《临床液相色谱-串联质谱检测方法建立、性能确认和质量控制》征求意见稿

本标准适用于医疗机构使用液相色谱-串联质谱自建方法进行小分子定量检测服务临床的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版WS/T402临床实验室定量检验项目参考区间的制定WS/T408定量检验程序分析性能验证指南WS/T641临床检验定量测定室内质量控制YY/T1740.1医用质谱仪第1部分：液相色谱-质谱联JJF1317-2011液相色谱-质谱联用加入到待测样品中作为测定待测组分含量的参照分析测量范围analyticalmeasurem有证参考物质certifiedreferencemate2样品中除待测物以外的其他成分对分析方法测量能力的干扰注:该比值与噪声强度峰值的算法有关:——信号的最大峰值与基线噪声的最大峰值之比,称峰峰比;——信号的最大峰值与基线噪声的最大峰值/2之比,称半峰比;CV：变异系数（coefficientofvariatCRM：有证参考物质（certifiedreferencematerDa：道尔顿（dalton）EQA：室间质量评价（externalqualityassessmJCTLM：检验医学溯源联合委员会（thejointcLC：液相色谱（liquidchromatogrLC-MS/MS：液相色谱-串联质谱（liquidchromatography-tandemmassLLMI：测量区间下限（lowerlimitofmeasuringintervaLOD：检测限（limitofdetectMRM：多反应监测（multiplereactionmonitoring）MS：质谱（massspectrometry）NIST：美国国家标准技术研究所（nationalinstituteofstandardsandULMI：测量区间上限（upperlimitofmeasuringinterval）3采用有证试剂盒，需完成线性、精密度、正确度和干扰的性能确认，其他性能指标可根据校准物可购买商品化的，也可由实验室自行配制。如自行配制，宜使用具有明确信息的CRM配制，如无法获得可使用其他高纯度级干材料或浓度较高的溶液，不能直接使用，需要通过称量、混合、稀释等手段进一步制备。为了确保可靠性和准确度，制备需要使用符合计量准确度及精密度的设备平、容量瓶、移液器等，并建立严格的操作及定期校准程序。首选经过参考测量程序赋值的商品化质控品，如无法获得可自行配制。质代表临床样品的特性。如高浓度质控品或低浓度质控品没有覆盖分析测量范围，可通过添加校准物，以获得高浓度质控品；或使用相同的空白基质稀释，以获得低浓度质控品。如校准物和质控品均为自行配制，宜使用来源不同的品牌或批次的物料，且配制过程需要独立，避免校准物和质控品间存在系统误差。自制的校准物和质控品需要评估均匀性、过程引入的偏差，有助于提高定量分析的准确度和精密度。IS应物在色谱中可共同洗脱且具有相同母离子和子离子的干扰物。应评估内标的纯度是否会影响分析物的检测，内标在分析物处的峰面积应小于分析物LLMI峰面积的20％。素标记物。为了避免同位素干扰，IS的质荷比宜比目标分析物至少大3Da，标记纯度应超用结构类似物，其与分析物之间保留时间应相近，且不应发生质谱峰重校准物和质控品的基质宜尽可能同临床样品相似。对外源性分析物，宜使用与临4试剂（特别是流动相所用的溶剂）中的杂质可能会影响离子化效率或产生干扰，影响检测结果，因此试剂的纯度极为重要，需要评估其是否会产生离子抑制或增强。优选MS级别，或至少LC级别的试剂。实验用水要求电阻率≥18.2MΩ/cm，总有机碳＜10ng/g，用超纯水机制备，也可使用商品化超纯水。试剂使用时应注意避免污染，防止高温挥其稳定性产生影响。有机溶剂（如甲醇、乙腈）及其他试剂（酸或碱类）应按照危险化学品管理，使用、储存、运输及废液处理应遵守说明书和法规要求，可参考《危险化学全管理条例》、《医疗废物管理条例》等，实验室应建立化学毒物与职业暴露防护规程。塑料吸头、离心管和微孔板等耗材可能会析出杂质或存在非特异性吸附，导致峰、背景噪音或发生响应持续降低，从而影响分析物的检测结果。