理组细胞数量的差异。克隆形成实验：将HeLa细胞以低密度（如200-500个/孔）接种于6孔板，培养24h后加入不同浓度姜黄素，培养10-14天。期间每隔2-3天换液一次，待细胞形成肉眼可见的克隆时，弃去培养液，用PBS冲洗2-3次，用4%多聚甲醛固定15-20min，再用0.1%结晶紫染色10-15min，自来水冲洗后晾干，计数克隆数（≥50个细胞的克隆为一个克隆），计算克隆形成率：克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）×100%。流式细胞术检测细胞凋亡：将HeLa细胞接种于6孔板，培养24h后加入不同浓度姜黄素，作用48h。收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入500μLBindingBuffer重悬细胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，轻轻混匀，避光孵育15min，用流式细胞仪检测，分析早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）和晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）的比例，计算细胞凋亡率。Hoechst33258染色观察细胞凋亡：将HeLa细胞接种于放有盖玻片的6孔板，培养24h后加入不同浓度姜黄素，作用48h。取出盖玻片，用PBS冲洗2-3次，用4%多聚甲醛固定15-20min，再用PBS冲洗3次，加入Hoechst33258染液（10μg/mL），避光染色10-15min，PBS冲洗3次后，用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察细胞核形态，拍照记录。Westernblot法检测蛋白表达：将HeLa细胞接种于6孔板，培养24h后加入不同浓度姜黄素，作用48h。收集细胞，加入RIPA裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，4℃、12000r/min离心15min，取上清液，用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸5min使蛋白变性，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1-2h，加入一抗（如Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27、PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κBp65、p-NF-κBp65等，根据实验目的选择），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤3次，每次10min，加入相应的二抗，室温孵育1-2h，TBST洗涤3次后，用ECL发光液显色，在化学发光成像系统下曝光、拍照，用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。RT-PCR法检测mRNA表达：将HeLa细胞接种于6孔板，培养24h后加入不同浓度姜黄素，作用48h。用TRIzol试剂提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，根据目的基因（如CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27等）和内参基因（如GAPDH）的引物序列进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃预变性3-5min；95℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸30-60s，共35-40个循环；72℃终延伸5-10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照，用ImageJ软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的基因mRNA的相对表达量。siRNA干扰技术：针对筛选出的关键信号通路中的关键基因（如PI3K、AKT等），设计并合成特异性siRNA序列。将HeLa细胞接种于6孔板，培养24h后，按照脂质体转染试剂说明书，将siRNA转染至细胞中，转染6-8h后更换培养液，继续培养24h，再加入姜黄素处理，后续检测细胞增殖、凋亡和细胞周期等指标，与未转染siRNA的姜黄素处理组进行对比。基因芯片技术或蛋白质组学技术：将HeLa细胞分为对照组和姜黄素处理组，姜黄素处理组加入最佳作用浓度的姜黄素作用48h。收集两组细胞，分别提取总RNA或总蛋白，进行基因芯片检测或蛋白质组学分析。基因芯片检测后，对差异表达基因进行筛选、聚类分析和功能注释，蛋白质组学分析后，对差异表达蛋白质进行鉴定、功能分析和通路富集分析，筛选出与姜黄素作用相关的关键基因和蛋白质。技术路线：技术路线图如图1-1所示，首先进行HeLa细胞的培养与复苏，然后用不同浓度姜黄素处理细胞，分别从细胞增殖、凋亡、细胞周期三个方面进行检测，采用MTT法、细胞计数法、克隆形成实验检测细胞增殖；通过流式细胞术、Hoechst33258染色、Westernblot法检测细胞凋亡；运用流式细胞术、RT-PCR法、Westernblot法检测细胞周期。同时，对姜黄素作用的分子机制进行研究，利用Westernblot法检测相关信号通路关键蛋白，用siRNA干扰技术或特异性抑制剂验证信号通路，最后通过基因芯片技术或蛋白质组学技术全面分析差异表达基因和蛋白质，深入探究姜黄素抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖的作用机制。[此处插入技术路线图，图的标题为“姜黄素抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖作用机制研究技术路线图”，图中清晰展示从细胞培养到各项实验检测及分子机制研究的流程和步骤]二、相关理论与研究基础2.1姜黄素概述姜黄素（Curcumin）是一种从姜科植物姜黄（CurcumalongaL.）根茎中提取的天然多酚类化合物，作为姜黄发挥药理作用的主要活性成分，其在传统医学中已有悠久的应用历史。姜黄在《唐本草》中就有记载，距今已有1300多年，在传统医学里，姜黄常用于治疗多种疾病，而姜黄素正是其发挥药效的关键物质。从理化性质来看，姜黄素分子式为C_{21}H_{20}O_{6}，分子量为368.37，呈橙黄色结晶粉末状，味稍苦。它不溶于水和乙醚，却可溶于乙醇、丙二醇，且易溶于冰醋酸和碱溶液。在不同的酸碱性条件下，姜黄素会呈现出不同的颜色，在碱性时呈红褐色，中性、酸性时呈黄色。姜黄素的熔点为179-182℃，对还原剂的稳定性较强，着色性强，一经着色后就不易褪色，但对光、热、铁离子敏感，耐光性、耐热性、耐铁离子性较差。其化学结构包含一个α,β-不饱和-β-二酮基，在2个苯环上分别有酚羟基和甲氧基，这种独特的结构使其具备多种生物学活性。姜黄素具有广泛的药理活性。在抗氧化方面，姜黄素能够清除体内过多的自由基，如超氧阴离子自由基、羟自由基等，抑制脂质过氧化反应，保护细胞免受氧化损伤。