CN109946451B 一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒 （浙江诺迦生物科技有限公司）

(19)国家知识产权局(12)发明专利济技术开发区启迪路198号杭州湾信合伙)33213本发明公开了一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法细胞系CB1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo3-AM,所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/21.一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)将大麻素受体CB1基因克隆到CMV启动子下构建真核表达质粒，将所述真核表达质粒转染到真核永生化细胞，并建立CB1稳转细胞系，进行培养扩增得到细胞培养液；2)步骤1)细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的5种标准液，将每种四氢大麻酚浓度的标准液均分为相同的2份；其中1份标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₁;另1份标准液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性标准液，阴性标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₂;以荧光值Y₁与荧光值Y₂之差为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程；3)步骤1)细胞培养液中加入待测样本，配制得到样本液；取2份相同的样本液，其中1份样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₃;另1份样本液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性样本液，阴性样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₄;计算荧光强度Y₃与荧光强度Y₄之差，并带入步骤2)回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质含量；步骤1)中，所述大麻素受体CB1基因为人源大麻素受体CB1基因；所述真核表达质粒为pCMV-CB1质粒，其制备过程为：将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-慢病毒包装细胞293V,制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染人胚肾细胞293得到稳转CMV-CB1的293细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选稳转CMV-CB1的293细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293;步骤2)中，所述大麻素受体拮抗剂为NESS0327;步骤2)和步骤3)中的细胞内游离钙离子探针试剂均为Fluo3-AM。2.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2)中，向细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制四氢大麻酚浓度3.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的任意一种。4.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3)中，进行检测胞内游离荧光钙离子荧光强度的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择488nm波长激发，以526nm波长检测胞内游离荧光钙离子荧光值。5.一种大麻素类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单3克隆细胞系CB1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo3-AM,所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293、细胞内游离钙离子探针试剂Fluo3-AM以及大麻素受体拮抗剂，大麻素受体拮抗剂为所述稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293的制备过程为：所述大麻素受体CB1基因为人源大麻素受体CB1基因，将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染人胚肾细胞293得到稳转CMV-CB1的293细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选稳转CMV-CB1的293细胞，并通过挑取克隆的方法获得所述稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293。4一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。背景技术[0002]对于吸毒人员吸食大麻类毒品的检测和监管一直是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗四氢大麻抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但大麻类在人体内代谢较快，造成检测样本中目标基于抗体的免疫检测法几乎不可能，甚至气质联用、液质联用也无法检测。发明内容[0003]针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。