首医大临床生物化学实验课件04乙酰丙酮测甘油三酯

乙酰丙酮法测定血清甘油三酯

血清中的甘油三酯是冠心病的主要危险因素之一,血清甘油三酯的测定方法主要有化学法、酶法和色谱法3大类。核素稀释/气相色谱/质谱技术（ID/GC/MS）主要用作参考系统中决定性方法的建立及参考物质的制备与定值，此法费用昂贵，样品处理复杂，难以推广应用。早期测定方法是以总脂质与胆固醇和磷脂之差估算。化学法用有机溶剂抽提标本中的TG，去除抽提液中磷脂等干扰物后，用碱水解（皂化）TG，以过碘酸氧化甘油生成甲醛，然后用显色反应测甲醛。二氯甲烷-硅酸-变色酸法（VanHandel-Caslson法）:比较准确,以氯仿抽提,沸石吸附磷脂,抽提完全、能去除磷脂及甘油干扰、变色酸显色灵敏度高、显色稳定，至今还是美国疾病控制与预防中心（CDC）的内部参考方法。但因操作步骤繁多、技术要求高而不适于常规工作应用。乙酰丙酮法：异丙醇抽提,沸石合剂或氧化铝吸附干扰物,乙酰丙酮显色或测荧光;分溶抽提法,乙酰丙酮显色。1.抽提：提取和纯化TG,去除磷脂等干扰物，抽提常用氯仿、异丙醇等有机溶剂，去干扰采用各种吸附剂或分溶抽提。2.皂化：即将TG水解为甘油，一般采用KOH的乙醇或异丙醇溶液进行皂化，也可用甲醇钠、乙醇钠的醇溶液转酯化作用。3.氧化：甘油氧化为甲醛，用过碘酸的稀溶液在酸性环境下氧化甘油产生2分子甲醛和1分子甲酸。4.显色

变色酸：反应灵敏度高，颜色十分稳定，高温放置2-3天吸光度不变，需用强酸，并在100度加温30分钟。

乙酰丙酮：反应条件温和，灵敏度低，颜色不很稳定，室温放置是会逐渐加深。【目的要求】

1.掌握乙酰丙酮法测定血清甘油三酯的原理。2.熟悉化学法测定血清脂类的基本思路及方法3.熟悉721分光光度计的使用和常规维护实验原理：血清脂蛋白（乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白）中的甘油三酯经正庚烷-异丙醇混合溶剂抽提后，脂蛋白变性，结合的甘油三酯分离，再用氢氧化钾皂化，使甘油三酯水解成脂肪酸和甘油。游离的甘油被过碘酸氧化成甲醛，甲醛与乙酰丙酮在铵离子存在下，缩合成黄色的3,5-二乙酰-1,4-二氢二甲基吡啶，与同样处理的标准管进行410nm比色，可测出甘油三酯的含量。

加入物（ml)空白管标准管测定管血清--------0.2标准液----0.2----蒸馏水0.2--------抽提剂2.52.52.5硫酸溶液0.50.50.5边加边摇，使之充分混匀，静置分层后，分别准确吸取上清液于另外3支试管中。上清液0.30.30.3皂化剂1.01.01.0加入皂化剂后，充分混匀各管，56度水浴5分钟氧化剂1.01.01.0显色剂1.01.01.0加试剂后充分混匀各管，56度水浴保温25分钟，取出冷却，用分光光度计比色，于415纳米处，以空白管调零。测定各管吸光度。计算血清TG＝A测/A标*2.26mmol/L【临床意义】1．血清TG增高常见于家族性脂类代谢紊乱，肾病综合征、糖尿病、甲状腺功能减退、急性胰腺炎、糖原积累病、胆道梗死、原发性甘油三酯增高症、动脉粥样硬化等2．血清TG降低比较少见，慢性阻塞性肺疾患、脑梗死、甲状腺功能亢进、营养不良和消化吸收不良综合征等可引起血清TG的降低。【注意事项】

1．血清TG易受饮食的影响，在进食脂肪后可以观察到血清中甘油三酯明显上升，2-4小时内即可出现血清混浊，8小时以后接近空腹水平，因此，要求空腹12小时后进行采血，并要求72小时内不饮酒，否则会使检测结果偏高。2．显色后吸光度随时间延长会有一定量的增高，故加样后要立即比色，可置冰箱中逐管进行比色。3．本法所用试剂较稳定，室温下可保存半年，分装使用可避免因试剂污染而引起的空白值升高。4．皂化、氧化及显色的时间和温度对吸光度均会有影响，所以每测定一批都应该同时做标准对照。5．TG在12.93mmol/L以下时，线性关系良好，当血清明显混浊时，可用生理盐水作倍比稀释后再测。6．以血浆作标本时，还应注意抗凝剂的影响，通常使用EDTA-K2作抗凝剂。

7．无论是使用血浆还是使用血清作为检测标本，取血后都应及时分离，以免红细胞磷脂在磷脂酶的作用下产生游离甘油，或者抗凝剂存在时红细胞内水溢出而稀释血浆降低TG值。分离血浆前，标本最好放于冰水中，并尽快分离血浆，避免TG自发水解出现误差。【思考题】1.本法的技术要点是什么，反应易受哪些因素影响，应如何控制?目前国内临床生化检验使用的生化试剂绝大多数都是单一试剂，在甘油三脂测定中测得甘油三脂的含量实际上是标本中甘油三脂与游离甘油的总含量，尽管临床上可以通过减去标本中平均游离甘油的含量和修改正常范围加以弥补，但是，由于临床标本的个体差异，使得血标本中游离甘油的含量不可能都一样。而液体双试剂可先让标本与试剂I反应（试剂I中包括甘油激酶、抗坏血酸氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、过氧化物酶），从而彻底消耗标本中游离甘油，排除