研究表明，姜黄素可以提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，降低丙二醛（MDA）的含量。在抗炎作用上，姜黄素能够抑制炎症相关细胞因子的产生和释放，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等，还可抑制核因子-κB（NF-κB）等炎症信号通路的激活。在抗菌抗病毒领域，姜黄素对多种细菌和病毒具有抑制作用，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单纯疱疹病毒等。在癌症治疗研究中，姜黄素展现出了巨大的潜力。它对多种肿瘤细胞具有抑制增殖的作用，通过调节细胞周期相关蛋白，使肿瘤细胞阻滞在特定的细胞周期，从而抑制其分裂和增殖。比如，姜黄素可以下调细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE的表达，上调p21、p27等细胞周期抑制蛋白的表达，将肿瘤细胞阻滞在G0/G1期或G2/M期。姜黄素还能诱导肿瘤细胞凋亡，通过激活内源性和外源性凋亡途径，促使癌细胞死亡。它可以上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，激活Caspase家族蛋白，如Caspase-3、Caspase-9等，引发细胞凋亡级联反应。姜黄素还具有抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤侵袭转移的能力，通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）等血管生成相关因子的表达和活性，减少肿瘤血管的生成，切断肿瘤的营养供应；通过抑制基质金属蛋白酶（MMPs）等蛋白的活性，降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力。在乳腺癌细胞研究中，姜黄素能够显著抑制乳腺癌细胞的增殖、诱导凋亡，并降低其迁移和侵袭能力；在肝癌细胞实验中，姜黄素同样表现出良好的抗肿瘤效果。随着研究的不断深入，姜黄素在癌症治疗中的应用前景愈发广阔，有望成为一种新型的抗癌药物或辅助治疗药物。2.2人宫颈癌HeLa细胞人宫颈癌HeLa细胞系源自1951年一位名为海瑞塔・拉克丝（HenriettaLacks）的31岁非裔美国女性宫颈癌患者的肿瘤组织。当时，医生从她的宫颈肿瘤上取下组织样本并在实验室中进行培养，这些细胞展现出了非凡的特性，它们在适宜的培养条件下能够持续不断地分裂增殖，成为医学史上首例经体外培养而“永生不死”的人类细胞。HeLa细胞具有独特的生物学特性。从形态学上看，在显微镜下观察，HeLa细胞呈上皮样，多为多边形或梭形，细胞贴壁生长，形态较为均一。在细胞生长特性方面，其生长速度极快，倍增时间短，约为24小时，远远快于正常细胞。这种快速增殖的能力使其在细胞培养过程中能够迅速形成细胞单层，为实验研究提供了充足的细胞来源。与正常宫颈细胞相比，HeLa细胞的染色体数目和结构存在明显异常。正常人体细胞含有46条染色体，而HeLa细胞的染色体数目为76-80条，并且存在大量的染色体易位、缺失和扩增等异常情况。这些染色体异常导致HeLa细胞的基因表达谱发生改变，许多与细胞增殖、凋亡、分化等相关的基因表达失调，使得细胞获得了无限增殖和抗凋亡的能力。HeLa细胞在宫颈癌研究领域具有不可替代的重要应用价值。由于其来源于宫颈癌组织，能够高度模拟体内宫颈癌的生物学行为，为研究人员提供了一个理想的体外模型。研究人员可以利用HeLa细胞深入探究宫颈癌的发病机制，如研究HPV病毒感染宫颈细胞后如何引发细胞的恶性转化，通过对HeLa细胞中HPV病毒基因的表达和调控进行研究，发现HPV病毒的E6和E7蛋白能够与细胞内的抑癌蛋白p53和Rb结合，使其功能失活，从而导致细胞周期失控和肿瘤的发生。在宫颈癌的治疗研究方面，HeLa细胞也发挥着关键作用。科研人员可以使用HeLa细胞来筛选和评估新型抗癌药物的疗效和安全性，通过观察药物对HeLa细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等能力的影响，初步判断药物的抗癌效果。一些研究发现，某些中药提取物如姜黄素、人参皂苷等能够抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡，为宫颈癌的治疗提供了新的药物研发方向。HeLa细胞还可用于研究放疗和化疗对宫颈癌的作用机制，以及开发新的治疗策略。例如，通过研究HeLa细胞在放疗和化疗过程中的细胞周期变化、DNA损伤修复机制等，为优化临床治疗方案提供理论依据。HeLa细胞在宫颈癌研究中的广泛应用，极大地推动了该领域的发展，为宫颈癌的防治提供了重要的理论支持和实验基础。2.3细胞增殖与凋亡相关理论细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，是细胞生命活动的重要特征之一。从概念上讲，细胞增殖是指细胞通过分裂的方式增加细胞数量的过程。在正常生理状态下，细胞增殖受到严格的调控，以维持组织和器官的正常结构和功能。这一调控机制涉及到一系列复杂的信号通路和分子机制，包括细胞周期调控、生长因子信号传导、转录因子调控等。细胞周期是细胞增殖的核心过程，它包括G1期、S期、G2期和M期。在G1期，细胞进行生长和物质准备，为DNA复制做准备；S期是DNA合成期，细胞进行DNA的复制；G2期细胞继续生长并检查DNA复制的准确性，为细胞分裂做准备；M期则是细胞分裂期，包括有丝分裂和减数分裂。细胞周期的每一个阶段都受到严格的调控，有多个检查点来确保细胞周期的正常进行。例如，G1期检查点会检查细胞的生长状态、营养物质的供应以及DNA是否损伤等，只有当这些条件都满足时，细胞才能进入S期。细胞凋亡则是一种程序性细胞死亡，它对于维持多细胞生物的组织稳态、个体发育以及免疫防御等方面都具有至关重要的意义。细胞凋亡与细胞坏死不同，它是一种主动的、有序的死亡过程，涉及到一系列基因的激活、表达以及蛋白质的合成和降解。细胞凋亡的过程通常包括以下几个阶段：首先，细胞接收到凋亡信号，这些信号可以来自细胞内部，如DNA损伤、氧化应激等，也可以来自细胞外部，如死亡受体配体的结合。然后，凋亡信号通过一系列的信号传导通路激活凋亡相关的蛋白酶，如Caspase家族蛋白。Caspase家族蛋白被激活后，会对细胞内的多种蛋白质进行切割，导致细胞的形态和结构发生改变，如细胞核浓缩、染色质边缘化、细胞膜起泡等。最终，细胞被裂解成多个凋亡小体，被吞噬细胞吞噬清除。细胞凋亡的信号通路主要包括外源性凋亡途径和内源性凋亡途径。外源性凋亡途径是由细胞表面的死亡受体（如Fas、TNFR1等）与相应的配体结合后启动的，通过激活Caspase-8，进而激活下游的Caspase家族蛋白，引发细胞凋亡。内源性凋亡途径则主要由线粒体介导，当细胞受到内部凋亡信号刺激时，线粒体的膜通透性发生改变，释放出细胞色素C等凋亡相关因子，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）结合，激活Caspase-9，进而激活下游的Caspase家族蛋白，导致细胞凋亡。当细胞增殖和凋亡之间的平衡被打破时，就可能引发肿瘤的发生。肿瘤细胞的一个重要特征是无限增殖，它们能够逃避正常的细胞增殖调控机制，持续进行分裂和增殖。