《生物化学(第2版)》教学课件04-核酸化学

第四章核酸化学一、核酸的发现:1869年，瑞士生物学家Miescher（米歇尔）从外科手术绷带上脓细胞的细胞核中分离出来的白色微酸性有机物—“核素”，即后来的DNA。二、核酸的类别、分布和功能第一节概述原核：裸露的核DNA分子、质粒DNA（原核生物细胞内存在于核

DNA外，能够独立自主地进行复制并稳定遗传的双链环状DNA分子。）真核：细胞核DNA：与组蛋白、非组蛋白形成染色体细胞器DNA：双链环形，一般裸露1.类别：DNA和RNA2.分布：RNA主要分布于细胞质，对于DNA：3、功能：直接证据：1944，O.Avery（艾佛利）肺炎双球菌转化实验1952，A.DHershey和M.Chase（赫尔希，蔡斯）噬菌体感染实验（2）RNA的功能——参与蛋白质的生物合成（1）DNA是主要的遗传物质肺炎球菌转化实验S型：细菌有荚膜，菌落光滑，毒性菌株R型：细菌无荚膜，菌落粗糙，非毒性菌株（2）RNA的功能——参与蛋白质的生物合成mRNA信使tRNA（运载氨基酸）核糖体核糖体蛋白（r蛋白）rRNA（转肽酶活性）细胞中其他种类RNA:1.核内不均一RNA（hnRNA）:成熟mRNA的合成前体2.核小RNA（snRNA）:参与RNA修饰加工及基因表达调控短干扰RNA或沉默RNA，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。3.小干扰RNA（siRNA）4.小激活RNA（saRNA）5.RNA组学：研究细胞中全部RNA基因和RNA分子的结构和功能。saRNA能识别基因启动子上特定序列、诱导相应基因的转录,从而实现基因激活.第二节核酸的化学组成核酸（多聚核苷酸）水解n核苷酸

磷酸核苷戊糖碱基1、核酸中的戊糖:β-D-呋喃戊糖核酸的元素组成：C、H、O、N、P（9-10%），不含S核酸的基本组成单位：单核苷酸2、碱基（1）嘌呤（Purine）123456978腺嘌呤AdenineA鸟嘌呤guanineG（2）嘧啶（Pyrimidine）123456胸腺嘧啶thymineT尿嘧啶uracilU胞嘧啶cytosineC

核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。5-甲基胞嘧啶(m5C)5-羟甲基胞嘧啶(Om5C)次黄嘌呤（I）核苷是核糖或脱氧核糖与嘌呤或嘧啶碱基生成的糖苷。N-糖苷键:在嘌呤核苷中均为C1ˊ-N9，嘧啶核苷酸中的糖苷键为C1ˊ-N11'2'3'4'5'(OH)3、核苷1'2'3'4'5'(OH)5C假尿苷（假尿嘧啶核糖糖苷，ψ）4、核苷酸：核苷的磷酸酯（A、U、G、C）（A、T、G、C）核苷酸的其他表示方法：5ˊ-核苷酸——pA，pT，pG，pC，pU。3ˊ-核苷酸——Ap，Tp，Gp，Cp，Up。游离的2ˊ-核苷酸较少，用Gp2ˊ表示相应的2ˊ-核苷酸。核苷酸的命名:-P109二磷酸核苷酸和三磷酸核苷酸：~~环化核苷酸激素第一信使。许多激素通过环化核苷酸起作用，所以称为第二信使，它们是重要的代谢调节物质。3ˊ,5ˊ-环化腺苷酸（cAMP）和3ˊ,5ˊ-环化鸟苷酸（cGMP）在调节中有相互制约关系。第三节核酸的分子结构一、DNA的一级结构由数量极其庞大的四种脱氧核糖核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通过3′,5′-磷酸二酯键连接起来的直线形或环状多聚体。直线形多聚核苷酸链具有方向性:5′

