免疫印迹(WB)实验操作具体步骤及详细说明

2025/07/15免疫印迹(WB)实验操作步骤汇报人：_1751850234CONTENTS目录01实验前的准备工作02样品制备与处理03电泳分离蛋白04转膜过程05免疫反应06显色与结果分析CONTENTS目录07实验注意事项08实验结果的保存与报告实验前的准备工作01实验材料准备准备实验耗材包括移液枪、吸头、离心管、凝胶板等，确保实验耗材无菌且完好。配置实验试剂根据实验需要准备相应的试剂，包括电泳缓冲液、转膜液和封闭液等。准备样品和对照收集实验样品，包括待测蛋白样品和已知分子量的对照蛋白。准备实验设备确保电泳设备、转印系统、影像检测工具等实验器具运作良好并进行精准校准。实验设备准备准备电泳槽和电源保障电泳槽完好无损，电源运行平稳，以确保蛋白质分离所需的基本条件得到满足。配置缓冲液和染色液精确设置电泳缓冲液与凝胶染色液，确保实验数据精确无误。准备转膜装置准备适合的转膜装置和滤纸，为蛋白质从凝胶转移到膜上提供支持。实验试剂配制配制电泳缓冲液准备三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸和十二烷基硫酸钠（SDS），按既定比例混合，以备蛋白质分离实验使用。制备转膜液将甲醇、Tris及甘氨酸按照一定比例相溶，作为蛋白质从凝胶迁移至膜上的转移液。样品制备与处理02细胞或组织样品的收集细胞样品的收集细胞样品通常通过离心和洗涤步骤从培养基中分离出来，以去除培养基成分。组织样品的快速冷冻样本收集后需立即进行低温保存，以避免蛋白质变质，常用液氮或固态二氧化碳实现。细胞裂解液的选择根据目标蛋白的性质选择合适的细胞裂解液，如RIPA或NP-40，以确保有效提取。组织匀浆处理对组织样本进行匀浆化处理，旨在破坏细胞结构，从而释放细胞内的蛋白质，以便于后续的实验分析。蛋白样品的提取细胞裂解通过蛋白酶抑制剂的裂解液处理细胞，实现对细胞内蛋白质的释放。蛋白纯化通过离心和洗涤步骤去除细胞碎片和杂质，获得纯净的蛋白样品。蛋白定量利用BCA或Bradford技术检测蛋白质含量，以保证实验结果的精确性。蛋白浓度的测定细胞裂解采用蛋白酶抑制剂配制的裂解液对细胞进行裂解，以释放细胞内的蛋白质。组织匀浆将组织样本在冰上用匀浆器处理，确保蛋白的完整提取。蛋白纯化通过离心和洗涤步骤去除杂质，获得高纯度的蛋白样品。电泳分离蛋白03准备凝胶01配制电泳缓冲液准备三羟乙基胺、甘氨酸和十二烷基硫酸钠，按既定比例溶解于水溶液中，以备蛋白质分离实验使用。02制备转膜液将甲醇、Tris缓冲液与甘氨酸相结合，制备出适合转膜的缓冲液，确保蛋白质能顺利转移至膜上。样品的上样准备电泳装置确保电泳设备如槽、板、梳子等均清洁完好，且已准备妥当。配置电泳缓冲液为满足实验要求，需精确测量并溶解电泳缓冲液中的化学物质，以保证溶液的浓度准确无误。准备转膜设备准备转膜槽、滤纸、海绵垫等，确保转膜过程中的设备无污染且功能正常。电泳过程控制细胞培养物的收集从培养瓶中取出培养基，用胰蛋白酶处理细胞，随后收集细胞沉淀以备后续实验使用。组织样本的快速冷冻在无菌条件下迅速取出组织样本，立即放入液氮中冷冻，以保持蛋白质的活性。血液样本的分离采集血液样本，经离心处理分离出血清或血浆，移除红细胞，从而获得适用于WesternBlot（WB）分析的样品。组织匀浆的制备将组织样本在冰上用匀浆器破碎，加入适当的缓冲液，制备成匀浆液用于WB分析。转膜过程04转膜缓冲液的配制准备实验耗材包括移液管、离心管、滤纸、凝胶板等，确保实验顺利进行。配置实验试剂根据实验需求配置所需试剂，如电泳缓冲液、转膜液等。