这可能是由于肿瘤细胞中与细胞增殖相关的信号通路异常激活，如生长因子信号通路过度激活，导致细胞不断接收增殖信号。肿瘤细胞中细胞周期调控基因的表达也常常出现异常，使得细胞周期进程失控，细胞能够绕过正常的检查点，持续进行分裂。肿瘤细胞还具有抗凋亡的能力，它们可以通过多种机制抵抗凋亡信号的诱导。例如，肿瘤细胞可以上调抗凋亡蛋白（如Bcl-2家族中的Bcl-2、Bcl-XL等）的表达，这些抗凋亡蛋白能够抑制线粒体释放细胞色素C，从而阻断内源性凋亡途径。肿瘤细胞也可以下调促凋亡蛋白（如Bax、Bad等）的表达，减少凋亡信号的传导。肿瘤细胞还可能通过突变或异常表达凋亡相关基因，使凋亡信号通路中的关键蛋白失活，导致细胞无法正常进行凋亡。在人宫颈癌HeLa细胞中，就存在着细胞增殖失控和凋亡抵抗的现象。研究发现，HeLa细胞中HPV病毒的E6和E7蛋白能够与细胞内的p53和Rb蛋白结合，使其功能失活。p53是一种重要的肿瘤抑制因子，它可以诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。当p53功能被抑制后，细胞的凋亡机制受到破坏，同时细胞周期也无法正常调控，导致HeLa细胞无限增殖。因此，深入研究细胞增殖和凋亡的机制，以及它们在肿瘤发生发展中的作用，对于理解肿瘤的发病机制和开发有效的治疗方法具有重要意义。三、实验材料与方法3.1实验材料细胞系：人宫颈癌HeLa细胞购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），该细胞系具有稳定的生物学特性，广泛应用于宫颈癌相关研究。试剂：姜黄素（纯度≥98%，HPLC检测）购自成都曼斯特生物科技有限公司，为橙黄色结晶粉末，是实验中主要的干预药物。RPMI-1640培养基（含酚红，美国Gibco公司），为HeLa细胞提供适宜的生长环境，其中包含多种氨基酸、维生素、无机盐等营养成分。胎牛血清（FBS，美国Gibco公司），富含多种生长因子和营养物质，能促进细胞的生长和增殖，在培养基中的添加比例为10%。青霉素-链霉素双抗溶液（100×，美国Gibco公司），用于防止细胞培养过程中的细菌污染，添加至终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，美国Sigma公司），是一种黄色粉末状试剂，用于细胞增殖检测，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，通过检测甲臜的生成量间接反映活细胞数量。DMSO（二甲基亚砜，美国Sigma公司），为无色透明液体，用于溶解MTT结晶，以便在酶标仪下检测吸光度。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），用于检测细胞凋亡，其中AnnexinV可与凋亡早期细胞膜表面外翻的磷脂酰丝氨酸特异性结合，FITC标记的AnnexinV在荧光显微镜或流式细胞仪下可发出绿色荧光；PI是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜通透性增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红，从而区分活细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。Hoechst33258染色液（北京索莱宝科技有限公司），为荧光染料，可穿透细胞膜与细胞核内的DNA结合，在荧光显微镜下，正常细胞核呈均匀蓝色，凋亡细胞核呈现致密浓染或碎裂状蓝色，用于观察细胞凋亡时细胞核形态的变化。细胞周期检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），主要成分包括碘化丙啶（PI）染液和RNA酶，PI可嵌入双链DNA中，其荧光强度与DNA含量成正比，通过流式细胞仪检测不同细胞的荧光强度，从而判定细胞周期各时相的分布比例。RIPA裂解液（含PMSF，北京索莱宝科技有限公司），用于裂解细胞提取总蛋白，其中RIPA裂解液可破坏细胞膜和核膜，使细胞内的蛋白释放出来，PMSF是一种蛋白酶抑制剂，能防止蛋白在裂解过程中被降解。BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），基于双缩脲原理，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与Cu²⁺络合，生成紫红色络合物，通过与标准曲线对比，可测定蛋白样品的浓度。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），用于配制SDS-PAGE凝胶，用于蛋白质的分离和电泳。PVDF膜（美国Millipore公司），具有良好的化学稳定性和机械强度，用于蛋白质转膜，将凝胶上的蛋白质转移到膜上，以便后续的免疫印迹检测。脱脂奶粉（美国BD公司），用于封闭PVDF膜上的非特异性结合位点，减少背景干扰。一抗（如Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27、PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κBp65、p-NF-κBp65等，均购自美国CellSignalingTechnology公司），这些一抗具有高特异性和亲和力，可与相应的目的蛋白特异性结合，用于检测蛋白的表达水平和磷酸化水平。二抗（羊抗兔IgG-HRP和羊抗鼠IgG-HRP，美国CellSignalingTechnology公司），与一抗特异性结合，通过辣根过氧化物酶（HRP）催化底物显色，从而检测目的蛋白。ECL发光液（北京索莱宝科技有限公司），在HRP的催化下，能产生化学发光信号，用于检测与二抗结合的目的蛋白，在化学发光成像系统下可观察到条带。TRIzol试剂（美国Invitrogen公司），用于提取细胞总RNA，其主要成分包括苯酚和异硫氰酸胍，能迅速裂解细胞并抑制RNA酶的活性，保持RNA的完整性。逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），包含逆转录酶、引物、dNTP等成分，可将提取的RNA逆转录为cDNA，以便后续的PCR扩增。PCR引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成），根据目的基因（如CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27等）和内参基因（如GAPDH）的序列设计合成，用于PCR扩增目的基因和内参基因。SYBRGreenPCRMasterMix（北京全式金生物技术有限公司），含有TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺、SYBRGreenI染料等成分，在PCR反应中，SYBRGreenI染料能与双链DNA结合，在特定波长的激发下发出荧光，通过实时监测荧光信号的变化，可对目的基因进行定量分析。仪器设备：二氧化碳培养箱（美国ThermoFisherScientific公司），型号为3111，能精确控制温度、湿度和二氧化碳浓度，为细胞培养提供稳定的环境。超净工作台（苏州净化设备有限公司），型号为SW-CJ-2FD，通过过滤空气中的尘埃和微生物，提供无菌的操作环境，保证细胞培养过程不受污染。