四角蛤蜊种质

1四角蛤蜊种质本文件给出了四角蛤蜊[Mactraveneriformis]的名称与分类、主要形态特征、繁殖生物学特征、细胞遗传学特性、分子遗传学特性、检测方法和判定规则。本文件适用于四角蛤蜊的种质检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.2养殖鱼类种质检测第二部分：抽样方法。GB/T32757贝类染色体组型分析3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4名称与分类4.1学名四角蛤蜊[Mactraveneriformis(Reeve,1853)]。4.2分类地位蛤蜊属（Mactra）。5主要形态特征5.1外部形态贝壳坚厚，略成四角形；两壳极膨胀；壳顶突出，位于背缘中央略靠前方，尖端向前弯；小月面及楯面极明显，呈心形；外韧带细薄，不明显；贝壳具外皮，顶部白色，幼小个体呈淡紫色，近腹缘为黄褐色，腹面边缘常有1条很窄的边缘。生长线明显粗大，形成凹凸不平的同心环纹；贝壳2片，左右对称；贝壳内面白色，铰合部宽大，左壳具一个分叉的主齿，右壳具有2个排列成“八”字形的主齿；内韧带发达，呈三角形，位于壳顶后方斜三角形韧带槽内。四角蛤蜊的外部形态见图1。2图1四角蛤蜊外部形态5.2内部构造由左右外膜附着壳内面包围整个肉体形成外套腔，套膜分边缘、中央两部分；边缘部分肌肉发达较肥厚、中央部分薄而透明。外套膜在后端腹侧着，形成两个水管，水管短而粗，两个水管紧靠，出水管较入水管细而短，位于入水管背面；两水管的末端具有触手。体中部稍后方左右两侧有两个鳃瓣，鳃前方左右各有两片唇瓣、唇瓣之间为口。外套腔偏前方有一略呈扁形的内脏块，其腹面为呈斧刀状的足。心脏位于壳顶下方，内脏块背侧偏后，呈梭形带透明状。5.3可数性状5.3.1贝壳2片，左右对称。5.3.2外套膜2片，左右两叶。5.3.3鳃瓣左右各2片。5.3.4左壳具主齿1枚，右壳具主齿2枚。6繁殖生物学特性6.1性成熟年龄与性腺特征雌雄异体，雌雄性腺肉眼观察无区别；首次性成熟年龄为1龄，成熟季节，雌、雄性生殖腺均为乳6.2性比雌雄性比约为1:1.08，雄性多于雌性。6.3繁殖期周年2次繁殖期。6.4产卵量1龄～2龄四角蛤蜊第一次产卵量为1.3×106粒～1.8×109粒。6.5精卵特征沉性卵，卵径为70μm～80μm。精子分为头部、中段和尾部三部分。7细胞遗传学特性7.1染色体数二倍体体细胞染色体数：2n=38.7.2核型公式染色体组核型公式：14M+14SM+10ST/T,NF=66。8分子遗传学特性8.1线粒体COⅠ基因序列片段（658bp，GeneBank序列号：MN317133）1aactctttattttgttttttcttattgagctggtttagttgggactgcttttagttctat61tattcgtttagaattggctgttcctggtgaaagattgcttgatggtcagctctataattt121ggttgtgacagcacatgctttagttataattttttttttagtaatacctataatgatggg181aggttttggaaactggttagttcctttaatactaaaagttcctgatatgagttttcctcg241tataaacaatattagtttttgacttcttcctgtgtctatgttactgttattcgcttcagc301ttatgttgaaagaggggcaggaactgggtgaactatttatcctcctttatctagccatat361aggtcatcctgggcctgctatggattatgttattttttctcttcatgttggtggtctctc421ttcaattttagcttctattaatttttttactactttcttgagaatgcgtttgaaggtgat481gtctttatatcgtgtcccattattcgtatggtgtattgctgttactaggtttttattaat541agtagctatgcctgttttagctggtgctcttacgatattacttactgatcgtaattttaa601tacttctttttttgacccaaatggaatgggtgacactattttatttgttcatttgttt8.2线粒体16srRNA基因序列片段（306bp，GeneBank序列号：MN317133）1gcaataaattgtcctttaattggggaaatgaatgaaggggttgacgagggggaagctgtc61tttttaatatagtccgaagttttcttttatgtgaaaagacttagattttacaataagaag121agaagaccccggcgagcttgttaaggtttaataacgtttattaattattgatttttgttg181gggcaacgcaaagggaaaaaaactcctttgtattaaataaggatccactcagagtgaatc241aagcaaaagctaccgtggggataacagcgcaattttttcagagagttcatatcgaagaga301aagctt9检测方法9.1抽样4参照GB/T18654.2的规定执行。9.2主要形态构造检测9.2.1外部形态光线充足时，肉眼观察。9.2.2可量性状壳高和壳长按照定义描述用游标卡尺测量。9.2.3内部构造光线充足时，解剖后用解剖镜或肉眼观察。9.3细胞遗传学检测9.3.1抽样参照GB/T18654.2的规定执行。9.3.2染色体和核型9.3.2.1染色体标本制备参照GB/T32757的规定执行。9.3.2.2核型分析观察100个左右的分散良好的中期分裂相，记数确定二倍体数。从中挑选10个分散良好、形态清晰的中期分裂相进行显微摄影、放大、测量，按GB/T32757的分类标准对染色体分类。9.4分子遗传学检测9.4.1DNA提取取斧足肌肉30mg，剪碎至糜状，DNA提取试剂盒或常规酚-氯仿方法提取总DNA,灭菌双蒸水溶解备9.4.2引物序列COⅠ：LCO1490：5,-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3,，HCO2198：5,-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3,；16SrRNA：16S3L：5,-TGAGCGTGCTAAGGTAGC-3,，16S4H：5,-AGCCAACATCGAGGTCGC-3,。9.4.3PCR反应体系DNA模板50ng～100ng、10×Buffer（500mmol/LKCl；100mmol/LTris-HCl，pH8.3；15mmol/L9.4.4PCR反应程序59.4.4.1COⅠ基因PCR反应程序反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，45℃退火40s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。每组PCR均设阴性对照来检测是否污染。9.4.4.216SrRNA基因PCR反应程序反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸5min。每组PCR均设阴性对照来检测是否污染。9.4.5测序产物直接测序，为了保证