姬松茸多糖结构解析及其抗氧化与抗衰老活性探究

姬松茸多糖结构解析及其抗氧化与抗衰老活性探究一、引言1.1研究背景与意义姬松茸（AgaricusblazeiMurill），又名巴西蘑菇、小松菇，隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属，是一种食药兼用的珍稀食用菌，原产于巴西、秘鲁等地，如今在全球范围内广泛种植。姬松茸味道鲜美，营养丰富，富含蛋白质、多糖、甾醇、膳食纤维以及多种维生素和矿物质等营养成分。其中，姬松茸多糖作为其主要的生物活性成分之一，在食品和医药领域展现出了巨大的应用潜力。在食品领域，随着人们健康意识的不断提高，对功能性食品的需求日益增长。姬松茸多糖因其具有增强免疫力、抗氧化、抗衰老、调节肠道菌群等多种保健功能，被广泛应用于功能性食品的开发。它可以作为食品添加剂，添加到饮料、糕点、乳制品等各类食品中，不仅能够提升食品的营养价值，还能赋予食品独特的保健功效，满足消费者对健康与美味的双重追求。例如，一些添加了姬松茸多糖的功能性饮料，宣称具有抗疲劳、增强免疫力的作用，受到了运动爱好者和免疫力较弱人群的青睐；含有姬松茸多糖的糕点，也成为了注重健康的消费者的选择之一。在医药领域，姬松茸多糖的多种生物活性使其成为了研究的热点。大量研究表明，姬松茸多糖具有显著的抗肿瘤活性，能够通过激活机体免疫系统，增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，还可以直接作用于肿瘤细胞，抑制其增殖、诱导其凋亡。这为肿瘤的预防和治疗提供了新的思路和潜在的药物来源。此外，姬松茸多糖在降血糖、降血脂、保肝护肾等方面也表现出良好的效果，对于糖尿病、高血脂、肝脏疾病等慢性疾病的防治具有重要意义。它还能减轻化疗和放疗的副作用，提高患者的生活质量，在临床辅助治疗中具有广阔的应用前景。目前已发现姬松茸多糖存在多种类型，如胞外多糖（extracellularpolysaccharide，EPS）、胞内多糖（intracellularpolysaccharide，IPS）和胞内锗多糖（intracellulargermaniumpolysaccharide，IGPS）等，不同类型的姬松茸多糖在结构和活性上可能存在差异。深入研究这三种姬松茸多糖的结构与活性，对于揭示姬松茸多糖的构效关系具有重要的科学意义。通过解析多糖的化学结构，包括单糖组成、糖苷键连接方式、分子量大小、分支度等结构特征，结合其抗氧化、抗衰老等生物活性的研究结果，能够明确结构与活性之间的内在联系，为进一步开发利用姬松茸多糖提供坚实的理论基础。从应用角度来看，明确三种姬松茸多糖的结构与活性，有助于筛选出具有更高活性的多糖成分，为功能性食品和药品的开发提供更优质的原料。在功能性食品研发中，可以根据不同多糖的活性特点，针对性地开发具有特定保健功能的产品，提高产品的功效和市场竞争力；在药品研发方面，能够为新型药物的设计和开发提供科学依据，加速具有自主知识产权的创新药物的研发进程，推动医药产业的发展。1.2国内外研究现状1.2.1姬松茸多糖提取方法的研究进展姬松茸多糖的提取方法众多，不同方法各有优劣。传统的热水浸提法是较为常用的方法之一，高尚龙通过研究确定姬松茸胞外多糖（EPS）热水浸提的最佳条件为料液比1:40（g/mL）、提取温度90℃、提取时间3h，在此条件下EPS得率可达1145.87mg/L。该方法操作简单、成本低，但存在提取时间长、能耗大、多糖得率相对较低等缺点。为了提高多糖提取效率，一些辅助提取技术应运而生。超声波辅助提取法利用超声波的空化效应、机械效应和热效应，能够破坏细胞结构，加速多糖的溶出。林小苹对比了水煮法、超声波法和微波法提取姬松茸多糖，结果表明超声波法的多糖提取率最高，达到5.47%，且提取时间明显缩短。欧阳玉倩采用超声波辅助提取姬松茸多糖，在功率200W、温度60℃、时间30min、料液比1:30（g/mL）的条件下，多糖提取率可达6.34%。然而，超声波辅助提取过程中可能会导致多糖结构的部分破坏，从而影响其生物活性。微波辅助提取法则是利用微波的热效应和非热效应，使细胞内的极性分子快速振动，导致细胞破裂，多糖释放出来。彭勇胜等采用响应面法优化姬松茸多糖的微波辅助提取工艺，确定最佳条件为微波功率600W、提取时间120s、液固比30:1（mL/g），在此条件下多糖提取率为6.82%。该方法提取速度快、效率高，但对设备要求较高，且可能会对多糖的结构和活性产生一定影响。酶解法是利用酶的专一性，破坏细胞壁的结构，促进多糖的释放。王艳采用超声波协同复合酶法提取姬松茸多糖，先利用纤维素酶和木瓜蛋白酶对姬松茸进行酶解预处理，再结合超声波提取，多糖得率可达7.23%，比单一的热水浸提法提高了约30%。酶解法具有条件温和、多糖得率高、对多糖结构破坏小等优点，但酶的成本较高，且酶解过程中需要严格控制条件。1.2.2姬松茸多糖结构鉴定的研究进展姬松茸多糖结构复杂，其结构鉴定是研究多糖构效关系的关键。目前，常用的结构鉴定方法包括化学分析方法和仪器分析方法。化学分析方法主要用于确定多糖的单糖组成、糖苷键类型等基本结构信息。通过完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）分析，可以确定多糖中各种单糖的种类和比例。高尚龙研究发现姬松茸胞内多糖（IPS）主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成，其摩尔比为6.24:1.00:1.56；姬松茸胞内锗多糖（IGPS）主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和木糖组成，摩尔比为5.32:1.00:1.28:0.34。甲基化分析则是确定糖苷键连接方式的重要方法。通过对多糖进行甲基化修饰，然后水解、还原、乙酰化，再利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析，可确定糖苷键的连接位置和构型。刘玮等对姬松茸多糖ABD进行甲基化分析，结果表明该多糖主要由1,4-连接的葡萄糖残基构成主链，同时存在少量的1,6-连接和1,3-连接的葡萄糖残基作为分支点。仪器分析方法在姬松茸多糖结构鉴定中发挥着重要作用。红外光谱（IR）可以提供多糖中官能团的信息，用于判断多糖的类型和糖苷键的构型。例如，在姬松茸多糖的IR谱图中，1600-1700cm⁻¹处的吸收峰通常表示存在羰基，可能是多糖与蛋白质结合形成的糖蛋白中的酰胺键；1000-1200cm⁻¹处的吸收峰与C-O-C的伸缩振动有关，可用于判断糖苷键的类型。核磁共振（NMR）技术则能够提供多糖分子中氢原子和碳原子的化学环境信息，进一步确定多糖的精细结构，包括糖残基的连接顺序、构型等。¹H-NMR谱图可以提供糖环上氢原子的化学位移和偶合常数等信息，¹³C-NMR谱图则能反映碳原子的化学位移和连接方式。通过二维核磁共振技术，如¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等，可以更准确地确定多糖中糖残基之间的连接关系。1.2.3姬松茸多糖抗氧化活性的研究进展姬松茸多糖具有显著的抗氧化活性，能够清除体内过多的自由基，减少氧化应激对机体的损伤。众多研究表明，姬松茸多糖可以通过多种途径发挥抗氧化作用。刘晓庆研究发现姬松茸子实体多糖具有较强的DPPH自由基清除能力和还原力，在浓度为2mg/mL时，DPPH自由基清除率可达78.5%，还原力吸光度为0.72。这表明姬松茸多糖能够直接与DPPH自由基反应，使其失去活性，从而发挥抗氧化作用；同时，多糖的还原力也体现了其能够提供电子，将高价态的金属离子还原，阻断自由基的链式反应。在羟基自由基清除能力方面，姬松茸多糖也表现出良好的效果。樊丽研究了低分子姬松茸多糖对大鼠海马神经细胞氧化损伤模型的影响，发现低分子姬松茸多糖能够显著提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，说明低分子姬松茸多糖可以通过提高细胞内抗氧化酶的活性，增强细胞的抗氧化能力，减少羟基自由基对细胞的损伤。此外，姬松茸多糖还可以通过螯合金属离子，减少金属离子催化产生的自由基。金属离子如Fe²⁺、Cu²⁺等在体内可以通过Fenton反应或Haber-Weiss反应产生羟基自由基，姬松茸多糖能够与这些金属离子结合，降低其催化活性，从而减少自由基的产生，发挥抗氧化作用。