3′。通常5′-端为磷酸基团，3′-端为-OH。3′5′DNA分子大小的表示：

通常一个染色体中就是一个DNA分子（通常为双链），最大的染色体DNA可超过108bp—也表示为100Mb、105Kb人类基因组大小为3.2Gb（3.2X109b），大约能为31000个蛋白质编码。实际上，编码序列只占基因组的1.1%到1.4%。DNA的二级结构DNA的三级结构DNA与蛋白质复合物结构二、DNA的空间结构（一）DNA的二级结构1953年由美国科学家J.D.Watson(1928--)和英国科学家F.Crick（1916—2004）提出DNA双螺旋结构模型。在发表DNA双螺旋结构论文后不久，《自然》杂志随后不久又发表了克里克的另一篇论文，阐明了DNA的半保留复制机制。（3）已知核酸化学结构和核苷酸键长和键角等1、双螺旋结构模型建立和提出主要有3个依据（a）通常不同的物种，其DNA碱基组成不同。（b）同一物种的不同组织，其DNA碱基组成相同（c）在特定的物种中，其DNA碱基组成不随机体年龄、营养状况或所处环境的变化而变化。（d）在所有生物DNA中，A-T，G-C

嘌呤总数等于嘧啶总数：A+G=C+T英国威尔金斯（Wilkins）和弗兰克林（Franklin）发现不同来源的DNA纤维具有相似的X-射线衍射图谱。这说明DNA可能有共同的分子模型。并从图谱分析DNA呈螺旋状结构。（1）查加夫定则-P112（2）对DNA纤维的x-晶体衍射分析2、Watson-Crick结构模型要点1.构架：3.碱基配对规律：2.成分排布：4.结构参数：两链反向平行链沿同一中心轴缠绕，且均为右旋。表面形成一个大沟和一个小沟A=T（两个氢键）,G≡C（三个氢键）

糖-磷酸主链构成亲水骨架在螺旋外侧，碱基对平面在内侧，它们是疏水性的，且平面与螺旋轴垂直。双螺旋平均直径2nm，两个核苷酸之间的夹角为３６°，每螺旋上升含有10个碱基对，螺距为3.4nm，。5.碱基顺序：根据碱基互补原则，可以由一条链的碱基顺序

推知另一条链的碱基顺序。★磷酸与脱氧核糖通过3ˊ、5ˊ-磷酸二酯键相连接，构成DNA

分子的骨架。★磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，碱基位于双螺旋的内侧。

A=T,G≡CGCAT★碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行★两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。★两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5ˊ→3ˊ，另一条3ˊ→5ˊ★每圈螺旋碱基数10bp，碱基堆积距0.34nm，双螺旋平均直径2nm，★大沟：宽1.2nm，深0.85nm，★小沟：宽0.6nm，深0.75nm3、稳定DNA双螺旋的力(3)离子键（盐键）-磷酸核糖骨架上负电荷的中和DNA分子在生理pH下带负电荷

环境中带正电荷的Na+、K+、Mg2+、Mn2+等离子，原核生物细胞内带正电荷的多胺类，真核细胞中带正电荷的组蛋白等，均可与磷酸基团结合，消除静电斥力，对稳定核酸的结构有重要的作用。(1)互补碱基之间的氢键(2)碱基堆积力：相邻碱基平面间在垂直方向上通过疏水相互作用和范德华力相互堆叠在一起。DNA结构的多态性：B-DNA、A-DNA、Z-DNAWatson-CrickDNA结构也称为B-型DNA，在生理条件下，B型是最稳定的结构。Z-DNA最早是在体外得到的一种双螺旋。后在原核和真核生物中也发现存在一些短片段的Z-DNA。Z-DNA为左手螺旋在基因表达调控或遗传重组中，可能有重要作用。参见南京大学杨荣武-P95~97的描述A-DNA仍为右手螺旋主要出现在RNA-DNA杂交分子中；对基因表达有重要意义。（二）DNA的三级结构（超螺旋结构）1、DNA的三级结构：主要是指双螺旋DNA分子的扭曲或再螺旋形成的构象——即超螺旋。（1）负超螺旋：对于共价封闭环形DNA分子（原核生物），或两端固定的DNA分子（真核生物线性DNA与蛋白质结合后），放松双螺旋后，则超螺旋的螺旋方向是右手螺旋，称负超螺旋（２）正超螺旋：对于环形DNA分子，或两端固定的DNA分子，旋紧双螺旋后，则超螺旋的螺旋方向是左手螺旋，称正超螺旋。（三）DNA与蛋白质复合物结构真核细胞的DNA存在于染色质结构中

