CN110923242B 一种大麻腺毛中分离的转录因子CsAPL1及其应用 （厦门梓蔓生物科技有限公司）

(10)授权公告号CN1109232(65)同一申请的已公布的文献号(73)专利权人厦门梓蔓生物科技有限公司地址361000福建省厦门市中国(福建)自由贸易试验区厦门片区海景东路18号4楼A13之3(72)发明人刘圆圆张熠平吕素娟(74)专利代理机构北京中政联科专利代理事务所(普通合伙)11489A01H5/00(2018.01)A01H6/28(2018.01)al..TetrahydrocannabinolicAcidPsychoactivity,isSStorageCavityofthe卷(第9期),姜颖等.大麻THCAPhysiol.》.2005,第46合成酶基因的克隆及生物信息学分析.《山西农业大学学报(自然科学版)》.2017,第37卷(第5期),M.DavidMarksetal..IdentifofcandidategenesaffectitetrahydrocannabinolbiosynthesisinCannabissativa.《JournalofExperimentalBotany》.2009,第60卷(第13期),PREDICTED:CannabissativaresponsivetranscriptionfactorRAP2-1-like(LOC115712195),mRNA.《Genbank》.2019,一种大麻腺毛中分离的转录因子CsAPL1及其应用本发明提供了转录因子CsAPL1及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明首次从植物大麻腺毛中分离了转录因子CsAPL1,其核苷酸序列IDNO:2所示。本发明经过功能性试验表明，转录因子CsAPL1能够与THCA合成酶(THCAS)基因启动子相互作用，从而在大麻素类化合物的合成中发挥激活作用，能够有效实现对大麻素类化合物合成的调控作用。21.大麻腺毛中分离的转录因子CsAPL1编码基因在调控大麻THCA合成中的应用，其特征在于，所述转录因子CsAPL1编码基因能够与编码THCA合成酶基因的启动子结合而正调控THCA合成酶(THCAS)基因的转录表达，其中，所述转录因子CsAPL1编码基因的多核苷酸序列如(a)或(b)所示：(a)、SEQIDNO:1所示的多核苷酸；或(b)、编码SEQIDNO:2所示氨基酸的多核苷酸。3技术领域[0001]本发明属于植物基因技术领域，具体涉及一种大麻腺毛中分离的转录因子CsAPL1及其应用。背景技术[0002]大麻(Cannabissativa)是大麻科大麻属一年生草本植物，雌雄异株，是人类最早麻的花、叶和根，可以提取其中的药用成分用于制药，也可以用作土壤肥料，起到杀虫防病及增加土壤有机质的功效；韧皮纤维可制成高档衣服，秆芯纤维可以用作造纸和建筑材料；子粒可作为食品和饲料，榨出的油可以作生物柴油。随着大麻的价值被深入挖掘，受到越来越多学科的关注，更多的国家也加入到大麻的研发中。中国是全球最大的大麻生产国之一，种植面积已达全球50%。[0003]大麻素(Cannabinoid)是大麻植物中特有的次生代谢产物，其主要成分是THC和CBD,二者互为同分异构体，其中THC具有致幻成瘾性，CBD则无致幻成瘾性。此外大麻植物包括至少120种大麻素，如大麻酚(CBN),大麻环萜酚(CBC),四氢大麻酚(THCV)以及大麻萜酚疫调节和抗炎抗氧化等方面具有重要的药用价值。此外，研究还发现大麻素具有治疗多种制药公司研制的Epidiolex(CBD含量高达98%)成为首个获FDA批准大麻药物，用于治疗儿国、加拿大等国家批准用于治疗疾病。CBD不仅引发了药品研发，同时它肤品、普通饮料和功能性饮料等方面的适用性，吸引着多家跨界巨头探索新型合作模式。然而，国内大麻主要应用于纺织纤维领域，大麻素药用研究几乎一片空白。中国的工业大麻主要集中于种植与CBD提纯，且提纯的CBD主要用于出口。目前，我国关于包括CBD在内的大麻素等大麻活性成分合成及调控机制的研究相比于欧美发达国家还相差甚远。[0004]转录因子(transcriptionfactor)是广大生物研究者关注的热点之一。转录因子是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。转录因子可以形成一个动态调控网络，控制次级代谢产物生物合成所需的基因表达的时间、幅度和空间分布。近年来，虽然已经发现了一些调节大麻素类化合物合成的转录因子，但还是有很多重要的转录因子尚未发现，而且转录因子的筛选与鉴定难度较大，研究转录因子参与基因表达调控的生物学过程具有十分重要的意义。发明内容[0005]本发明首次从植物大麻腺毛中分离了转录因子CsAPL1,其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明经过功能性试验表明，转录因4[0006]第一方面，本发明提供了一种大麻腺毛中分离的转录因子CsAPL1编码基因，所述转录因子CsAPL1编码基因的多核苷酸序列如(a)、(b)、或(c)所示：[0009](c)、与SEQIDNO:1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质具有CsAPL1转录因子功能。