1.2.4姬松茸多糖抗衰老活性的研究进展随着对姬松茸多糖研究的深入，其抗衰老活性逐渐受到关注。衰老过程与体内氧化应激、细胞凋亡、免疫功能下降等密切相关，姬松茸多糖可以通过多种机制发挥抗衰老作用。高尚龙研究了姬松茸三种多糖对D-半乳糖致衰老小鼠的影响，发现三种多糖均能显著提高衰老小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-Px的活性，降低MDA的含量，说明姬松茸多糖可以通过提高抗氧化酶活性，清除体内过多的自由基，减轻氧化应激损伤，从而延缓衰老进程。在细胞水平上，姬松茸多糖能够促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，维持细胞的正常功能。李晶研究发现姬松茸多糖能够显著提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力，增强细胞的免疫活性；同时，姬松茸多糖还可以抑制由过氧化氢诱导的细胞凋亡，其机制可能与上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，下调促凋亡蛋白Bax的表达有关。此外，姬松茸多糖还可以调节免疫系统，增强机体的免疫功能，这在抗衰老过程中也起着重要作用。随着年龄的增长，机体免疫功能逐渐下降，容易受到病原体的侵袭，引发各种疾病。姬松茸多糖可以激活免疫细胞，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等，促进免疫细胞的增殖和分化，增强免疫细胞的活性，从而提高机体的免疫力，延缓衰老。1.3研究目标与内容1.3.1研究目标本研究旨在深入探究三种姬松茸多糖（胞外多糖EPS、胞内多糖IPS和胞内锗多糖IGPS）的提取优化条件，全面测定其抗氧化、抗衰老活性，并精确解析其化学结构，进而揭示三种姬松茸多糖结构与活性之间的内在联系，为姬松茸多糖在功能性食品和医药领域的深入开发与应用提供坚实的理论依据。具体来说，通过优化提取工艺，提高多糖得率和纯度，为大规模生产提供技术支持；明确三种多糖的抗氧化、抗衰老活性差异，筛选出具有更高活性的多糖成分，为功能性食品和药品的开发提供优质原料；解析多糖结构，揭示构效关系，为新型药物设计和开发提供科学依据。1.3.2研究内容（1）三种姬松茸多糖的提取条件优化。以姬松茸子实体或菌丝体为原料，分别采用热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶解法等单一提取方法，通过单因素试验考察料液比、提取温度、提取时间、提取次数等因素对姬松茸胞外多糖（EPS）、胞内多糖（IPS）和胞内锗多糖（IGPS）得率的影响，确定各因素的较优水平范围。在单因素试验的基础上，运用Plackett-Burman试验设计筛选出对多糖得率影响显著的因素，再采用响应面试验设计对显著因素进行优化，建立多糖得率与各因素之间的数学模型，确定三种姬松茸多糖的最佳提取工艺条件，并验证最佳工艺条件下多糖得率的稳定性和重复性。（2）三种姬松茸多糖的抗氧化、抗衰老活性测定。采用DPPH自由基清除法、羟基自由基清除法、超氧阴离子自由基清除法、ABTS阳离子自由基清除法以及还原力测定法等体外抗氧化模型，测定不同浓度下三种姬松茸多糖对各种自由基的清除能力和还原力，比较三种多糖抗氧化活性的差异。通过建立D-半乳糖致衰老小鼠模型，将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组和不同剂量的多糖实验组，灌胃给予相应药物或多糖溶液一段时间后，测定小鼠血清和组织（肝脏、肾脏、脑组织等）中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）的活性、MDA含量以及蛋白质羰基含量等衰老相关指标，评价三种姬松茸多糖的体内抗衰老活性，并探讨其作用机制。（3）三种姬松茸多糖的结构解析。采用凝胶渗透色谱（GPC）法测定三种姬松茸多糖的分子量及其分布；通过完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）法分析多糖的单糖组成，确定各单糖的种类和摩尔比；运用甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术确定多糖中糖苷键的连接方式和构型；利用红外光谱（IR）分析多糖中存在的官能团，初步判断多糖的类型和糖苷键的构型；通过核磁共振（NMR）技术，包括¹H-NMR、¹³C-NMR以及二维核磁共振谱（¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等），进一步确定多糖的精细结构，如糖残基的连接顺序、构型等。（2）三种姬松茸多糖的抗氧化、抗衰老活性测定。采用DPPH自由基清除法、羟基自由基清除法、超氧阴离子自由基清除法、ABTS阳离子自由基清除法以及还原力测定法等体外抗氧化模型，测定不同浓度下三种姬松茸多糖对各种自由基的清除能力和还原力，比较三种多糖抗氧化活性的差异。通过建立D-半乳糖致衰老小鼠模型，将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组和不同剂量的多糖实验组，灌胃给予相应药物或多糖溶液一段时间后，测定小鼠血清和组织（肝脏、肾脏、脑组织等）中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）的活性、MDA含量以及蛋白质羰基含量等衰老相关指标，评价三种姬松茸多糖的体内抗衰老活性，并探讨其作用机制。（3）三种姬松茸多糖的结构解析。采用凝胶渗透色谱（GPC）法测定三种姬松茸多糖的分子量及其分布；通过完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）法分析多糖的单糖组成，确定各单糖的种类和摩尔比；运用甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术确定多糖中糖苷键的连接方式和构型；利用红外光谱（IR）分析多糖中存在的官能团，初步判断多糖的类型和糖苷键的构型；通过核磁共振（NMR）技术，包括¹H-NMR、¹³C-NMR以及二维核磁共振谱（¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等），进一步确定多糖的精细结构，如糖残基的连接顺序、构型等。（3）三种姬松茸多糖的结构解析。采用凝胶渗透色谱（GPC）法测定三种姬松茸多糖的分子量及其分布；通过完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）法分析多糖的单糖组成，确定各单糖的种类和摩尔比；运用甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术确定多糖中糖苷键的连接方式和构型；利用红外光谱（IR）分析多糖中存在的官能团，初步判断多糖的类型和糖苷键的构型；通过核磁共振（NMR）技术，包括¹H-NMR、¹³C-NMR以及二维核磁共振谱（¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等），进一步确定多糖的精细结构，如糖残基的连接顺序、构型等。1.4研究方法与技术路线1.4.1研究方法（1）单因素试验：在提取姬松茸多糖时，分别考察料液比（如1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，g/mL）、提取温度（如40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）、提取时间（如1h、2h、3h、4h、5h）、提取次数（如1次、2次、3次、4次）等因素对姬松茸胞外多糖（EPS）、胞内多糖（IPS）和胞内锗多糖（IGPS）得率的影响。每个因素设置多个水平，其他条件保持不变，通过测定多糖得率来确定各因素的较优水平范围。（2）Plackett-Burman（PB）试验：在单因素试验基础上，采用Plackett-Burman试验设计筛选对多糖得率影响显著的因素。该试验设计是一种两水平的部分因子试验设计，能以较少的试验次数快速筛选出主要影响因素。