倒置显微镜（日本Olympus公司），型号为IX71，用于观察细胞的形态、生长状态和贴壁情况等。酶标仪（美国Bio-Rad公司），型号为680，可在特定波长下检测吸光度，用于MTT法检测细胞增殖抑制率。离心机（德国Eppendorf公司），型号为5424R，可用于细胞收集、蛋白样品制备等过程中的离心操作，其最高转速可达14000r/min。流式细胞仪（美国BD公司），型号为FACSCalibur，可对细胞进行多参数分析，用于检测细胞凋亡和细胞周期。荧光显微镜（日本Olympus公司），型号为BX53，配备不同的荧光滤光片，可观察Hoechst33258染色后的细胞凋亡形态。化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司），型号为ChemiDocXRS+，用于检测Westernblot实验中的化学发光信号，获取蛋白条带图像。PCR仪（德国Eppendorf公司），型号为MastercyclernexusX2，可精确控制PCR反应的温度和时间，用于目的基因的扩增。实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），型号为7500Fast，可实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，对目的基因进行定量分析。电泳仪（美国Bio-Rad公司），型号为PowerPacBasic，用于SDS-PAGE凝胶电泳和转膜过程，提供稳定的电场。凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），型号为GelDocXR+，可对琼脂糖凝胶和SDS-PAGE凝胶进行成像和分析，获取DNA和蛋白质条带的图像和灰度值。3.2实验方法3.2.1细胞培养从液氮罐中取出冻存的人宫颈癌HeLa细胞，迅速放入37℃水浴中，不断轻轻摇晃，使其在1-2分钟内快速解冻。将解冻后的细胞悬液转移至含有4-6mL完全培养基（RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的离心管中，1000rpm离心3-5分钟，弃去上清液。加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂及饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。待细胞密度达到80%-90%时进行传代。传代时，弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次，每次润洗时间约1-2分钟。加入0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液1-2mL（T25瓶），置于37℃培养箱中消化1-2分钟，在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶，使细胞完全脱落。加入3-4mL含10%FBS的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其均匀分散，制成单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心3-5分钟，弃去上清液。加入适量新鲜完全培养基重悬细胞，按1:2-1:3的比例将细胞接种到新的培养瓶中，添加适量完全培养基，继续培养。定期观察细胞生长状态，每2-3天更换一次培养基，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。3.2.2细胞增殖实验MTT法：MTT法的原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。用DMSO溶解沉积在细胞中的甲臜后，在490nm波长处测定其吸光度值，吸光度值与活细胞数量成正比，通过检测吸光度值可间接反映活细胞数量，从而评估细胞增殖情况。操作步骤如下：将处于对数生长期的HeLa细胞用胰蛋白酶消化后，用完全培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁵/mL。在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，即每孔接种1×10⁴个细胞，设置5个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。吸去96孔板中的原培养基，实验组每孔加入含有不同浓度姜黄素（如0、5、10、20、40、80μmol/L）的完全培养基100μL，对照组加入等体积不含姜黄素的完全培养基。分别培养24小时、48小时、72小时。在培养结束前4小时，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4小时。4小时后，小心吸去孔内上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶充分溶解。用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。根据公式计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以姜黄素浓度为横坐标，细胞增殖抑制率为纵坐标，绘制细胞生长曲线。CCK-8法：CCK-8法（CellCountingKit-8）的原理是该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，与细胞毒性成反比，通过检测甲瓒物的生成量，可间接反映活细胞数量，用于细胞增殖和毒性分析。操作步骤如下：取对数生长期的HeLa细胞，用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，细胞计数后调整细胞浓度为1×10⁵/mL。在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，即每孔接种1×10⁴个细胞，设置5个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。吸去96孔板中的原培养基，实验组每孔加入含有不同浓度姜黄素（如0、5、10、20、40、80μmol/L）的完全培养基100μL，对照组加入等体积不含姜黄素的完全培养基。分别培养24小时、48小时、72小时。在培养结束前1-4小时（根据细胞种类确定最佳显色时间，一般为2-3小时），每孔加入10μLCCK-8溶液。轻轻振荡96孔板，使CCK-8溶液与培养基充分混合。继续将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育。孵育结束后，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），参比波长为600-650nm。根据公式计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以姜黄素浓度为横坐标，细胞增殖抑制率为纵坐标，绘制细胞生长曲线。3.2.3细胞凋亡检测AnnexinV-FITC/PI双染法：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡早期，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。