[0010]第二方面，本发明提供了所述转录因子CsAPL1编码基因编码的氨基酸，序列如SEQ[0011]第三方面，本发明提供了一种含有权利要求1所述的转录因子CsAPL1编码基因的重组表达载体。进一步地，所述重组表达载体是重组植物表达载体。[0012]同时，本发明还提供了含有本发明所述的重组表达载体的宿主细胞。[0013]第四方面，本发明提供了所述的转录因子CsAPL1编码基因在调控植物中大麻类化合物合成中的应用。[0015]进一步地，所述转录因子CsAPL1编码基因能够与顺式作用元件结合而启动植物大[0016]进一步地，所述转录因子CsAPL1编码基因能够与顺式作用元件结合而正调控植物大麻中的THCA合成酶(THCAS)基因的转录表达。[0017]本发明首先对实验材料-大麻进行种植，等到其成熟后对雌性大麻的腺毛进行分离，以及进行RNA的提取和实时荧光定量反转录pcr。在显微镜下观察分离的悬液，以确定腺毛与花的分离程度。[0018]转录因子的鉴定和转录活性测定包括构建大麻植株雌花的酵母单杂交cDNA文库方法、共转化诱饵菌株方法、同源重组筛选出THCAS启动子的上游转录因子方法、双荧光素酶报告基因检测方法、体内瞬时表达验证方法、实时荧光定量反转录pcr(qRT-PCR)方法及生物化学检测方法(如高效液相色谱UPLC),等其他方法进一步鉴定控制大麻素类化合物合成的转录因子。[0019]酵母单杂交(Yeastone-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-bindingdomainBD)和转录激活区(ActivationdomainAD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。[0020]cDNA文库(cDNAlibrary):是指某生物某一发育时期所转录的m形成的CDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。CDNA文库与基因组文库的最主要的区别是，基因组文库含有而CDNA文库不含非转录的基因组序列(重复序列等)。CDNA文库便于克隆和大量扩增，可以从中筛选到所需目的基因，并用于表达。不论是由细胞总DNA建立5行筛选，直到获得目的基因。以mRNA为模的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。[0021]验证实施例：荧光素酶报告基因实验(luciferaseassay)是检测转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：(1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。(2)将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。(3)加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。[0022]进一步地，本发明公开了一种通过体内瞬时表达验证的方法技术鉴定该转录因子[0023]体内瞬时表达验证(Transientexpression):外源基因进入受体细胞后，未整合进受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物。体内瞬时表达验证是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的一种重要手段，与传统的转基因相比，瞬时表达不生物安全性高。进一步地，本发明公开了一种通过实时荧光定量反转录pcr(qRT-PCR)方法检测该转录因子CsAPL1的的表达情况。[0024]实时荧光定量反转录pcr(qRT-PCR)方法是对mRNA进行定量的方法。该方法可用于对内源性基因表达的mrna进行定量检测，并可用于基因表达的定量研究，该方法是目前最行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关[0025]进一步，实时荧光定量反转录pcr(qRT-PCR)方法的步骤是：(1)提取大麻腺毛中的[0026]高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC)又称“高压法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进法检等学科领域中重要的分离分析技术应用[0027]与现有技术相比，本发明提供的转录因子CsAPL1编码基因与大麻中大麻素类化合物的合成具有很密切的关系，可用于调节大麻中大麻素的合成。附图说明[0028]图1实施例1中不同的植物器官对GUS报告基因的表达分析图，其中图a:6天大的幼6[0029]图2实施例2中酵母杂交图，其中Pro53和ProTHCAS-P53分别为阳性对照及阴性对[0030]图3实施例3中Pro35S:APL1-EYFP以及Pro35S:EYFP的细胞定位图。[0031]图4实施例4中CsAPL1转录激活活性验证，其中4a为载体构建结构示意图，图b为基因表达量检测柱状图。