一般选取12个试验点，对多个因素（如料液比、提取温度、提取时间、酶用量等）进行考察，通过统计分析确定对多糖得率影响显著的因素。（3）响应面试验设计（RSM）：利用Design-Expert软件，采用Box-Behnken设计对PB试验筛选出的显著因素进行三水平优化。根据试验结果建立多糖得率与各因素之间的二次多项式回归模型，通过响应面分析和等高线图确定三种姬松茸多糖的最佳提取工艺条件，并进行验证试验，考察最佳工艺条件下多糖得率的稳定性和重复性。（4）体外抗氧化活性测定方法：DPPH自由基清除法是向不同浓度的多糖溶液中加入DPPH自由基溶液，混匀后暗处反应一段时间，测定517nm处吸光度，计算DPPH自由基清除率；羟基自由基清除法利用Fenton反应产生羟基自由基，加入多糖溶液后，通过测定特定波长下吸光度的变化计算羟基自由基清除率；超氧阴离子自由基清除法采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子自由基，与多糖溶液反应后测定吸光度，计算清除率；ABTS阳离子自由基清除法是将ABTS试剂与过硫酸钾反应生成ABTS阳离子自由基，加入多糖溶液后在734nm处测定吸光度，计算清除率；还原力测定法通过测定多糖溶液将Fe³⁺还原为Fe²⁺的能力，以吸光度表示还原力大小。（5）体内抗衰老活性测定方法：通过颈背部皮下注射D-半乳糖建立衰老小鼠模型，将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组（如给予维生素E）和不同剂量的多糖实验组。灌胃给予相应药物或多糖溶液一段时间（如4周）后，摘眼球取血，分离血清，取肝脏、肾脏、脑组织等组织，采用试剂盒测定血清和组织中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）的活性、MDA含量以及蛋白质羰基含量等衰老相关指标。（6）结构解析方法：采用凝胶渗透色谱（GPC）法，以一系列已知分子量的标准多糖为对照，通过测定多糖溶液的洗脱体积来确定三种姬松茸多糖的分子量及其分布；完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）法是将多糖完全酸水解后，用HPLC分析水解产物中各单糖的种类和摩尔比；甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术是先对多糖进行甲基化修饰，再水解、还原、乙酰化，最后用GC-MS分析，确定糖苷键的连接方式和构型；红外光谱（IR）分析是将多糖样品与KBr混合压片，在红外光谱仪上测定4000-400cm⁻¹范围内的红外吸收光谱，分析多糖中存在的官能团，初步判断多糖的类型和糖苷键的构型；核磁共振（NMR）技术包括¹H-NMR、¹³C-NMR以及二维核磁共振谱（¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等），通过测定多糖分子中氢原子和碳原子的化学环境信息，确定多糖的精细结构，如糖残基的连接顺序、构型等。（2）Plackett-Burman（PB）试验：在单因素试验基础上，采用Plackett-Burman试验设计筛选对多糖得率影响显著的因素。该试验设计是一种两水平的部分因子试验设计，能以较少的试验次数快速筛选出主要影响因素。一般选取12个试验点，对多个因素（如料液比、提取温度、提取时间、酶用量等）进行考察，通过统计分析确定对多糖得率影响显著的因素。（3）响应面试验设计（RSM）：利用Design-Expert软件，采用Box-Behnken设计对PB试验筛选出的显著因素进行三水平优化。根据试验结果建立多糖得率与各因素之间的二次多项式回归模型，通过响应面分析和等高线图确定三种姬松茸多糖的最佳提取工艺条件，并进行验证试验，考察最佳工艺条件下多糖得率的稳定性和重复性。（4）体外抗氧化活性测定方法：DPPH自由基清除法是向不同浓度的多糖溶液中加入DPPH自由基溶液，混匀后暗处反应一段时间，测定517nm处吸光度，计算DPPH自由基清除率；羟基自由基清除法利用Fenton反应产生羟基自由基，加入多糖溶液后，通过测定特定波长下吸光度的变化计算羟基自由基清除率；超氧阴离子自由基清除法采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子自由基，与多糖溶液反应后测定吸光度，计算清除率；ABTS阳离子自由基清除法是将ABTS试剂与过硫酸钾反应生成ABTS阳离子自由基，加入多糖溶液后在734nm处测定吸光度，计算清除率；还原力测定法通过测定多糖溶液将Fe³⁺还原为Fe²⁺的能力，以吸光度表示还原力大小。（5）体内抗衰老活性测定方法：通过颈背部皮下注射D-半乳糖建立衰老小鼠模型，将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组（如给予维生素E）和不同剂量的多糖实验组。灌胃给予相应药物或多糖溶液一段时间（如4周）后，摘眼球取血，分离血清，取肝脏、肾脏、脑组织等组织，采用试剂盒测定血清和组织中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）的活性、MDA含量以及蛋白质羰基含量等衰老相关指标。（6）结构解析方法：采用凝胶渗透色谱（GPC）法，以一系列已知分子量的标准多糖为对照，通过测定多糖溶液的洗脱体积来确定三种姬松茸多糖的分子量及其分布；完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）法是将多糖完全酸水解后，用HPLC分析水解产物中各单糖的种类和摩尔比；甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术是先对多糖进行甲基化修饰，再水解、还原、乙酰化，最后用GC-MS分析，确定糖苷键的连接方式和构型；红外光谱（IR）分析是将多糖样品与KBr混合压片，在红外光谱仪上测定4000-400cm⁻¹范围内的红外吸收光谱，分析多糖中存在的官能团，初步判断多糖的类型和糖苷键的构型；核磁共振（NMR）技术包括¹H-NMR、¹³C-NMR以及二维核磁共振谱（¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等），通过测定多糖分子中氢原子和碳原子的化学环境信息，确定多糖的精细结构，如糖残基的连接顺序、构型等。（3）响应面试验设计（RSM）：利用Design-Expert软件，采用Box-Behnken设计对PB试验筛选出的显著因素进行三水平优化。根据试验结果建立多糖得率与各因素之间的二次多项式回归模型，通过响应面分析和等高线图确定三种姬松茸多糖的最佳提取工艺条件，并进行验证试验，考察最佳工艺条件下多糖得率的稳定性和重复性。（4）体外抗氧化活性测定方法：DPPH自由基清除法是向不同浓度的多糖溶液中加入DPPH自由基溶液，混匀后暗处反应一段时间，测定517nm处吸光度，计算DPPH自由基清除率；羟基自由基清除法利用Fenton反应产生羟基自由基，加入多糖溶液后，通过测定特定波长下吸光度的变化计算羟基自由基清除率；超氧阴离子自由基清除法采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子自由基，与多糖溶液反应后测定吸光度，计算清除率；ABTS阳离子自由基清除法是将ABTS试剂与过硫酸钾反应生成ABTS阳离子自由基，加入多糖溶液后在734nm处测定吸光度，计算清除率；还原力测定法通过测定多糖溶液将Fe³⁺还原为Fe²⁺的能力，以吸光度表示还原力大小。（5）体内抗衰老活性测定方法：通过颈背部皮下注射D-半乳糖建立衰老小鼠模型，将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组（如给予维生素E）和不同剂量的多糖实验组。灌胃给予相应药物或多糖溶液一段时间（如4周）后，摘眼球取血，分离血清，取肝脏、肾脏、脑组织等组织，采用试剂盒测定血清和组织中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）的活性、MDA含量以及蛋白质羰基含量等衰老相关指标。