姜黄素诱导人子宫内膜癌细胞(HEC-1-B)凋亡及其机制的研究

姜黄素诱导人子宫内膜癌细胞(HEC-1-B)凋亡及其机制的研究一、研究背景子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，严重威胁女性的健康。目前，其治疗方法主要包括手术、放疗、化疗等，但这些治疗方法存在一定的局限性，如手术创伤大、放化疗副作用明显等。因此，寻找一种高效、低毒的治疗方法具有重要意义。姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的一种酚性色素，是姜黄的主要有效成分。近年来，大量研究表明姜黄素具有广泛的药理活性，如抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂及抗动脉粥样硬化等作用，尤其在抗肿瘤方面表现出良好的前景。它能抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，且毒副作用小，有望成为一种新型的抗肿瘤药物。本研究旨在探讨姜黄素对人子宫内膜癌细胞(HEC-1-B)凋亡的诱导作用及其潜在机制，为子宫内膜癌的治疗提供新的思路和理论依据。二、材料与方法（一）实验材料细胞株：人子宫内膜癌细胞(HEC-1-B)购自中国典型培养物保藏中心。主要试剂：姜黄素（纯度≥98%）购自Sigma公司，用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成100mmol/L的储存液，-20℃保存备用；MTT试剂、DMSO、RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等均购自Gibco公司；Hoechest33258荧光染料购自Beyotime公司；Survivin抗体、caspase-3抗体、β-actin抗体及相应的二抗均购自CellSignalingTechnology公司。主要仪器：CO₂培养箱（ThermoScientific）、倒置显微镜（Olympus）、酶标仪（Bio-Tek）、荧光显微镜（Leica）、蛋白质电泳仪及转膜仪（Bio-Rad）等。（二）实验方法细胞培养：将HEC-1-B细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养。当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验分组：将体外培养的HEC-1-B细胞随机分为5组，即对照组、姜黄素Ⅰ组（10μmol/L）、姜黄素Ⅱ组（20μmol/L）、姜黄素Ⅲ组（40μmol/L）和姜黄素Ⅳ组（80μmol/L）。MTT法检测细胞生长抑制率：将对数生长期的HEC-1-B细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，培养24h后，弃去原培养基，分别加入不同浓度的姜黄素溶液，每组设6个复孔。继续培养48h和72h后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），37℃孵育4h，弃去上清液，加入150μlDMSO，振荡10min，使结晶充分溶解。用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。Hoechest33258荧光染色观察细胞核形态变化：将细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的姜黄素处理48h和72h。弃去培养基，用PBS洗涤2次，加入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗涤3次。加入Hoechest33258荧光染料（1μg/ml），室温避光孵育10min，PBS洗涤3次后，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化并拍照。正常细胞核呈均匀蓝色，凋亡细胞核呈现核固缩、核碎裂、荧光强度增强等特征。Westernblot法检测相关蛋白表达水平：收集经不同浓度姜黄素处理48h和72h的HEC-1-B细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS电泳，将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，分别加入Survivin抗体、caspase-3抗体及β-actin抗体（内参），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，每次10min，加入相应的二抗，室温孵育1h，TBST洗涤3次后，采用化学发光法显影，ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值，以反映蛋白表达水平。（三）统计学分析采用SPSS19.0统计学软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。三、实验结果（一）姜黄素对HEC-1-B细胞增殖的影响MTT实验结果显示，与对照组相比，姜黄素各浓度组细胞的吸光度值均显著降低（P＜0.01），且在10-80μmol/L浓度范围内，随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，细胞生长抑制率逐渐升高，呈明显的时间-剂量依赖性。表明姜黄素能够有效抑制HEC-1-B细胞的体外增殖。（二）姜黄素对HEC-1-B细胞凋亡的影响Hoechest33258荧光染色结果显示，对照组细胞形态规则，细胞核呈均匀蓝色；而姜黄素各浓度组细胞出现明显的凋亡特征，如核固缩、核碎裂、荧光强度增强等，且随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，凋亡细胞数量逐渐增多。这表明姜黄素可诱导人子宫内膜癌HEC-1-B细胞凋亡。（三）姜黄素对HEC-1-B细胞相关蛋白表达的影响Westernblot检测结果显示，与对照组比较，不同浓度的姜黄素作用48h和72h后，HEC-1-B细胞中Survivin蛋白表达水平显著下降，且随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，Survivin蛋白表达逐渐减少，呈时间-剂量依赖性（P＜0.01）。同时，caspase-3蛋白表达水平在姜黄素作用后均较对照组有不同程度的升高，并随姜黄素浓度及作用时间的增加而递增，呈时间-剂量依赖性（P＜0.01）。四、讨论本研究结果表明，姜黄素对体外培养的人HEC-1-B细胞具有明显的抑制作用，且这种抑制作用在一定浓度范围内呈时间-剂量依赖方式。通过Hoechest33258荧光染色观察到姜黄素可诱导HEC-1-B细胞凋亡，进一步探讨其作用机制发现，姜黄素可能通过下调HEC-1-B细胞Survivin蛋白的表达，直接激活caspase-3蛋白，从而诱导细胞凋亡。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成员，其高表达与肿瘤细胞的增殖、凋亡抵抗及不良预后密切相关。在正常组织中，Survivin的表达水平极低，但在多种肿瘤组织中呈高表达状态。本研究中，姜黄素能够显著降低HEC-1-B细胞中Survivin蛋白的表达水平，提示姜黄素可能通过抑制Survivin的表达，打破细胞内凋亡抑制与促进的平衡，从而诱导细胞凋亡。caspase-3是细胞凋亡过程中的关键执行蛋白酶，在凋亡信号的刺激下，caspase-3被激活，进而启动一系列级联反应，导致细胞发生凋亡。本研究结果显示，姜黄素作用后HEC-1-B细胞中caspase-3蛋白表达水平明显升高，表明姜黄素可能通过激活caspase-3蛋白，促进细胞凋亡的发生。综上所述，姜黄素对人子宫内膜癌细胞HEC-1-B具有抑制生长和诱导凋亡的作用，其机制可能与下调Sur