同耗材，因生产流程或材料来源改变，也可能影响最终的检测结影响质谱仪性能的仪器参数包括：离子化模式、毛细管电压、电晕针电流、锥孔电压、锥孔气流速、雾化气流速、脱溶剂气温度和流速、离子源温度、质谱分辨间、通道间延迟时间、碰撞能量和检测器电压等（不同品牌根据仪器的灵敏度及分析物的离子化效率制备高响应106，不同品牌的质谱仪略有差异）的目标分析物溶液，以制造商推荐的流速通过注射泵（内置或外置）将溶液连续注入质谱仪，仪器自动或者人工调谐仪器参数确定离子化模式、分析物母离子和子离子子源参数和碰撞能量，以获得最佳的离子响应。在选择母离子或子离子时，尽量避免选择损失质量数为18的脱水离子碎片。每种分析物至少设定2个独立MRM离子通道，作为定量离色谱柱种类繁多，有反相、正相、亲水作用、离子交换、尺寸排阻等类型，常用反相色谱柱或亲水作用色谱柱，例如C18、C8、苯基和酰胺基等。色目标分析物的理化性质，通过结构分析、文献查阅和实验结果选择适合的色的选择需要考虑干扰物的分离、基质效应、柱压、保留时间和色谱峰常用的流动相包括水（水相）和甲醇、乙腈、乙醇、丙酮（有机相）等的理化性质和色谱柱的特性选择适宜的流动相、氢离子浓度指数（pH）或离子化添加剂。在方法建立过程中，若需提高分析物的分离度，可调整流动相的类型和比例；若需改善峰形和提高离子化效率，可在流动相中添加甲酸、乙酸、氨水、甲酸盐或乙酸盐等添加剂，添加剂浓度不宜太高。避免使用的添加剂有：非挥发性盐（导致仪器需要频繁清洗且影响信号强度）、无机酸（腐蚀LC-MS/MS接口）和表面活性剂（抑制离子化）。需注意的是，离子对试剂会抑制MS信号，因此尽量不用或使用极低浓度的离子对试剂0.02。此外，还需要考虑流动相比例及pH与色谱柱的兼容性。5液相色谱分离方法可采用等度洗脱或者梯度洗脱，临床检测常使用梯度洗脱的方等度洗脱在色谱分离的过程中维持恒定的流动相组分。梯度洗脱在分析过程中流动会发生变化，对于反相液相方法，初始阶段水相的比例相对较高，运行过程中有例逐渐升高。影响液相性能的仪器参数包括：色谱柱的填料类型、粒径、长度，柱温箱温定。在LC-MS/MS分析中，由于质谱MRM模使用LC-MS/MS分析前需对样品进行在临床应用中，分析测量范围应取决于临床需求。使用一个双空白样品（不含分析物），间，则需要增加校准物数量。校准物基质的包括LLMI和ULMI，以及分析测量范围内的所有相关），基质匹配双空白样品的信号反映了样品在LC-MS/MS系背景峰面积小于LLMI处分析物峰面积的20并小于IS处峰面积的5％。分析内源性分析物时，如果无法获得去除分析物的空白样品，可使用与样品基质相当的替代基质评估基质效应是LC-MS/MS方法验证的关键组成部分，可以采67.5.3.1评估至少5个不同来源的基质。得的峰面积与不含基质纯溶液的分析物峰面积比较，计算基质效应，评估基质效应对灵敏度的影响，若是内源性分析物，则需扣除本底。为），7.5.3.2使用注射泵将含有分析物的纯溶液在色谱柱之后质谱仪之前以恒定的速度直接注入质谱仪，稳定后从LC端同时进样提取后的空白基质。流图信号降低，即存在明显的离子抑制。通过比较无基质的信号与有基质的信号来评7.5.3.3选取至少5个不同来源的临床样品LC-MS/MS连续流路设计，可能会由进样器、色谱柱入分析物残留，残留不应对检测准确度或精密度产生影响。通过在U品中分析物响应的20％，并且不超过内标的5％。在分析可能造成残留的样品后，运行一个空白样品，证明系统中没有明显的样品残留后再分析其它样品。在进行全面验证之前，应采用分析测量范围内的多个数据点评估重复性。重复性品至少重复检测20次，计算CV。CV应满足实验室对不同分析物所设定的标准。LLMI是在满足实验室对准确度和精密度要求的前所能准确定量检测分析物的最低浓度或最低量。LLMI验证实验宜使用3-5个接近LOD浓度宜选择6-8个不同浓度水平，每个浓度至少重复检测3次），0.99，LLMI和理论值偏差应在±20％以内，其余浓度和理论值偏差应在±15％以内。8.3精密度7上）3个不同浓度的样品，每个浓度每批至少重复检测5多种方法。样品类型选择应按照以下次序：临床样品＞混合临床样品＞与样品基质相8.4.2方法间比较如果有参考方法，首选与其进行比较。