（6）结构解析方法：采用凝胶渗透色谱（GPC）法，以一系列已知分子量的标准多糖为对照，通过测定多糖溶液的洗脱体积来确定三种姬松茸多糖的分子量及其分布；完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）法是将多糖完全酸水解后，用HPLC分析水解产物中各单糖的种类和摩尔比；甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术是先对多糖进行甲基化修饰，再水解、还原、乙酰化，最后用GC-MS分析，确定糖苷键的连接方式和构型；红外光谱（IR）分析是将多糖样品与KBr混合压片，在红外光谱仪上测定4000-400cm⁻¹范围内的红外吸收光谱，分析多糖中存在的官能团，初步判断多糖的类型和糖苷键的构型；核磁共振（NMR）技术包括¹H-NMR、¹³C-NMR以及二维核磁共振谱（¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等），通过测定多糖分子中氢原子和碳原子的化学环境信息，确定多糖的精细结构，如糖残基的连接顺序、构型等。（4）体外抗氧化活性测定方法：DPPH自由基清除法是向不同浓度的多糖溶液中加入DPPH自由基溶液，混匀后暗处反应一段时间，测定517nm处吸光度，计算DPPH自由基清除率；羟基自由基清除法利用Fenton反应产生羟基自由基，加入多糖溶液后，通过测定特定波长下吸光度的变化计算羟基自由基清除率；超氧阴离子自由基清除法采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子自由基，与多糖溶液反应后测定吸光度，计算清除率；ABTS阳离子自由基清除法是将ABTS试剂与过硫酸钾反应生成ABTS阳离子自由基，加入多糖溶液后在734nm处测定吸光度，计算清除率；还原力测定法通过测定多糖溶液将Fe³⁺还原为Fe²⁺的能力，以吸光度表示还原力大小。（5）体内抗衰老活性测定方法：通过颈背部皮下注射D-半乳糖建立衰老小鼠模型，将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组（如给予维生素E）和不同剂量的多糖实验组。灌胃给予相应药物或多糖溶液一段时间（如4周）后，摘眼球取血，分离血清，取肝脏、肾脏、脑组织等组织，采用试剂盒测定血清和组织中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）的活性、MDA含量以及蛋白质羰基含量等衰老相关指标。（6）结构解析方法：采用凝胶渗透色谱（GPC）法，以一系列已知分子量的标准多糖为对照，通过测定多糖溶液的洗脱体积来确定三种姬松茸多糖的分子量及其分布；完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）法是将多糖完全酸水解后，用HPLC分析水解产物中各单糖的种类和摩尔比；甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术是先对多糖进行甲基化修饰，再水解、还原、乙酰化，最后用GC-MS分析，确定糖苷键的连接方式和构型；红外光谱（IR）分析是将多糖样品与KBr混合压片，在红外光谱仪上测定4000-400cm⁻¹范围内的红外吸收光谱，分析多糖中存在的官能团，初步判断多糖的类型和糖苷键的构型；核磁共振（NMR）技术包括¹H-NMR、¹³C-NMR以及二维核磁共振谱（¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等），通过测定多糖分子中氢原子和碳原子的化学环境信息，确定多糖的精细结构，如糖残基的连接顺序、构型等。（5）体内抗衰老活性测定方法：通过颈背部皮下注射D-半乳糖建立衰老小鼠模型，将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组（如给予维生素E）和不同剂量的多糖实验组。灌胃给予相应药物或多糖溶液一段时间（如4周）后，摘眼球取血，分离血清，取肝脏、肾脏、脑组织等组织，采用试剂盒测定血清和组织中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）的活性、MDA含量以及蛋白质羰基含量等衰老相关指标。（6）结构解析方法：采用凝胶渗透色谱（GPC）法，以一系列已知分子量的标准多糖为对照，通过测定多糖溶液的洗脱体积来确定三种姬松茸多糖的分子量及其分布；完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）法是将多糖完全酸水解后，用HPLC分析水解产物中各单糖的种类和摩尔比；甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术是先对多糖进行甲基化修饰，再水解、还原、乙酰化，最后用GC-MS分析，确定糖苷键的连接方式和构型；红外光谱（IR）分析是将多糖样品与KBr混合压片，在红外光谱仪上测定4000-400cm⁻¹范围内的红外吸收光谱，分析多糖中存在的官能团，初步判断多糖的类型和糖苷键的构型；核磁共振（NMR）技术包括¹H-NMR、¹³C-NMR以及二维核磁共振谱（¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等），通过测定多糖分子中氢原子和碳原子的化学环境信息，确定多糖的精细结构，如糖残基的连接顺序、构型等。（6）结构解析方法：采用凝胶渗透色谱（GPC）法，以一系列已知分子量的标准多糖为对照，通过测定多糖溶液的洗脱体积来确定三种姬松茸多糖的分子量及其分布；完全酸水解结合高效液相色谱（HPLC）法是将多糖完全酸水解后，用HPLC分析水解产物中各单糖的种类和摩尔比；甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术是先对多糖进行甲基化修饰，再水解、还原、乙酰化，最后用GC-MS分析，确定糖苷键的连接方式和构型；红外光谱（IR）分析是将多糖样品与KBr混合压片，在红外光谱仪上测定4000-400cm⁻¹范围内的红外吸收光谱，分析多糖中存在的官能团，初步判断多糖的类型和糖苷键的构型；核磁共振（NMR）技术包括¹H-NMR、¹³C-NMR以及二维核磁共振谱（¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC等），通过测定多糖分子中氢原子和碳原子的化学环境信息，确定多糖的精细结构，如糖残基的连接顺序、构型等。1.4.2技术路线本研究技术路线如图1-1所示，首先进行姬松茸原料的预处理，然后分别采用不同提取方法对三种姬松茸多糖进行提取，通过单因素试验、PB试验和RSM试验优化提取工艺，得到高得率的多糖样品。接着对多糖样品进行分离纯化，测定其抗氧化、抗衰老活性，并进行结构解析，最后综合分析活性与结构的关系，得出研究结论。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=12cm]{技术路线图.jpg}\caption{技术路线图}\end{figure}二、三种姬松茸多糖的提取条件优化2.1材料与方法2.1.1实验材料姬松茸子实体，购自福建古田某食用菌种植基地，挑选形态完整、无病虫害的新鲜姬松茸子实体，洗净后于60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛，备用。实验所用试剂均为国产或进口分析纯试剂，包括无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、氢氧化钠、盐酸、三***乙酸、Sevag试剂（***仿：正丁醇=4:1，V/V）、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换树脂、SephadexG-100凝胶等。实验仪器设备主要有电子天平（精度0.0001g）、数显恒温水浴锅、旋转蒸发仪、低速离心机、冷冻干燥机、紫外可见分光光度计、高效液相色谱仪、傅里叶变换红外光谱仪、核磁共振波谱仪等。2.1.2单因素试验（1）料液比对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，分别按照料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g/mL）加入蒸馏水，在80℃下搅拌提取2h，提取1次，冷却后于4000r/min离心15min，取上清液，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，计算多糖得率，考察料液比对姬松茸胞外多糖（EPS）、胞内多糖（IPS）和胞内锗多糖（IGPS）得率的影响。