染色质的基本结构单位是核小体（核粒）由DNA分子在组蛋白核心外面缠绕约两圈（1.75）根据所含碱性氨基酸的比例不同，组蛋白分为H1，H2A，H2B，H3和H4五类。核小体的核心含H2A、H2B、H3和H4各两分子。连接的DNA片段结合一分子H1—锁住DNA“进、出口”。真核染色体组装——多级螺旋模型图2nm11nm的核小体“念珠”30nm纤维300nm700nm1400nm蛋白质和DNA螺旋结构的主要差别蛋白质的α-螺旋DNA双螺旋1、单链1、双链2、中间为空心2、实心3、R-基团伸向螺旋的外部3、碱基堆积在螺旋内部4、大多数为局部螺旋4、整个分子均为螺旋（都以右手螺旋为主）三、RNA的结构一级结构：单链线型分子二级结构：局部双螺旋（茎环结构多见）三级结构：二级结构基础上进一步折叠四级结构：核蛋白复合物（一）RNA的一级结构-P112由四种核苷酸（AMP、GMP、CMP、UMP）通过3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键连接起来的直线形多聚体。mRNA约占细胞总RNA的3％～5%，数量少，但种类多；平均长度为1000-1500个核苷酸。1、原核mRNA的结构特点（1）原核mRNA一般为多顺反子。即一条mRNA链上有多个编码区。（2）每个顺反子编码区AUG之前有一段多嘌呤区，称为SD序列（3）原核mRNA代谢很快，代谢半衰期一般以秒计，很少达到10min以上。（4）结构模式：起始序列终止序列2、真核mRNA的结构特点（1）真核mRNA都是单顺反子（2）真核mRNA5ˊ端有帽子结构，3ˊ端有多聚腺苷酸尾巴（PolyA）（3）真核mRNA起始密码子AUG之前没有SD序列（4）真核mRNA代谢很慢，即代谢半衰期一般较长。如兔珠蛋白mRNA可以存在几天。（5）结构模式：AUGUGAUAAUAG编码区5ˊ非翻译区3ˊ非翻译区capAA(A)n真核生物mRNA的5＇端帽子结构m7G5ˊppp5ˊNp——称为O型帽子（末端核苷酸的核糖

2ˊ-OH未甲基化）m7G5ˊppp5ˊNmpNp——称为I型帽子（末端1个核苷酸的核糖2ˊ-OH甲基化）m7G5ˊppp5ˊNmpNmpNp——称为II型帽子（末端2个核苷酸的核糖2ˊ-OH甲基化）m7GHOHOOCH3OCH3OHOHOHN1N2N3N4PPP3＇N5pppOHOH3＇OHP5＇5＇思考：1.真核生物mRNA的帽子结构中，m7G与多核苷酸链通过三个磷酸基连接，连接方式是（）（a）3ˊ-5ˊ（b）2ˊ-5ˊ（c）3ˊ-3ˊ（d）5ˊ-5ˊ2.真核生物成熟mRNA的两端均带有游离的3ˊ-OH。对吗？

I型帽子——m7G5ˊppp5ˊN1mpN2p75ˊ5ˊm帽子结构可能的作用：1.抗5′-核苷酸外切酶降解作用。2.在蛋白质合成中有助于核糖体对mRNA的识别和结合，

使翻译得以正确起始。PolyA尾3ˊ-端有一段约20-250核苷酸的polyA：（1）转录后由poly(A)聚合酶催化加尾（2）PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。（3）polyA与mRNA寿命有关，PolyA大大提高

mRNA在胞质中的稳定性。（二）RNA的二级结构1、tRNA的二级结构tRNA一般由70-120个核苷酸组成，平均沉降系数为4S，约占细胞RNA总量的15％，分子内含有稀有碱基及胸腺嘧啶核苷、假尿嘧啶核苷等。tRNA的三叶草型二级结构主要特征：四环四臂1.氨基酸臂：携带氨基酸2.D环：识别氨酰tRNA合成酶，相应的臂称为D臂。3.反密码子环：识别密码子，反密码子臂。4.可变环：分类的主要依据5.TψC环：与核糖体结合，因环中有TψC序列而得名TψC臂：氨基酸臂可变环TψC环反密码环D环3＇5＇tRNA的三级结构呈倒L型（三）核蛋白体RNA（rRNA）核糖体由约40%的蛋白质和60%rRNA组成，rRNA占细胞RNA总量的80%左右E.coli16SrRNA的结构原核生物和真核生物核糖体的比较