[0004]本发明构思为：无论是天然大麻素，还是各种各样的合成大麻素，其在机体内都会作用到大麻素受体这个靶点，从而产生其生物学效应。大麻素受体至少包括CB1、CB2两种类作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号通路使内质网内储存的Ca²+迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答；如果用麻素受体拮抗剂则作用相反。由于胞质内游离钙离子浓度的测定有非常成熟的方法，因而我们通过建立稳转CB1的细胞系，建立一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质快速、高效、精准、高通量的通用检测方法。[0005]所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方[0006]1)将大麻素受体CB1基因克隆到CMV启动子下构建真核表达质粒，将所述真核表达质粒转染到真核永生化细胞，并建立CB1稳转细胞系，进行培养扩增得到细胞培养液；[0007]2)步骤1)细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的5种标准液，将每种四氢大麻酚浓度的标准液均分为相同的2份；其中1份标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₁;另1份标准液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性标准液，阴性标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₂;以荧光值Y₁与荧光值Y₂之差为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲[0008]3)步骤1)细胞培养液中加入待测样本，配制得到样本液；取2份相同的样本液，其中1份样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的样本液进行检测胞5内游离荧光钙离子荧光值Y₃;另1份样本液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性样本液，阴性样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y₄;计算荧光强度Y₃与荧光强度Y₄之差，并带入步骤2)回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质含量。[0009]所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方CB1质粒。[0010]所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方粒共转染至慢病毒包装细胞293V,制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染人胚肾细胞293得到稳转CMV-CB1的293细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选稳转CMV-CB1的293细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系[0011]所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2)中，向细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制四氢大麻酚浓度分别为[0012]所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2)中，所述大麻素受体拮抗剂为Pyrazoles、Triazoles、Imidazoles或[0013]所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方[0014]所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2)和步骤3)中的细胞内游离钙离子探针试剂均为Fluo3-AM;步骤3)中，进行检测胞内游离荧光钙离子荧光强度的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择488nm波长激发，以526nm波长检测胞内游离荧光钙离子荧光值。[0015]所述的一种大麻素类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo3-AM,所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293、细胞内游离钙离子探针试剂Fluo3-AM以及大麻素受体拮抗剂。[0016]相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：[0017](1)避免了免疫检测法依赖于抗体的局限，可直接对所有大麻素类活性物质进行通用检测，没有非特异性结合问题，无需昂贵人力物力和繁复长周期的抗体研发过程；同时也避免了气质联用、液质联用法依赖于对照品的局限、有限的检测限、以及复杂的样品前处理工作。本发明的技术方案可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论6是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题。[0018](2)可利用成熟的胞质内游离钙离子浓度的测定技术定量检测分析。[0019](3)可用通用的流式细胞仪、荧光酶标仪等方法测定，可在绝大多数普通实验室实现检测。