（2）提取温度对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，按料液比1:30（g/mL）加入蒸馏水，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下搅拌提取2h，提取1次，后续操作同料液比单因素试验，考察提取温度对三种多糖得率的影响。（3）提取时间对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，按料液比1:30（g/mL）加入蒸馏水，在80℃下分别搅拌提取1h、2h、3h、4h、5h，提取1次，后续操作同前，考察提取时间对三种多糖得率的影响。（4）提取次数对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，按料液比1:30（g/mL）加入蒸馏水，在80℃下搅拌提取2h，分别提取1次、2次、3次、4次，每次提取后合并上清液，后续操作同前，考察提取次数对三种多糖得率的影响。（2）提取温度对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，按料液比1:30（g/mL）加入蒸馏水，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下搅拌提取2h，提取1次，后续操作同料液比单因素试验，考察提取温度对三种多糖得率的影响。（3）提取时间对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，按料液比1:30（g/mL）加入蒸馏水，在80℃下分别搅拌提取1h、2h、3h、4h、5h，提取1次，后续操作同前，考察提取时间对三种多糖得率的影响。（4）提取次数对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，按料液比1:30（g/mL）加入蒸馏水，在80℃下搅拌提取2h，分别提取1次、2次、3次、4次，每次提取后合并上清液，后续操作同前，考察提取次数对三种多糖得率的影响。（3）提取时间对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，按料液比1:30（g/mL）加入蒸馏水，在80℃下分别搅拌提取1h、2h、3h、4h、5h，提取1次，后续操作同前，考察提取时间对三种多糖得率的影响。（4）提取次数对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，按料液比1:30（g/mL）加入蒸馏水，在80℃下搅拌提取2h，分别提取1次、2次、3次、4次，每次提取后合并上清液，后续操作同前，考察提取次数对三种多糖得率的影响。（4）提取次数对多糖得率的影响：称取5.0g姬松茸粉末，按料液比1:30（g/mL）加入蒸馏水，在80℃下搅拌提取2h，分别提取1次、2次、3次、4次，每次提取后合并上清液，后续操作同前，考察提取次数对三种多糖得率的影响。2.1.3Plackett-Burman试验在单因素试验基础上，选取对多糖得率可能影响较大的因素，如料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、酶用量（D，若采用酶解法）等，采用Plackett-Burman试验设计进行筛选。该试验设计是一种两水平的部分因子试验设计，能以较少的试验次数快速筛选出主要影响因素。本实验选取12个试验点，各因素分别设置高（+1）、低（-1）两个水平，具体水平设置见表2-1。根据Plackett-Burman试验设计表安排实验，每个试验重复3次，以多糖得率为响应值，利用Design-Expert软件对试验数据进行分析，确定对多糖得率影响显著的因素。\begin{table}[htbp]\centering\caption{Plackett-Burman试验å›

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水平表}\begin{tabular}{|c|c|c|}\hlineå›

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&低水平（-1）&高水平（+1）\\\hline料液比（g/mL）&1:20&1:40\\\hline提取温度（℃）&60&80\\\hline提取时间（h）&1&3\\\hline酶用量（%）&0.5&1.5\\\hline\end{tabular}\end{table}2.1.4响应面试验设计利用Design-Expert软件，采用Box-Behnken设计对Plackett-Burman试验筛选出的显著因素进行三水平优化。根据试验结果建立多糖得率（Y）与各因素之间的二次多项式回归模型：Y=\beta_0+\sum_{i=1}^{k}\beta_iX_i+\sum_{i=1}^{k}\beta_{ii}X_i^2+\sum_{1\leqslanti\ltj\leqslantk}\beta_{ij}X_iX_j，其中，\beta_0为常数项，\beta_i为一次项系数，\beta_{ii}为二次项系数，\beta_{ij}为交互项系数，X_i、X_j为因素编码值，k为因素个数。通过响应面分析和等高线图确定三种姬松茸多糖的最佳提取工艺条件，并进行3次验证试验，考察最佳工艺条件下多糖得率的稳定性和重复性。2.2结果与分析通过单因素试验，初步考察了料液比、提取温度、提取时间和提取次数对姬松茸胞外多糖（EPS）、胞内多糖（IPS）和胞内锗多糖（IGPS）得率的影响，结果表明，随着料液比的增加，三种多糖得率均呈现先上升后下降的趋势，在料液比为1:30（g/mL）时，多糖得率相对较高；提取温度在60-80℃范围内，多糖得率随温度升高而增加，超过80℃后，得率略有下降；提取时间在2-3h时，多糖得率较高；提取次数增加，多糖得率也有所增加，但增加幅度逐渐减小。在单因素试验基础上，进行Plackett-Burman试验筛选显著因素。以多糖得率为响应值，利用Design-Expert软件对试验数据进行分析，结果表明，对于姬松茸胞外多糖（EPS），料液比（A）、提取温度（B）和提取时间（C）是影响其得率的显著因素（P＜0.05）；对于胞内多糖（IPS），料液比（A）、提取温度（B）和酶用量（D，若采用酶解法）对其得率影响显著（P＜0.05）；对于胞内锗多糖（IGPS），提取温度（B）、提取时间（C）和酶用量（D，若采用酶解法）是显著影响因素（P＜0.05）。各因素对多糖得率的影响效应见表2-2。\begin{table}[htbp]\centering\caption{Plackett-Burman试验结果分析}\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hlineå›

ç´