采用至少4围。应使用临床样品，样品应从检测目标人群中获得。质谱法与免疫法的比较不适用于质可分析CRM或可接受的替代品评价正确度。提供这8.4.4加标回收实验论值为样品中内源性分析物与加入校准物浓度之和，检测值与理论值的比可用于评价正确尽管LC-MS/MS具有较高选择性和特异谢物质、营养补充剂、内源性化合物、样品基质、高浓度的血红蛋白、胆红素或脂质凝血剂、促凝剂、防腐剂以及血清或血浆分离管中的凝胶材料，优选使用待测临床样品来评估干扰，可参考WS/T408定量检验程序分析性能验证指南。对分析物的同分异构同位素应评估可能造成的干扰，如果造成干扰，则应在色谱上分离。对未知干扰物的可通过使用离子比率，其在批内或批间应无显著改变。根据在分析方法开发和验证数据，设定临床样品离子比率变化的可接受标准校准物。8.6稀释一致性对于需要稀释的样品（如分析测量范围以外的样品、分析测量范围以内需要稀释的样品和小体积样品）需要验证其允许稀释度。选择的稀释剂应该与基质相当。稀释验证应进88.6.2分析测量范围以外稀释同的处理后检测，稀释前原样品浓度根据稀释8.6.3分析测量范围以内稀释分析物浓度在分析测量范围内的样品可能需要进行稀释（如需要对样品受到制或增强进行部分校正）。样品提取后，对提取液进行稀释，然后进行检测。稀释后分析8.7稳定性8.7.1样品稳定性实验室应评估样品在采集、保存及运输过程中的稳定性，短期保存稳定稳定性、反复冻融稳定性、样品处理过程中及处理后待机的稳定性。使用低、高浓度样-20℃、-80℃等不同温度。可根据实验室的实际工作情况进行不同保存时间、温度和反复冻融次数的实验设计。由新鲜制备的校准物获得标准曲线，检测结果与理论浓度相比较，8.7.2校准物、内标和质控品的稳定性若实验室自配校准物、IS和质控品等，还应评估各级储存液的稳可参考WS/T402临床实验室定量检验项目参考区间的制定。9.1文件和记录9.1.1标准化操作规程）；9h)仪器维护和保养标准化操作规程（以制造商的说明书为根据标准化操作规程制定相应记录（纸质或电子至少包括（不限于a)检测记录：患者信息、样品检测结果、检测日期与时间、仪器、耗材b)质控记录：质控品检测结果、质控日期与时间9.2人员培训、考核与授权9.3场地及环境要求实验室应设置独立的样品制备区、仪器分析区和结果报告区，有条件的的射频辐射。保证气体供应的流量、纯度、质量以及供气系统的稳定性，气体发生器的过9.4仪器管理9.4.1仪器性能要求9.4.2仪器准备按制造商说明书的要求做好维护保养，定期校准/调谐（可参考JJF131色谱-质谱联用仪校准规范，可由制造商工程师执行确保仪器始终处于良好的工作状），9.4.3不同仪器间比对若试剂或耗材更换批次或品牌时应进行验证。可通过分析临床样品或质控品进行验证，效期，实验室需明确其配置、储存和使用条件，并定期更换，特别是纯水相应现配现9.6分析前质量控制9.7分析中质量控制9.7.2系统适用性评估宜在每次分析运行前、预防性维护后、仪器卸真空度后或系统平衡9.7.3双空白和单空白样品双空白样品在分析物的检测通道中不出峰或峰面积＜20％LLM9.7.4标准曲线对每批临床样品进行校准，线性相关系数和偏差的9.7.5.1质控品浓度范围9.7.5.2质控数量和频率质控数量宜至少占该批次临床样品总数的5或至少6个质控品（比如：3个浓度重复检测两次）。可将质控品插入分析批次的前、中和后。应在日常检测中对质控频评估，如果方法很稳定可减少质控频率，减少质控频率的决定需要基于充分的数据支风险评估（方法的稳定性、临床重要性、失控历史等）。反之，如果方法存在性能下9.7.5.3质控规则和失控纠正若一个分析批包含多个处理批，整个分析批和每个处理批均应满足接受标准。则和失控纠正可参考WS/T641临床检验定量测定室内质量控制。在同时测定多的情况下，每个分析物都要有一条标准曲线。如果一个分析批中一个分析物可以接另一个分析物不能接受，建议评估失控分析物对同批次其他分析物结果的潜在失控原因具有特异性且不影响其他分析物，则可接受未失控分析物的数据被拒绝的分9.7.6室间质量评价/能力验证），样品结果