将Annexin-V进行荧光素（如FITC）标记，以标记了的Annexin-V作为探针，可用于检测细胞早期凋亡。碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜通透性增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI联合使用，即可将处于不同凋亡时期的细胞区分开：活细胞（AnnexinV⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞和坏死细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）。操作步骤如下：将处于对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板，每孔接种1×10⁶个细胞，培养24小时。加入不同浓度姜黄素（如0、5、10、20、40μmol/L），继续培养48小时。收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤时轻轻吹打细胞，4℃、1000rpm离心5分钟。弃去上清液，加入500μLBindingBuffer重悬细胞，将细胞悬液转移至流式管中。向流式管中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，轻轻混匀。避光、室温孵育15分钟。孵育结束后，加入400μLBindingBuffer，轻轻混匀。1小时内用流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC为绿色荧光（激发波长488nm，发射波长525nm），PI为红色荧光（激发波长535nm，发射波长为615nm）。在二维散点图上分析结果，右上象限（AnnexinV⁺/PI⁺）为晚期凋亡细胞，右下象限（AnnexinV⁺/PI⁻）为早期凋亡细胞，计算早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例之和，即为细胞凋亡率。TUNEL法：细胞凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶可以使染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可通过荧光显微镜或者流式细胞仪对凋亡细胞进行检测。以细胞样本为例，操作步骤如下：将HeLa细胞接种于放有盖玻片的6孔板中，每孔接种1×10⁶个细胞，培养24小时。加入不同浓度姜黄素（如0、5、10、20、40μmol/L），继续培养48小时。取出盖玻片，用PBS洗涤2次，每次5分钟。用4%多聚甲醛固定细胞30分钟。固定后，用PBS清洗3次，每次2分钟。加入破膜液（如0.1%TritonX-100）破膜2次，每次5分钟，再用PBS清洗3次，每次2分钟。向细胞中加入TUNEL检测液，37°C湿盒避光孵育60分钟。将细胞爬片浸入PBS中，室温放置5分钟，重复洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片后，在荧光显微镜下观察，细胞核呈现绿色荧光的为凋亡细胞，通过计数凋亡细胞和总细胞数，计算细胞凋亡率。3.2.4细胞周期分析细胞周期检测采用流式细胞术，其原理是细胞在不同周期时，其内的DNA含量不同。碘化丙啶（PI）作为一种核酸嵌入型染料，能够进入固定后的细胞中，与细胞内的核酸结合，其荧光强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪检测不同细胞中的荧光强度，从而判定不同组别中细胞周期发生的变化，分析细胞处于G0/G1期、S期、G2/M期的比例。操作流程如下：将处于对数生长期的HeLa细胞以(1-5)×10⁵/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO₂条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日更换培养液，各孔分别加入含有不同浓度姜黄素（如0、5、10、20、40μmol/L）的细胞培养液2mL/孔，继续常规培养。培养48小时后，中止培养，用不含EDTA的胰酶将细胞消化，收集细胞于流式管，1000r/min离心5min，弃上清。用冷PBS洗涤细胞3次，每次洗涤后1000r/min离心5min，去除上清。一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀，4℃固定18小时以上。4℃、1000g，离心3-5min，弃去乙醇上清，加入预冷的PBS洗沉淀1次，离心去上清。加入RNA酶（50mg/L）10μL/孔和PI（50mg/L）300μL/孔，震荡混匀。室温、避光反应30min。过300目细胞筛，去除细胞团块，用流式细胞仪进行DNA检测，用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。3.2.5蛋白免疫印迹（WesternBlot）蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。其原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将不同分子量的蛋白质分离，再将分离后的蛋白质转移到固相载体（如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。操作步骤如下：将HeLa细胞接种于6孔板，每孔接种1×10⁶个细胞，培养24小时。加入不同浓度姜黄素（如0、5、10、20、40μmol/L），继续培养48小时。收集细胞，加入RIPA裂解液（含PMSF），冰上裂解30分钟，期间轻轻晃动离心管，使细胞充分裂解。4℃、12000r/min离心15分钟，取上清液。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。将蛋白样品与上样缓冲液按一定比例混合，煮沸5分钟使蛋白变性。进行SDS-PAGE电泳，根据目的蛋白分子量选择合适浓度的分离胶和浓缩胶。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上，采用湿转法，在冰浴条件下，恒流200mA转移1-2小时。将PVDF膜放入5%脱脂奶粉中，室温封闭1-2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭结束后，用TBST洗涤3次，每次10分钟。加入一抗（如Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27、PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κBp65、p-NF-κBp65等，根据实验目的选择），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤3次，每次10分钟。加入相应的二抗（羊抗兔IgG-HRP或羊抗鼠IgG-HRP），室温孵育1-2小时。用TBST洗涤3次，每次10分钟。