原核生物

真核生物

核糖体

rRNA核糖体

rRNA30S70S{50S16S5S\23S40S80S{60S18S5S\5.8S\28S第四节核酸及核苷酸的性质一、物理性质1、溶解性：不溶于乙醇、乙醚、氯仿等2、分子大小：DNA相对分子质量106以上，RNA一般1~10万,其大小可用bp或s等表示。3、形状和黏度：线性DNA粘度大，RNA要小很多二、核酸和核苷酸的两性解离1、酸性解离基团：磷酸基团，供出质子，带负电荷2、碱性解离基团：碱基的解离胞嘧啶碱基的解离：N3上的电子云密度比较高HO-OPk2=12.2

胞嘧啶上的烯醇式羟基与酚基类似，具有酸性，可以释放氢离子。因此在水溶液中胞嘧啶的中性分子、阳离子和阴离子之间处于一定的平衡关系。尿嘧啶和胸腺嘧啶不能进行碱性解离尿苷酸、胸腺嘧啶核苷酸不是两性化合物。O(-CH3)O(-CH3)P-O-H2CHO-OHOO腺嘌呤碱基的解离：N1上的电子云密度较高鸟嘌呤的解离：N7上的电子云密度较高Pk2=9鸟嘌呤第六位烯醇式羟基的pKa约为9-OH5种核苷酸的解离常数（pK）——课本p121：碱基烯醇式羟基第一磷酸基第二磷酸基腺苷酸鸟苷酸胞苷酸尿苷酸胸腺苷酸3.72.34.24———9.33—9.4310.00.890.70.81.021.66.015.925.975.886.5核苷酸分子中，由于糖和磷酸的存在，使碱基的解离变得容易了。pK值比游离碱基小。P-O-H2CHO-OHO核苷酸的等电点：（以胞苷酸为例）P-O-H2C-O-OHO0.8PK2′=4.24P-O-H2C-O-OHOP-O-H2C-O-O-OPK3′=5.97pI=PK1+PK22等电点时，带一负电荷的磷酸基与带正电荷的含氮环数目相等。核苷酸的等电点偏酸性。尿苷酸和胸腺嘧啶核苷酸不能形成兼性离子。核苷酸的解离曲线：

核苷酸具有较强的酸性，磷酸和碱基均能发生解离。因此，核苷酸为两性电解质。它们在不同pH溶液中解离程度不同，如图：尿苷酸、胸腺嘧啶核苷酸不能形成兼性离子。DNA等电点：4-4.5RNA等电点：2-2.5核酸等电点偏酸，在中性及碱性溶液中呈阴离子状态。P-O-H2CH-O-OHO不同碱基的紫外吸收光谱不同三、紫外吸收性质-P121核苷、核苷酸、DNA和RNA的紫外吸收谱均为240~290nm，都是由于碱基的共轭双键引起，其最高吸收峰接近260nm。DNA的紫外吸收谱光吸收（A）波长/nm1是天然DNA;2是变性DNA；3是核苷酸总吸收值1、鉴定DNA和RNA的纯度纯的DNA：A260/A280应大于1.8；纯的RNA：A260/A280

应达到2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、对纯核酸样品的定量测定-P122

只要测出260nm的A值，即可计算含量。通常以A值为1相当于50µg/mL双螺旋DNA,或40µg/mL单链DNA(或RNA),或20µg/mL寡核苷酸。核酸的紫外吸收与溶液的pH有关四、DNA的变性、复性与分子杂交1.变性的概念

注意与核酸降解的区别：(一)核酸的变性2.DNA的变性过程加热骤然冷却核酸的变性主要指DNA的变性。

3.引起核酸变性的因素（1）温度（热变性）（2）酸碱变性

高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力,pH﹥11.3时,DNA完全变性,pH﹤5.0时，DNA易脱嘌呤。（3）盐离子浓度

DNA在1moI/L的NaCI溶液中稳定。在纯水溶液中易变性。（4）变性剂(尿素，甲酰胺等)

破坏氢键，妨碍碱基堆积。4.变性后核酸性质的改变（1）生物活性丧失（2）增色效应（3）黏度降低，超速离心沉降系数变大，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变等浮力密度:

通过用氯化铯等密度梯度离心法（平衡密度梯度法）所求的高分子物质的密度。即介质密度代表浮力密度。5.热变性的特点及Tm值

DNA变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。通常把DNA双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔解温度（Tm）或称熔点。