准备实验样本采集并处理实验所用的细胞和组织材料，保证样本的新鲜度及纯净性。校准实验仪器保障电泳仪及转膜设备等设备的稳定运行，实施必要的校准与保养。膜的选择与处理细胞裂解利用含蛋白酶抑制剂的裂解液摧毁细胞结构，从而释放细胞内部的蛋白质。组织匀浆将样本组织置于冰面上，利用匀浆器进行搅拌，确保得到均匀的组织蛋白悬浮液。离心分离将裂解后的样品进行高速离心，以去除细胞碎片和未破碎的组织，获得澄清的蛋白溶液。转膜操作步骤配制电泳缓冲液准备三羟乙基胺、甘氨酸和十二烷基硫酸钠，按既定比例混合于水中，作为蛋白质分离实验的试剂。制备转膜液将甲醇、Tris及甘氨酸相结合，制备出适用于转膜过程的缓冲溶液，确保蛋白质能够有效转移到膜上。免疫反应05封闭步骤01准备电泳装置保障电泳设备，如电泳槽、凝胶板及梳子等，均清洁且无损伤，并做好充分准备。02配置电泳缓冲液按照实验规范，准确测量并混合电泳缓冲剂的固体，以保证溶液的浓度精确无误。03准备转膜设备检查转膜槽、滤纸、海绵垫等转膜装置，确保无破损，准备使用。一抗孵育01配制电泳缓冲液配置Tris、甘氨酸及SDS溶液，依照规范比例进行混匀，以备后续蛋白质电泳分析使用。02制备转膜液将适量甲醇、Tris缓冲液及甘氨酸按适当比例混合，配制成转膜溶液，用于将凝胶上的蛋白质迁移至膜层。二抗孵育01细胞裂解采用裂解缓冲液对细胞进行破碎处理，以此释放细胞内部的蛋白质，确保后续蛋白分析的顺利进行。02蛋白纯化通过离心和过滤等方法去除细胞碎片和杂质，获得较为纯净的蛋白样品。03蛋白定量通过BCA法或Bradford技术评估蛋白含量，以保证实验所用蛋白样品的量度精准无误。显色与结果分析06显色液的配制01准备实验耗材确保实验所需移液管、离心管、滤纸等材料充足，并保证其质量。02配置实验试剂根据实验需求，提前配置好所需的电泳缓冲液、转膜液等试剂。03准备实验样品对将要检测的细胞和组织样本进行采集与处理，保证样本的新鲜度以及清洁度。04校准实验设备确保电泳仪、转膜装置等实验设备正常工作，进行必要的校准和维护。显色反应细胞样品的收集细胞样本一般采用离心法进行分离，以去除培养液，进而收集细胞沉淀以供后续蛋白质提取之用。组织样品的采集组织样品需在无菌条件下迅速采集，然后进行匀浆处理，以保持蛋白的完整性。样品的保存收集后的样品应立即置于-80°C冰箱中冷冻保存，以防止蛋白降解和变性。样品的分装为防止样品因频繁冻结和解冻而损害蛋白质品质，建议将样本分成若干小份，每次实验仅取用其中一份。结果的记录与分析准备电泳装置设备需保证电泳槽及电泳仪等完好无损，且需事先进行彻底清洁和详查。准备转膜设备准备转膜槽、供电设备、滤纸及PVDF膜等材料，以保障转膜操作能顺畅进行。准备显影设备准备显影仪或暗室，以及显影液和定影液，为后续的显影步骤做好准备。实验注意事项07实验操作的注意事项准备实验耗材包括移液管、离心管、滤纸等，确保实验过程中耗材的充足和质量。配置实验试剂依据实验需要，预先准备所需电泳缓冲液、转膜液等实验试剂。准备实验样本收集并处理好实验所需的细胞或组织样本，确保样本新鲜且无污染。校准实验设备校验与调整电泳仪、转膜器等实验室设备，确保实验结果的可信度。结果解读的注意事项配制电泳缓冲液将Tris、甘氨酸和SDS按一定比例溶解于水，以备进行蛋白质分离实验使用。制备转膜液将甲醇、Tris和甘氨酸溶液混合，制备用于转膜的缓冲液，确保蛋白质能够顺利转移到膜上。实验结果的保存与报告08结果的保存方法细胞裂解采用添加蛋白酶抑制剂的裂解液对细胞进行破碎处理，从而释放细胞内的蛋白质。蛋白纯化采用离心及洗涤程序，有效清除细胞残留及不纯物质，从而提取出高纯度的蛋白质样本。蛋白定量采用BCA或Bradford方