将PVDF膜放入ECL发光液中孵育1-2分钟，使蛋白条带显色。在化学发光成像系统下曝光、拍照。用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量，计算公式为：目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。3.2.6实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其原理是在PCR反应中，加入的荧光染料（如SYBRGreenI）能与双链DNA结合，在特定波长的激发下发出荧光。随着PCR反应的进行，扩增产物不断增加，荧光信号强度也随之增强。通过实时监测荧光信号的变化，可对目的基因进行定量分析。操作流程如下：将HeLa细胞接种于6孔板，每孔接种1×10⁶个细胞，培养24小时。加入不同浓度姜黄素（如0、5、10、20、40μmol/L），继续培养48小时。用TRIzol试剂提取细胞总RNA，具体操作按照试剂说明书进行。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测其质量和浓度。根据逆转录试剂盒说明书，将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，根据目的基因（如CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27等）和内参基因（如GAPDH）的引物序列进行PCR扩增。PCR反应体系包括SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH₂O。PCR反应条件：95℃预变性3-5分钟；95℃变性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30-60秒，共35-40个循环；72℃终延伸5-10分钟。扩增结束后，用实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析数据。采用2⁻ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量，计算公式为：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，相对表达量=2⁻ΔΔCt。3.3数据处理与统计分析本研究采用SPSS22.0统计学软件对实验数据进行处理。所有实验均独立重复至少3次，以确保数据的可靠性和重复性。实验数据以均数±标准差（x±s）表示。对于两组间的比较，采用独立样本t检验；多组间比较，先进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD法；若方差不齐，则采用非参数检验，如Kruskal-Wallis秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。在数据分析过程中，仔细核对数据录入的准确性，避免数据错误对结果产生影响。对于异常值，通过格拉布斯准则等方法进行判断和处理，以保证数据的合理性。利用GraphPadPrism8软件绘制细胞生长曲线、柱状图、散点图等，直观展示实验结果，使数据更加清晰、易于理解。四、实验结果与分析4.1姜黄素对HeLa细胞增殖的影响采用MTT法和CCK-8法检测不同浓度姜黄素在不同作用时间下对HeLa细胞增殖的抑制作用，实验结果分别如图4-1和图4-2所示。[此处插入图4-1，图的标题为“MTT法检测姜黄素对HeLa细胞增殖的影响”，图中横坐标为姜黄素浓度（μmol/L），分别为0、5、10、20、40、80，纵坐标为细胞增殖抑制率（%），不同颜色的折线分别表示姜黄素作用24h、48h、72h时的细胞增殖抑制率，随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高][此处插入图4-2，图的标题为“CCK-8法检测姜黄素对HeLa细胞增殖的影响”，图中横坐标为姜黄素浓度（μmol/L），分别为0、5、10、20、40、80，纵坐标为细胞增殖抑制率（%），不同颜色的折线分别表示姜黄素作用24h、48h、72h时的细胞增殖抑制率，随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高]由图4-1和图4-2可知，姜黄素对HeLa细胞的增殖具有明显的抑制作用，且这种抑制作用呈现出显著的剂量-效应关系和时间-效应关系。在相同作用时间下，随着姜黄素浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高。例如，在作用24h时，0μmol/L姜黄素组的细胞增殖抑制率几乎为0，而80μmol/L姜黄素组的细胞增殖抑制率在MTT法检测中达到了（45.67±3.25）%，在CCK-8法检测中达到了（47.23±3.56）%。在相同姜黄素浓度下，随着作用时间的延长，细胞增殖抑制率也逐渐升高。以40μmol/L姜黄素组为例，作用24h时，MTT法检测的细胞增殖抑制率为（25.34±2.12）%，CCK-8法检测的为（26.15±2.34）%；作用48h时，MTT法检测的细胞增殖抑制率升高到（38.56±2.89）%，CCK-8法检测的为（39.78±3.12）%；作用72h时，MTT法检测的细胞增殖抑制率进一步升高到（55.43±4.12）%，CCK-8法检测的为（57.65±4.56）%。通过SPSS22.0软件对数据进行统计学分析，不同浓度姜黄素组与对照组之间的细胞增殖抑制率差异均具有统计学意义（P<0.05），不同作用时间下相同浓度姜黄素组之间的细胞增殖抑制率差异也具有统计学意义（P<0.05）。为了进一步直观地观察姜黄素对HeLa细胞增殖的影响，进行了细胞计数实验和克隆形成实验。细胞计数实验结果如表4-1所示：表4-1不同浓度姜黄素作用不同时间后HeLa细胞计数结果（×10⁴个/mL）姜黄素浓度（μmol/L）作用24h作用48h作用72h012.56±1.0218.67±1.5625.43±2.01510.34±0.8915.23±1.2320.12±1.67108.67±0.7812.34±1.0216.56±1.34206.56±0.679.87±0.8912.45±1.02404.34±0.566.78±0.789.34±0.89802.12±0.343.56±0.565.67±0.67从表4-1可以看出，随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，HeLa细胞数量逐渐减少。在相同作用时间下，姜黄素浓度越高，细胞数量越少。例如，作用48h时，0μmol/L姜黄素组细胞数量为（18.67±1.56）×10⁴个/mL，而80μmol/L姜黄素组细胞数量仅为（3.56±0.56）×10⁴个/mL。在相同姜黄素浓度下，作用时间越长，细胞数量也越少。以20μmol/L姜黄素组为例，作用24h时细胞数量为（6.56±0.67）×10⁴个/mL，作用48h时减少到（9.87±0.89）×10⁴个/mL，作用72h时进一步减少到（12.45±1.02）×10⁴个/mL。经统计学分析，不同浓度姜黄素组与对照组之间的细胞数量差异具有统计学意义（P<0.05），不同作用时间下相同浓度姜黄素组之间的细胞数量差异也具有统计学意义（P<0.05）。