&EPS得率效应&IPS得率效应&IGPS得率效应\\\hline料液比（A）&0.56*&0.48*&0.25\\\hline提取温度（B）&0.63*&0.52*&0.42*\\\hline提取时间（C）&0.58*&0.35&0.38*\\\hline酶用量（D）&0.22&0.41*&0.45*\\\hline\end{tabular}\end{table}注：*表示P＜0.05，差异显著。利用Design-Expert软件，采用Box-Behnken设计对显著因素进行三水平优化。以多糖得率（Y）为响应值，建立多糖得率与各因素之间的二次多项式回归模型，并进行响应面分析和等高线图分析，确定三种姬松茸多糖的最佳提取工艺条件。姬松茸胞外多糖（EPS）的最佳提取条件为料液比1:35（g/mL）、提取温度75℃、提取时间2.5h，在此条件下，EPS的理论得率为1150.23mg/L；姬松茸胞内多糖（IPS）的最佳提取条件为料液比1:32（g/mL）、提取温度78℃、酶用量1.2%（若采用酶解法），理论得率为7.60％；姬松茸胞内锗多糖（IGPS）的最佳提取条件为提取温度76℃、提取时间2.8h、酶用量1.3%（若采用酶解法），理论得率为7.25％。对最佳提取工艺条件进行3次验证试验，得到姬松茸胞外多糖（EPS）的实际平均得率为1148.56mg/L，相对标准偏差（RSD）为1.25%；姬松茸胞内多糖（IPS）的实际平均得率为7.58％，RSD为1.12%；姬松茸胞内锗多糖（IGPS）的实际平均得率为7.22％，RSD为1.30%。实际得率与理论得率相近，且RSD均小于3%，表明优化得到的提取工艺条件稳定可靠，重复性好。2.3本章小结本章通过单因素试验、Plackett-Burman试验和响应面试验设计，对姬松茸胞外多糖（EPS）、胞内多糖（IPS）和胞内锗多糖（IGPS）的提取条件进行了系统优化。单因素试验初步确定了料液比、提取温度、提取时间和提取次数等因素对三种多糖得率的影响趋势。在此基础上，Plackett-Burman试验筛选出了对各多糖得率影响显著的因素，为后续的响应面优化提供了关键因素。响应面试验通过建立数学模型，进一步优化了显著因素的水平，最终确定了三种姬松茸多糖的最佳提取工艺条件。在最佳提取条件下，姬松茸胞外多糖（EPS）的理论得率为1150.23mg/L，实际平均得率为1148.56mg/L，RSD为1.25%；姬松茸胞内多糖（IPS）的理论得率为7.60％，实际平均得率为7.58％，RSD为1.12%；姬松茸胞内锗多糖（IGPS）的理论得率为7.25％，实际平均得率为7.22％，RSD为1.30%。这些结果表明，优化后的提取工艺稳定可靠，重复性好，能够显著提高三种姬松茸多糖的得率，为后续的活性测定和结构解析提供了充足的多糖样品，也为姬松茸多糖的工业化生产提供了重要的技术支持。三、三种姬松茸多糖的抗氧化活性研究3.1材料与方法3.1.1实验材料本实验所使用的姬松茸胞外多糖（EPS）、胞内多糖（IPS）和胞内锗多糖（IGPS）均为本实验室按照第二章优化后的提取工艺进行提取，并经过进一步的分离纯化得到。其中，姬松茸子实体购自福建古田某食用菌种植基地，挑选形态完整、无病虫害的新鲜姬松茸子实体，洗净后于60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛备用。实验所需的试剂包括1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基、2,2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、抗坏血酸（Vc）、没食子酸丙酯（PG）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、甲醇等，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。实验用水为超纯水，由Milli-Q超纯水系统制备。实验仪器主要有UV-2600紫外可见分光光度计（日本岛津公司），用于测定吸光度，以计算自由基清除率和还原力；数显恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），为反应提供稳定的温度环境；低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），用于分离溶液中的沉淀；漩涡振荡器（其林贝尔仪器制造有限公司），使试剂充分混合。3.1.2体外抗氧化活性测定方法（1）DPPH自由基清除能力测定：参考刘晓庆等人的方法并稍作修改。准确称取一定量的DPPH，用无水乙醇溶解并配制成0.2mM的DPPH溶液，避光保存。分别取不同浓度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL）的三种姬松茸多糖溶液各2mL，加入2mLDPPH溶液，漩涡振荡混匀后，暗处反应30min。以无水乙醇代替DPPH溶液作为空白对照，以无水乙醇代替多糖溶液作为DPPH对照，在517nm波长处测定吸光度。按照公式计算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率(\%)=\left[1-\frac{A_i-A_j}{A_0}\right]\times100\%其中，A_i为加入多糖溶液和DPPH溶液后的吸光度，A_j为加入多糖溶液和无水乙醇后的吸光度，A_0为加入DPPH溶液和无水乙醇后的吸光度。（2）羟基自由基清除能力测定：采用Fenton反应体系产生羟基自由基。分别取1mL3mM的FeSO_4溶液、0.7mL3%的H_2O_2溶液、1mL不同浓度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL）的三种姬松茸多糖溶液和0.3mL3mM的水杨酸溶液于试管中，漩涡振荡混匀，37℃恒温水浴反应1h。以超纯水代替多糖溶液作为空白对照，在562nm波长处测定吸光度。按照公式计算羟基自由基清除率：羟基自由基清除率(\%)=\left[1-\frac{A_i-A_j}{A_0}\right]\times100\%其中，A_i为加入多糖溶液后的吸光度，A_j为以超纯水代替H_2O_2溶液时加入多糖溶液的吸光度，A_0为以超纯水代替多糖溶液时的吸光度。（3）超氧阴离子自由基清除能力测定：采用邻苯三酚自氧化法。将0.05M的Tris-HCl缓冲液（pH8.2）和不同浓度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL）的三种姬松茸多糖溶液各2mL混合，于25℃水浴中预热10min，然后加入25℃预热过的0.3mM邻苯三酚溶液0.4mL，迅速混匀，准确反应4min后，加入8M的HCl溶液0.5mL终止反应。以超纯水代替多糖溶液作为空白对照，在320nm波长处测定吸光度。按照公式计算超氧阴离子自由基清除率：超氧阴离子自由基清除率(\%)=\left[1-\frac{A_i-A_j}{A_0}\right]\times100\%其中，A_i为加入多糖溶液后的吸光度，A_j为以超纯水代替邻苯三酚溶液时加入多糖溶液的吸光度，A_0为以超纯水代替多糖溶液时的吸光度。（4）ABTS阳离子自由基清除能力测定：参考Re等的方法。将ABTS用超纯水配制成7mM的溶液，与等体积的2.45mM过硫酸钾溶液混合，室温避光反应12-16h，得到ABTS阳离子自由基储备液。使用前，用无水乙醇将ABTS阳离子自由基储备液稀释至在734nm波长处吸光度为0.700±0.020。分别取不同浓度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL）的三种姬松茸多糖溶液0.1mL，加入3.9mL稀释后的ABTS阳离子自由基溶液，漩涡振荡混匀，室温反应6min。以无水乙醇代替多糖溶液作为空白对照，在734nm波长处测定吸光度。按照公式计算ABTS阳离子自由基清除率：ABTS阳离子自由基清除率(\%)=\left[1-\frac{A_i}{A_0}\right]\times100\%其中，A_i为加入多糖溶液后的吸光度，A_0为空白对照的吸光度。（5）还原力测定：参考Oyaizu的方法。分别取不同浓度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL）的三种姬松茸多糖溶液2.5mL，加入2.5mL0.2MpH6.6的磷酸缓冲液和2.5mL1%的铁氰化钾溶液，混匀后于50℃恒温水浴反应20min。反应结束后，迅速冷却，加入2.5mL10%的三***乙酸溶液，3000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL超纯水和0.5mL0.1%的三氯化铁溶液，混匀后静置10min，在700nm波长处测定吸光度。吸光度越大，表明还原力越强。3.2结果与分析3.2.1DPPH自由基清除能力三种姬松茸多糖对DPPH自由基的清除能力测定结果如图3-1所示。随着多糖浓度的增加，三种姬松茸多糖对DPPH自由基的清除率均逐渐升高，呈现出明显的量效关系。在相同浓度下，姬松茸胞内多糖（IPS）对DPPH自由基的清除能力最强，其次是胞内锗多糖（IGPS），胞外多糖（EPS）的清除能力相对较弱。当多糖浓度为4.0mg/mL时，IPS的DPPH自由基清除率达到75.63%，IGPS的清除率为68.45%，而EPS的清除率为56.72%。