[0032]图5实施例5中CsAPL1与植物中的THCAS启动子相互作用验证结果图，其中图5a为载体构建结构示意图，图5b为基因表达量检测柱状图。[0033]图6实施例6中大麻植物7周龄雌花不同生长发育时期检测图。[0034]图7实施例7中不同阶段发育中的花中THCAS,CsAPL1表达量柱状图，以及不同阶段发育中的花中THCA,大麻二酸(CBDA),大麻具体实施方式[0035]下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。[0036]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的实施例是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。其中，所使用的化学试剂除非有特别说明，其均为本领域的技术人员所理解常规使用试剂。[0038]用基因特异性引物对548bp的THCAS启动子进行克隆，利用Gateway技术构建双元基因株系进行分析。用不同的植物器官对GUS报告基因的表达进行了组织化学分析，结果如的毛状体中检测到GUS活性(图1g,h)。[0040]利用酵母单杂交技术对靶向结合序列进行筛选，在酵母载体pAbAi中AUR1-C基因上游的MCS(KpnI(5’)和XhoI(3’)中克隆了用于GUS表达测定的相同THCAS启动子片段。AUR1-C基因是一种抗真菌抗生素耐药性基因。构建的载体结构为ProTHCAS-AbA,通过BstBI酶进行消化切割，并根据说明书使用PEG介导的转化方法转化为Y1HGold酵母菌株。以pAbAi的URA3基因为选择标记，将其整合到Y1HGold酵母菌株的无功能的ura3位点中。在缺乏合成葡萄糖培养基上选择转化体，并在菌落PCR中进行验证。以Y1HGold-ProTHCAS-ABA为材从图中可以看出CsAPL1可以与THCAS启动子相互作用。[0042]为了确定CsAPL1的亚细胞定位，将全长CsAPL1编码区与全长增强型黄色荧光蛋白7(EYFP)融合在一起。CsAPL1-EYFP融合构建体以及EYFP芥叶中分离的原生质体中瞬时表达。仅在细胞核中观察到了CsAPL1-EYFP(图3),这与其作为转录因子的作用是一致的。[0044]为了测试植物中CsAPL1的转录激活活性，采用了双重荧光素酶测定法。将含有萤火虫(Photinuspyralis)荧光素酶基因(LUC)的报告质粒在带有GAL4结合位点的启动子(ProGAL4:LUC)的控制下与效应质粒共转化，Pro35S:GAL4结合域(GD,阴性对照)或GD与单纯疱疹病毒VP16激活域的融合(GD-VP16,阳性对照)或7个全长CsAPL1(GD-CsAPL1)从拟南芥叶中共转化为原生质体(图4a)。报告质粒ProGAL4:LUC与效应质粒GD-VP16的共转染引起强烈的LUC活性，而与仅含GD的效应子的共转染则导致LUC报告基因表达水平降低。ProGAL4:LUC与GD-CsAPL1的共转染显示出比单独的GD更强的LUC活性(图4b)。这表明当被[0046]为了确定CsAPL1是否影响植物中的THCAS启动子，我们将原生质体与ProTHCAS:LUC报告质粒和Pro35S:GFP-CsAPL1或Pro35S;GFP效应质粒和瞬时荧光素酶活性。相对于阴性对照，Pro35S:GFP,GFP-CsAPL1的表达引起了ProTHCAS定向的荧光素酶活性的增加(图[0048]在大麻营养生长过程中，在24±2℃光照下生长18h,然后转移到24±2℃光光周期中诱导开花。在大麻植株生长的不同阶段中，腺毛的种类和其中大麻素类化合物的含量也会有所不同。腺毛种类的观察和腺毛中大麻素类化合物含量的检测，对于研究调控大麻素类化合物的转录因子以及定向调节大麻素的合成具有重大的意义。因此，根据大麻腺毛数量，对大麻植株的不同生长阶段做出了区别，并用尼康SMZ18型立体显微镜对7周龄雌花进A-F=1mm,花萼大小的增加说明了新出现的花蕾向完全成熟的花的发育。[0049]通过定量RT-PCR测量在六个阶段的每个阶段中发育中的花中THCAS,CsAPL1的表超高效液相色谱(UPLC)分析。随着雌花的成熟，检测到THCA和大麻二酸(CBDA)的增加(图7c、7d),而在此过程中大麻二酚(CBGA)的含量降低(图7e)。[0050]以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。CN110923242B序列表1/2页8[0002]<110>厦门梓蔓生物科技有限公司[0003]<120>一种大麻腺毛中分离的转录因子CsAPL1及其应用[0010]<213>大麻(Cannabissativa)[0012]atggaagga[0013]cggaagt[0015]gatgatgatcagaagagccgaccgta[0016]gtggcagagattagggagccaaacaagaggtctcggattt[0017]ccaatagcagcggcacgcgcttacgacacc[0018]cggctaaact[0020]accgcccaagctgata[0021]tcgtttaaggccgacctaaaccagtacccggaccccgatgattccga[0026]<213>大麻(Cannabissativa)