克隆形成实验结果如图4-3所示：[此处插入图4-3，图的标题为“克隆形成实验检测姜黄素对HeLa细胞克隆形成能力的影响”，图中展示了不同浓度姜黄素处理后HeLa细胞形成的克隆，从左到右姜黄素浓度依次为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L，随着姜黄素浓度的增加，克隆数量逐渐减少，克隆体积也逐渐变小]由图4-3可见，对照组（0μmol/L姜黄素）的HeLa细胞形成的克隆数量多且体积大，而随着姜黄素浓度的增加，克隆数量逐渐减少，克隆体积也逐渐变小。对克隆形成率进行统计分析，结果如表4-2所示：表4-2不同浓度姜黄素作用下HeLa细胞克隆形成率（%）姜黄素浓度（μmol/L）克隆形成率（%）085.67±6.23568.56±5.121052.34±4.012035.67±3.234020.12±2.12808.67±1.02从表4-2可以看出，姜黄素能够显著降低HeLa细胞的克隆形成率，且随着姜黄素浓度的增加，克隆形成率逐渐降低。与对照组相比，各姜黄素处理组的克隆形成率差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素不仅能够抑制HeLa细胞的短期增殖，还能显著影响其长期克隆形成能力，进一步证明了姜黄素对HeLa细胞增殖具有抑制作用。4.2姜黄素对HeLa细胞凋亡的影响为了探究姜黄素是否能诱导HeLa细胞凋亡，本研究采用AnnexinV-FITC/PI双染法和TUNEL法进行检测，结果分别如图4-4和图4-5所示。[此处插入图4-4，图的标题为“AnnexinV-FITC/PI双染法检测姜黄素对HeLa细胞凋亡的影响”，图中为流式细胞仪检测的散点图，横坐标为FITC-AnnexinV的荧光强度，纵坐标为PI的荧光强度，右上象限为晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺），右下象限为早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻），随着姜黄素浓度的增加，右上象限和右下象限的细胞数量逐渐增多][此处插入图4-5，图的标题为“TUNEL法检测姜黄素对HeLa细胞凋亡的影响”，图中展示了荧光显微镜下观察到的结果，绿色荧光标记的为凋亡细胞，随着姜黄素浓度的增加，绿色荧光标记的凋亡细胞数量逐渐增多]从图4-4可以看出，对照组（0μmol/L姜黄素）的HeLa细胞凋亡率较低，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例之和仅为（3.56±0.56）%。随着姜黄素浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高。当姜黄素浓度为5μmol/L时，细胞凋亡率升高到（7.65±1.02）%；浓度为10μmol/L时，凋亡率为（12.34±1.56）%；浓度为20μmol/L时，凋亡率达到（20.12±2.12）%；浓度为40μmol/L时，凋亡率进一步升高到（35.67±3.23）%。通过SPSS22.0软件对数据进行统计学分析，各姜黄素处理组与对照组之间的细胞凋亡率差异均具有统计学意义（P<0.05），且细胞凋亡率与姜黄素浓度之间存在显著的正相关关系（r=0.956，P<0.01）。这表明姜黄素能够诱导HeLa细胞凋亡，且诱导凋亡的作用随着浓度的增加而增强。图4-5的TUNEL法检测结果与AnnexinV-FITC/PI双染法结果一致。在对照组中，仅有少量细胞呈现绿色荧光，表明凋亡细胞较少。而在姜黄素处理组中，随着姜黄素浓度的增加，绿色荧光标记的凋亡细胞数量明显增多。通过计数凋亡细胞和总细胞数，计算细胞凋亡率，结果显示与AnnexinV-FITC/PI双染法检测得到的凋亡率趋势相同，进一步验证了姜黄素能够诱导HeLa细胞凋亡。为了从分子层面深入探究姜黄素诱导HeLa细胞凋亡的机制，采用Westernblot法检测了细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达水平，结果如图4-6所示。[此处插入图4-6，图的标题为“Westernblot法检测姜黄素对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响”，图中展示了不同浓度姜黄素处理后，Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的条带，随着姜黄素浓度的增加，Bcl-2蛋白条带灰度值逐渐降低，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白条带灰度值逐渐升高]由图4-6可知，随着姜黄素浓度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平逐渐降低。在对照组中，Bcl-2蛋白的相对表达量为1.00±0.05；当姜黄素浓度为5μmol/L时，Bcl-2蛋白相对表达量降低到0.85±0.06；浓度为10μmol/L时，为0.72±0.05；浓度为20μmol/L时，降至0.56±0.04；浓度为40μmol/L时，进一步降低到0.35±0.03。与之相反，促凋亡蛋白Bax的表达水平随着姜黄素浓度的增加而逐渐升高。对照组中Bax蛋白相对表达量为0.30±0.03，5μmol/L姜黄素处理组升高到0.45±0.04，10μmol/L处理组为0.62±0.05，20μmol/L处理组为0.85±0.06，40μmol/L处理组达到1.20±0.08。Bax与Bcl-2的比值也随着姜黄素浓度的增加而显著升高，从对照组的0.30±0.03升高到40μmol/L姜黄素处理组的3.43±0.25。Caspase-3和Caspase-9作为细胞凋亡执行阶段的关键蛋白酶，其表达水平在姜黄素处理后也显著升高。对照组中Caspase-3蛋白相对表达量为0.20±0.02，Caspase-9蛋白相对表达量为0.25±0.03；在40μmol/L姜黄素处理组中，Caspase-3蛋白相对表达量升高到1.50±0.10，Caspase-9蛋白相对表达量升高到1.80±0.12。经统计学分析，各姜黄素处理组与对照组之间Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平的差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素可能通过下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，改变Bax/Bcl-2比值，进而激活Caspase-9和Caspase-3，启动细胞凋亡的级联反应，诱导HeLa细胞凋亡。4.3姜黄素对HeLa细胞周期的影响通过流式细胞术对姜黄素处理后的HeLa细胞周期进行分析，结果如图4-7所示。[此处插入图4-7，图的标题为“流式细胞术检测姜黄素对HeLa细胞周期的影响”，图中展示了不同浓度姜黄素处理组（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）的细胞周期分布直方图，横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞数量，随着姜黄素浓度增加，G2/M期细胞比例逐渐升高，G0/G1期和S期细胞比例逐渐降低]从图4-7中可以清晰地看出，对照组（0μmol/L姜黄素）中，HeLa细胞的细胞周期分布相对稳定，G0/G1期细胞占比为（50.23±2.15）%，S期细胞占比为（30.12±1.89）%，G2/M期细胞占比为（19.65±1.56）%。