与阳性对照抗坏血酸（Vc）相比，三种姬松茸多糖在低浓度时的清除能力较弱，但随着浓度的增加，清除能力逐渐增强，在高浓度下与Vc的清除能力差距逐渐缩小。这表明三种姬松茸多糖均具有一定的DPPH自由基清除能力，其中IPS的清除能力相对较强，具有较好的抗氧化潜力。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=12cm]{DPPH自由基清除率.jpg}\caption{三种姬松茸多糖对DPPH自由基的清除率}\end{figure}3.2.2羟基自由基清除能力图3-2展示了三种姬松茸多糖对羟基自由基的清除能力。随着多糖浓度的升高，三种姬松茸多糖对羟基自由基的清除率逐渐增大。在低浓度范围内，三种多糖的清除率增长较为缓慢，当浓度超过1.0mg/mL后，清除率增长速度加快。在相同浓度下，IPS对羟基自由基的清除能力依然表现最佳，IGPS次之，EPS相对较弱。当多糖浓度达到4.0mg/mL时，IPS的羟基自由基清除率为65.34%，IGPS为58.27%，EPS为49.15%。与阳性对照Vc相比，在整个浓度范围内，Vc对羟基自由基的清除能力均明显高于三种姬松茸多糖，但三种姬松茸多糖在高浓度下对羟基自由基也有一定的清除效果，说明它们能够在一定程度上抑制羟基自由基引发的氧化损伤，其中IPS的抑制作用相对较强。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=12cm]{羟基自由基清除率.jpg}\caption{三种姬松茸多糖对羟基自由基的清除率}\end{figure}3.2.3超氧阴离子自由基清除能力三种姬松茸多糖对超氧阴离子自由基的清除能力测定结果如图3-3所示。从图中可以看出，随着多糖浓度的增加，三种姬松茸多糖对超氧阴离子自由基的清除率呈上升趋势。在低浓度时，三种多糖的清除率差异较小，随着浓度的进一步提高，IPS和IGPS的清除能力逐渐优于EPS。当多糖浓度为4.0mg/mL时，IPS的超氧阴离子自由基清除率达到55.46%，IGPS为52.13%，EPS为45.28%。与阳性对照Vc相比，三种姬松茸多糖对超氧阴离子自由基的清除能力相对较弱，但在高浓度下也表现出了一定的清除活性，表明三种姬松茸多糖对超氧阴离子自由基具有一定的清除作用，其中IPS和IGPS的清除效果相对较好。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=12cm]{超氧阴离子自由基清除率.jpg}\caption{三种姬松茸多糖对超氧阴离子自由基的清除率}\end{figure}3.2.4ABTS阳离子自由基清除能力图3-4显示了三种姬松茸多糖对ABTS阳离子自由基的清除能力。随着多糖浓度的增大，三种姬松茸多糖对ABTS阳离子自由基的清除率逐渐提高。在相同浓度下，IPS对ABTS阳离子自由基的清除能力最强，IGPS次之，EPS相对较弱。当多糖浓度为4.0mg/mL时，IPS的ABTS阳离子自由基清除率为78.52%，IGPS为72.36%，EPS为63.48%。与阳性对照Vc相比，在低浓度时，Vc的清除能力远高于三种姬松茸多糖，但随着多糖浓度的增加，三种姬松茸多糖的清除能力不断增强，与Vc的差距逐渐减小。这说明三种姬松茸多糖均具有一定的ABTS阳离子自由基清除能力，其中IPS的清除能力较为突出，在抗氧化方面具有较大的潜力。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=12cm]{ABTS阳离子自由基清除率.jpg}\caption{三种姬松茸多糖对ABTS阳离子自由基的清除率}\end{figure}3.2.5还原力测定三种姬松茸多糖的还原力测定结果如图3-5所示。随着多糖浓度的升高，三种姬松茸多糖的还原力逐渐增强，表现为吸光度逐渐增大。在相同浓度下，IPS的还原力最强，IGPS次之，EPS相对较弱。当多糖浓度为4.0mg/mL时，IPS的吸光度达到0.856，IGPS为0.782，EPS为0.654。与阳性对照Vc相比，在整个浓度范围内，Vc的还原力均明显高于三种姬松茸多糖，但三种姬松茸多糖在高浓度下也具有一定的还原能力。还原力是物质抗氧化能力的重要体现，较强的还原力意味着能够提供电子，将高价态的金属离子还原，从而阻断自由基的链式反应，因此三种姬松茸多糖的还原力表明它们具有一定的抗氧化活性，其中IPS的抗氧化活性相对较强。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=12cm]{还原力.jpg}\caption{三种姬松茸多糖的还原力}\end{figure}综合以上五种体外抗氧化活性测定结果，三种姬松茸多糖（EPS、IPS和IGPS）均具有一定的抗氧化活性，且在相同浓度下，姬松茸胞内多糖（IPS）的抗氧化活性最强，胞内锗多糖（IGPS）次之，胞外多糖（EPS）相对较弱。这可能与多糖的结构、组成以及分子量等因素有关，后续将通过结构解析进一步探究其构效关系。3.3本章小结通过DPPH自由基清除法、羟基自由基清除法、超氧阴离子自由基清除法、ABTS阳离子自由基清除法以及还原力测定法等体外抗氧化模型，对姬松茸胞外多糖（EPS）、胞内多糖（IPS）和胞内锗多糖（IGPS）的抗氧化活性进行了系统研究。结果表明，三种姬松茸多糖均具有一定的抗氧化活性，且抗氧化活性随着多糖浓度的增加而增强。在相同浓度下，姬松茸胞内多糖（IPS）对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS阳离子自由基的清除能力以及还原力均表现最佳，胞内锗多糖（IGPS）次之，胞外多糖（EPS）相对较弱。当多糖浓度为4.0mg/mL时，IPS对DPPH自由基的清除率达到75.63%，羟基自由基清除率为65.34%，超氧阴离子自由基清除率为55.46%，ABTS阳离子自由基清除率为78.52%，还原力吸光度为0.856；IGPS在相同浓度下，DPPH自由基清除率为68.45%，羟基自由基清除率为58.27%，超氧阴离子自由基清除率为52.13%，ABTS阳离子自由基清除率为72.36%，还原力吸光度为0.782；EPS的DPPH自由基清除率为56.72%，羟基自由基清除率为49.15%，超氧阴离子自由基清除率为45.28%，ABTS阳离子自由基清除率为63.48%，还原力吸光度为0.654。这些结果表明，三种姬松茸多糖中，胞内多糖（IPS）的抗氧化活性最强，具有较大的开发利用潜力。后续将进一步对三种姬松茸多糖进行结构解析，探究其结构与抗氧化活性之间的关系，为姬松茸多糖在抗氧化领域的应用提供更深入的理论依据。四、三种姬松茸多糖的抗衰老活性研究4.1材料与方法4.1.1实验动物清洁级雄性昆明种小鼠，60只，体重18-22g，购自南京模式动物研究所，动物生产许可证号：SCXK（苏）2017-0001。小鼠饲养于温度（23±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，自由摄食和饮水，适应性饲养1周后进行实验。4.1.2试剂姬松茸胞外多糖（EPS）、胞内多糖（IPS）和胞内锗多糖（IGPS）为本实验室按照第二章优化后的提取工艺提取并纯化得到。D-半乳糖（D-gal）购自国药集团化学试剂有限公司；维生素E软胶囊（100mg/粒），购自养生堂药业有限公司，作为阳性对照药物；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、蛋白质羰基含量检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。4.1.3动物模型制备与分组将60只小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组（维生素E，100mg/kg）、EPS低剂量组（100mg/kg）、EPS高剂量组（200mg/kg）、IPS低剂量组（100mg/kg）、IPS高剂量组（200mg/kg）、IGPS低剂量组（100mg/kg）、IGPS高剂量组（200mg/kg）。除正常对照组外，其余各组小鼠均通过颈背部皮下注射D-gal120mg/kg，每天1次，连续42d，制备衰老小鼠模型。在造模的同时，正常对照组和模型对照组小鼠灌胃等体积的生理盐水，阳性对照组小鼠灌胃维生素E溶液（100mg/kg），各多糖实验组小鼠分别灌胃相应剂量的多糖溶液，每天1次，连续42d。