DNA的Tm值一般在70℃～85℃之间。

6、影响Tm的因素（5）变性剂（1）DNA的均一性均一性愈高的样品，熔解过程愈是发生在一个很小的范围内。（2）G-C对含量（3）溶液的离子强度（4）溶液的pH温度Tm/℃020406080100708090100110Tm/℃Tm与碱基含量的关系G+C含量/%经验公式为：G-C％=（Tm-69.3）×2.24（二）核酸的复性（退火）1、含义：2、减色效应：3、影响复性速度的因素(1)单链片段浓度大，复性速度快。(2)较大的单链片段扩散困难，链间错配频率高，复性较慢。(3)片段内的重复序列多，容易形成互补区，复性较快。（4）维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度。

（三）核酸的分子杂交

将不同来源的DNA变性，若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则退火条件下能形成DNA-DNA异源双链，或将变性的单链DNA与RNA经复性处理形成DNA-RNA杂合双链，这种过程称为分子杂交。此方法由英国科学家EdwinMellorSouthern（埃德温·迈勒·萨瑟恩）于1973年发明。以DNA-DNA杂交为例介绍Southern印迹杂交（Southernblotting）Southern印迹法Northern印迹法（Northernblotting）也称RNA印迹技术。是将RNA变性后转移到纤维素膜上，再用互补的,具有放射性标记的RNA或DNA探针与其杂交。为了与DNA印迹法(southern印迹法)区别,叫Northern印迹法。被广泛用于检测mRNA的大小和丰度。例题：Southern印迹法，Northern印迹法和Western印迹法是分别用于研究(

)、(

)和(

)转移和鉴定的常规技术。Western印迹是将蛋白质转移到膜上，然后进行检测的方法。分子杂交应用领域：1.基因定位：原位杂交2.从核基因中钓出目的基因3.亲子鉴定4.刑侦领域5.诊断探针用于筛查遗传病五、核酸的酸解、碱解与酶解1.酸解：当pH˂5时，易脱嘌呤，再低，脱嘧啶；核酸变性，甚至断链。2.碱解：RNA水解产生2ˊ-核苷酸和3ˊ-核苷酸；DNA不水解，但变性。3.酶解：详见第十二章内容OH-OH-3ˊ-磷酸酯2ˊ-磷酸酯思考：某一试管中含有RNA和DNA,现加入稀的NaOH，室温保持24小时后，（）被水解了。第五节核酸的分离提取和纯化一、核酸分离提取的一般原理和方法非活性核酸的制备（核酸的工业化生产）活性核酸的制备—127对于活性核酸的制备应防止降解和变性,要保持核酸分子的完整性1、避免剧烈搅拌或过多的溶液转移，以防核酸分子断裂。2、细胞破碎前加EDTA或SDS，防止胞内核酸酶的水解作用。3、防止过酸过碱，以防核酸分子的降解。2、DNP再以苯酚抽提，除去蛋白质（反复几次）（也可用氯仿-异戊醇，或SDS）3、在有一定盐存在下，加二倍体积的冷乙醇，沉淀DNA，用乙醚或乙醇洗涤后干燥。4、DNA制品中的少量RNA用纯的RNase分解除去。1、利用DNP的溶解性分离DNPDNP是染色体DNA与组蛋白结合成的核蛋白。DNP溶于水和浓盐溶液（如1mol/LNaCI），但不溶于生理盐溶液（0.14mol/LNaCI）也可用氯化铯密度梯度离心制备DNA（一）DNA的分离制备核酸的分离提取大致包括：细胞破碎、胞内核酸酶失活、目的核酸的分离等步骤。（二）RNA的分离制备目前常用的RNA分离方法：1.酸性胍盐或SDS/苯酚/氯仿抽提:取水相，加乙醇沉降2.用胍盐或SDS/氯化铯密度梯度离心制备RNA要防止RNase的降解，注意如下三点：1、器皿要高温处理或用DEPC（0.1%焦碳酸二乙酯）除去RNase。2、破碎细胞的同时加入强变性剂使RNase变性,或加热变性。3、RNA反应体系中加入RNase抑制剂二、核酸的纯化分析DNA时，常用氯化铯密度梯度。（1）核酸密度的测定1.超速离心将DNA溶于