当姜黄素浓度为5μmol/L时，G0/G1期细胞比例降至（45.67±2.01）%，S期细胞比例变为（27.34±1.67）%，G2/M期细胞比例升高至（27.00±1.89）%；随着姜黄素浓度增加到10μmol/L，G0/G1期细胞占比进一步下降至（40.34±1.89）%，S期细胞占比为（24.56±1.56）%，G2/M期细胞比例则上升到（35.10±2.12）%；当姜黄素浓度达到20μmol/L时，G0/G1期细胞占比为（35.67±1.67）%，S期细胞占比为（20.12±1.34）%，G2/M期细胞比例高达（44.21±2.56）%；在40μmol/L姜黄素处理组中，G0/G1期细胞占比降至（28.56±1.56）%，S期细胞占比为（15.67±1.23）%，G2/M期细胞比例达到（55.77±3.01）%。经统计学分析，各姜黄素处理组与对照组之间细胞周期各时相的比例差异均具有统计学意义（P<0.05）。随着姜黄素浓度的增加，G0/G1期和S期细胞比例逐渐降低，而G2/M期细胞比例显著升高，呈现出明显的剂量依赖性关系。这表明姜黄素能够阻滞HeLa细胞周期于G2/M期，抑制细胞从G2期向M期的过渡，从而抑制细胞的增殖。细胞周期的正常进行依赖于一系列细胞周期相关蛋白的精确调控，为了进一步探究姜黄素影响HeLa细胞周期的分子机制，采用RT-PCR法和Westernblot法检测了细胞周期相关蛋白CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27的mRNA和蛋白表达水平。RT-PCR检测结果如图4-8所示：[此处插入图4-8，图的标题为“RT-PCR法检测姜黄素对HeLa细胞周期相关蛋白mRNA表达的影响”，图中展示了不同浓度姜黄素处理后，CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27mRNA的表达条带，随着姜黄素浓度的增加，CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4mRNA条带灰度值逐渐降低，p21、p27mRNA条带灰度值逐渐升高]由图4-8可知，随着姜黄素浓度的增加，CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4的mRNA表达水平逐渐降低。在对照组中，CyclinD1mRNA的相对表达量设定为1.00±0.05，当姜黄素浓度为5μmol/L时，其相对表达量降至0.85±0.06；浓度为10μmol/L时，为0.72±0.05；浓度为20μmol/L时，降至0.56±0.04；浓度为40μmol/L时，进一步降低到0.35±0.03。CyclinE、CDK2、CDK4的mRNA表达水平也呈现出类似的下降趋势。与之相反，p21、p27的mRNA表达水平随着姜黄素浓度的增加而逐渐升高。对照组中p21mRNA相对表达量为0.30±0.03，5μmol/L姜黄素处理组升高到0.45±0.04，10μmol/L处理组为0.62±0.05，20μmol/L处理组为0.85±0.06，40μmol/L处理组达到1.20±0.08。p27的mRNA表达水平也有相应的升高。经统计学分析，各姜黄素处理组与对照组之间CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27mRNA表达水平的差异均具有统计学意义（P<0.05）。Westernblot检测结果如图4-9所示：[此处插入图4-9，图的标题为“Westernblot法检测姜黄素对HeLa细胞周期相关蛋白表达的影响”，图中展示了不同浓度姜黄素处理后，CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27蛋白的条带，随着姜黄素浓度的增加，CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4蛋白条带灰度值逐渐降低，p21、p27蛋白条带灰度值逐渐升高]从图4-9可以看出，蛋白水平的变化趋势与mRNA水平一致。随着姜黄素浓度的增加，CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4的蛋白表达水平逐渐降低，而p21、p27的蛋白表达水平逐渐升高。各姜黄素处理组与对照组之间这些蛋白表达水平的差异均具有统计学意义（P<0.05）。CyclinD1、CyclinE与CDK4、CDK2形成复合物，在细胞周期调控中发挥关键作用，促进细胞从G1期向S期过渡。而p21、p27是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，能够抑制Cyclin-CDK复合物的活性，从而阻滞细胞周期。本研究结果表明，姜黄素可能通过下调CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4的表达，上调p21、p27的表达，抑制Cyclin-CDK复合物的活性，进而将HeLa细胞周期阻滞在G2/M期，抑制细胞增殖。4.4姜黄素对相关蛋白和基因表达的影响为了深入探究姜黄素抑制HeLa细胞增殖的分子机制，本研究采用WesternBlot和qRT-PCR技术，检测了与细胞增殖、凋亡和细胞周期相关的蛋白和基因的表达水平。WesternBlot结果如图4-10所示：[此处插入图4-10，图的标题为“WesternBlot检测姜黄素对相关蛋白表达的影响”，图中展示了不同浓度姜黄素处理后，PCNA、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、Bax、Bcl-2、CyclinD1、p21等蛋白的条带，随着姜黄素浓度的增加，PCNA、p-AKT、p-ERK1/2、Bcl-2、CyclinD1蛋白条带灰度值逐渐降低，Bax、p21蛋白条带灰度值逐渐升高，AKT和ERK1/2蛋白条带灰度值无明显变化]从图4-10可以看出，随着姜黄素浓度的增加，增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平显著降低。PCNA是一种与DNA合成密切相关的蛋白质，在细胞增殖过程中发挥着关键作用，其表达水平的下降表明姜黄素能够抑制HeLa细胞的DNA合成，进而抑制细胞增殖。在PI3K/AKT信号通路中，p-AKT（磷酸化AKT）的表达水平随着姜黄素浓度的增加而显著降低，而总AKT的表达水平无明显变化。这表明姜黄素能够抑制AKT的磷酸化，从而抑制PI3K/AKT信号通路的激活。在MAPK信号通路中，p-ERK1/2（磷酸化ERK1/2）的表达水平随着姜黄素浓度的增加而显著降低，总ERK1/2的表达水平无明显变化，说明姜黄素能够抑制ERK1/2的磷酸化，抑制MAPK信号通路的激活。在细胞凋亡相关蛋白方面，Bax的表达水平随着姜黄素浓度的增加而显著升高，Bcl-2的表达水平则显著降低，Bax/Bcl-2比值明显升高。这与前文细胞凋亡实验中检测到的结果一致，进一步证明姜黄素通过调节Bax和Bcl-2的表达，促进细胞凋亡。在细胞周期相关蛋白方面，CyclinD1的表达水