4.1.4指标检测（1）血清和组织匀浆制备：末次给药24h后，小鼠摘眼球取血，3000r/min离心15min，分离血清，保存于-20℃冰箱备用。脱颈椎处死小鼠，迅速取出肝脏、肾脏和脑组织，用预冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称取适量组织，按1:9（w/v）的比例加入预冷的生理盐水，在冰浴条件下用组织匀浆机匀浆，制成10%的组织匀浆，3000r/min离心15min，取上清液，保存于-20℃冰箱备用。（2）抗氧化酶活性和MDA含量测定：采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按照说明书操作，分别测定血清、肝脏、肾脏和脑组织中SOD、GSH-Px、CAT的活性以及MDA的含量。SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，以抑制邻苯三酚自氧化速率50%时的酶量为一个SOD活力单位（U）；GSH-Px活性采用比色法测定，以每毫克组织蛋白在37℃下，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个GSH-Px活力单位（U）；CAT活性采用钼酸铵法测定，以每毫克组织蛋白每分钟分解H₂O₂的量（μmol）表示CAT活性；MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，以每毫克组织蛋白中MDA的含量（nmol）表示。（3）蛋白质羰基含量测定：采用南京建成生物工程研究所的蛋白质羰基含量检测试剂盒，按照说明书操作，测定肝脏、肾脏和脑组织中的蛋白质羰基含量。蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的重要指标，其测定原理是蛋白质羰基与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应生成腙，在碱性条件下呈褐色，通过测定其在370nm处的吸光度，计算蛋白质羰基含量，以每毫克组织蛋白中蛋白质羰基的含量（nmol）表示。（2）抗氧化酶活性和MDA含量测定：采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按照说明书操作，分别测定血清、肝脏、肾脏和脑组织中SOD、GSH-Px、CAT的活性以及MDA的含量。SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，以抑制邻苯三酚自氧化速率50%时的酶量为一个SOD活力单位（U）；GSH-Px活性采用比色法测定，以每毫克组织蛋白在37℃下，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个GSH-Px活力单位（U）；CAT活性采用钼酸铵法测定，以每毫克组织蛋白每分钟分解H₂O₂的量（μmol）表示CAT活性；MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，以每毫克组织蛋白中MDA的含量（nmol）表示。（3）蛋白质羰基含量测定：采用南京建成生物工程研究所的蛋白质羰基含量检测试剂盒，按照说明书操作，测定肝脏、肾脏和脑组织中的蛋白质羰基含量。蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的重要指标，其测定原理是蛋白质羰基与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应生成腙，在碱性条件下呈褐色，通过测定其在370nm处的吸光度，计算蛋白质羰基含量，以每毫克组织蛋白中蛋白质羰基的含量（nmol）表示。（3）蛋白质羰基含量测定：采用南京建成生物工程研究所的蛋白质羰基含量检测试剂盒，按照说明书操作，测定肝脏、肾脏和脑组织中的蛋白质羰基含量。蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的重要指标，其测定原理是蛋白质羰基与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应生成腙，在碱性条件下呈褐色，通过测定其在370nm处的吸光度，计算蛋白质羰基含量，以每毫克组织蛋白中蛋白质羰基的含量（nmol）表示。4.2结果与分析4.2.1对小鼠体重的影响在实验过程中，定期对各组小鼠的体重进行测量，结果如表4-1所示。正常对照组小鼠体重增长较为稳定，在实验期间体重逐渐增加。模型对照组小鼠由于注射D-gal造模，体重增长缓慢，与正常对照组相比，在实验后期体重差异显著（P＜0.05）。阳性对照组小鼠灌胃维生素E后，体重增长情况优于模型对照组，但仍低于正常对照组。各多糖实验组中，IPS高剂量组小鼠体重增长效果最为明显，与模型对照组相比，体重差异显著（P＜0.05），且接近正常对照组水平；EPS高剂量组和IGPS高剂量组小鼠体重也有一定程度的增加，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。低剂量的多糖实验组对小鼠体重增长的促进作用相对较弱，但与模型对照组相比，也有一定的改善趋势。这表明三种姬松茸多糖在一定程度上能够改善衰老小鼠的体重增长情况，其中IPS高剂量组的效果较为突出。\begin{table}[htbp]\centering\caption{三种姬松茸多糖对小é¼

体重的影响（g，<spandata-type="inline-math"data-value="XG92ZXJsaW5le1h9XHBtIFM="></span>）}\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|}\hline组别&初始体重&第14天体重&第28天体重&第42天体重\\\hline正常对照组&<spandata-type="inline-math"data-value="MjAuMTJccG0xLjA1"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MjMuNTZccG0xLjIz"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MjYuODlccG0xLjU2"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MzAuMjNccG0xLjg5"></span>\\\hline模型对照组&<spandata-type="inline-math"data-value="MjAuMDhccG0xLjEw"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MjEuNTRccG0xLjM1"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MjIuODdccG0xLjQy"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MjMuOThccG0xLjY3"></span>\\\hline阳性对照组&<spandata-type="inline-math"data-value="MjAuMTVccG0xLjA4"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MjIuMzRccG0xLjQw"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MjQuNTZccG0xLjUw"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MjYuNzhccG0xLjc1"></span>\\\hlineEPS低剂量组&<spandata-type="inline-math"data-value="MjAuMTBccG0xLjA2"></span>&<spandata-type="inline-math"data-value="MjEuODlccG0xLjM4"></span>&<spandata-type=