[0020](4)由于是基于受体信号通路的生物学效应的检测，结果不仅可正确判断是否是大麻素类活性物质，而且可以对其活性进行定量评估，为监管、和医学干预提供可靠的实验[0021](5)本发明提供一种稳转细胞系，其能够通过CB1的IP3-DAG信号通路对包括天然大麻素和合成大麻素在内的所有大麻素类活性物质产生应答，从而可应用于大麻素类活性物质的高灵敏的通用检测，该稳转细胞系中包含一个由CMV启动高表达基因CB1;当大麻素类活性物质作用于CB1时，即可启动IP3-DAG信号通路，使内质网内储存的Ca²+迅速释放到细胞质，胞质内游离Ca²+可瞬间提高百倍。因而可利用成熟的胞质内游离钙离子浓度的测定技量的大麻素类活性物质通用检测试剂盒，该检测试剂盒基于CB1受体的IP3-DAG信号通路，通过检测胞质内游离钙离子浓度变化的荧光检测来实现快速、灵敏、精确的检测和定量分附图说明[0023]图2为以THC标准品浓度为横坐标，标准品组的荧光值减去对应标准品+拮抗剂组的荧光值为纵坐标绘制的标准曲线；[0024]图3为采用本发明的大麻素类活性物质通用检测试剂盒对毛发样本的检测结果；极限>0.4ng/ml;[0026]图5为竞争ELISA法对0.4-12.8ng/ml浓度THC的检测标准曲线；[0027]图6为竞争ELISA法对毛发样本的检测结果。具体实施方式[0028]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。[0029]以下实施例中，慢病毒包装系细胞293V购自于北京英茂盛业生物科技有限公司。[0031]通过连接酶切位点EcoRI和NotI,将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达[0032]实施例2建立CB1/293稳转细胞系[0033]将pCMV-CB1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系霉素、100μg/ml链霉素双抗)将慢病毒包装系细胞293V配成1×10⁶个/ml浓度接种于一个7[0035]2)转染：待培养皿中细胞长至70%-80%的融合度时，用PEI转染试剂(参照其标准的中的细胞293V。[0036]3)收集病毒：步骤2)培养72小时后收集上清液；在4℃温度且8000g相对离心力的[0037]4)病毒浓缩：取步骤3)滤过的上清病毒液(约30m1),在4℃温度且90000g相对离心力的条件下离心分离90分钟，去上清，沉淀即为CMV-CB1慢病毒，用1ml的DMEM-H完全培养液[0038]5)HEK293细胞准备：预先将1×10⁵个/ml浓度的HEK293细胞接种12孔细胞培养板1[0039]6)HEK293细胞转染：将步骤5)的12孔板中的培养HEK293细胞的培养液吸掉，加入养液。[0040]7)CB1/293稳转细胞筛选：上述步骤6)转染后的HEK293细胞培养一周以上后，配成1×10⁴个/ml浓度接种于6孔细胞培养板，2ml/孔；第二天细胞贴壁后吸去培养液，加入2ml的条件培养液(含600μg/ml的G418的DMEM-H完全培养液);每三天换1次新鲜的条件培养液全培养液。[0041]8)单克隆CB1/293稳转细胞系建立：将上述步骤7)CB1/293稳转细胞配成1×10³个/ml浓度接种于6孔细胞培养板，2ml/孔；培养10天后在显微镜下用50μ1的移液枪挑取单个克隆移至新的6孔细胞培养板培养，1个克隆/孔；扩增后用PCR检测CB1基因、WB检测CB1蛋类活性物质检测。[0042]实施例3大麻素类活性物质通用检测试剂盒的应用[0043]基于本发明技术方案研发的大麻素类活性物质通用检测试剂盒可应用于含大麻素类活性物质的各种样本检测。本实施例中我们以吸食大麻人员的毛发为例。具体步骤如[0044]1)毛发样本处理：取6份大麻吸食人员的毛发样本和8份无吸食史的正常人的毛发[0045]剪取发根3cm以内的毛发样本20mg/份，剪碎后放入5ml的EP管，加2ml含1%角蛋白酶的HBSS缓冲液(pH7.4),加入少量锆珠和石英砂，粉碎仪上振荡粉碎1分钟，分别得到相应的样本液。编号[0047]2)细胞准备：提前一天将5×10⁵个/ml浓度的单克隆CB1/293细胞接种于一个96孔8如下。[0050]标准品+拮抗剂组：CB1/293细胞共5孔，先每孔加入拮抗剂0327NESS,0327NESS[0051]样本组：CB1/293细胞共42孔(每样3个重复孔),加入步骤1)所得样本液，100μl/[0052]样本+拮抗剂组：CB1/293细胞共42孔(每样3个重复孔),先每孔加入拮抗剂0327NESS,0327NESS终浓度为2nM,100μl/孔，37℃孵育10min;各孔再置换为含有2nM的0327[0053]4)检测：对步骤3)处理的标准品组、标准品+拮抗剂组、样本组和样本+拮抗剂组，分别进行胞内荧光钙离子的荧光值检测，各组的检测方法步骤相同。标准品组的检测过程为：将Fluo3-AM工作液加入到步骤3)处理的标准品组中，37℃培养20分钟；加入3倍体积心细胞，以防细胞丢失；37℃培养10分钟，然后用荧光酶标仪进行细胞内荧光钙离子检测，488nm激发、526nm检测，526nm波长下检测细胞内荧光钙离子的[0054]5)结果：以THC标准品浓度为横坐标，标准品组的胞内游离荧光钙离子荧光值减去对应标准品+拮抗剂组的胞内游离荧光钙离子荧光值为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程为y=3176.9x+1776.3,R²=0.9886,如图2所示。样本组的荧光值减去对应样本+拮抗剂组的荧光值的结果如图3,可明显区分阳性样本和阴性样本；根据绘制标准曲线的回归方程计算，阴性样本均检测不到大麻素成分，阳性样本中大麻素相对含量分别为(ng/mg):C1:[0055]对比例1:竞争ELISA法检测大麻吸食人员的毛发样本[0056]目前大麻类检测主要依赖于免疫法检测，包括胶体金免疫层析法和竞争ELISA法。胶体金法适合快检，但在灵敏度上ELISA法要比胶体金法高1个数量级。本对比例即以ELISA法检测大麻吸食人员的毛发样本为例。具体步骤如下：[0057]1)毛发样本处理：用实例3中同一的处理样本，分别得到相应的样本液(毛发样本编号与表1相同)。[0058]2)包被抗原：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)将THC-BSA抗原蛋白配制成1μ异性