牙周炎体外研究模型的进展2026

牙周炎体外研究模型的进展2026牙周炎是一种由牙周致病菌引起的慢性、炎症性、破坏性疾病，其特点是牙齿周围支持组织的破坏，最终导致牙齿松动脱落［1］。牙周炎已被证实与糖尿病、心血管疾病、阿尔茨海默病和类风湿关节炎等多种系统性疾病相关［25］，牙周炎也因此成为全身性疾病难以控制的重要因素。有研究表明1990至2017年亚洲国家牙周炎的发病率有所上升，并趋向于年轻化［6］。在保存天然牙及以口腔健康促进全身健康的背景下，如何有效治疗牙周炎成为研究热点。目前，牙周炎相关研究中，绝大部分采用的是动物模型或细胞模型，在预测和评估新药对牙周炎的作用及其机制中，通常首选动物模型［7］。但由于动物模型成本高昂、耗时较长、存在物种差异等，在牙周炎研究中有一定的局限性［8］。相对于动物模型，体外模型成本低、研究可重复性高、效率高，在分子层面的研究中具有明确的优势［9］，建立合适的体外模型将有助于探索牙周炎发病机制及其潜在治疗靶点。本文对目前已成功建立的牙周炎体外模型进行综述，以期助力研究者在体外真实模拟牙周炎微环境，探索其发病机制及筛选有效治疗牙周炎的靶向药物，为牙周组织再生提供理论基础。一、生物膜模型牙周炎是一种细菌感染性疾病，菌斑微生物间的相互作用引起的口腔微生态失衡是牙周炎发生发展的关键因素，可直接引起宿主牙周组织的损伤，并持续存在于宿主牙周组织中，引起牙周组织的长期炎症和破坏［1011］。然而，绝大多数微生物导致牙周组织破坏的机制仍然未知，体外生物膜模型的建立有利于探索菌斑微生物间的相互作用、评估新型抗菌药物等。1.静态生物膜模型：目前构建体外生物膜模型尚无统一标准，但模型构建方法已较为完善且系统。其中，静态生物膜模型是牙周炎研究中使用最广泛的体外模型，包括微量滴定板模型、卡尔加里生物膜模型、苏黎世龈下生物膜模型、阿姆斯特丹主动附着模型等，这些模型多通过将微生物接种于羟基磷灰石（hydroxylapatite，HA）圆盘、玻片、钛及钛合金盘，或微生物主动附着于倒钉形成生物膜［1213］。不同载体形成的生物膜厚度、结构存在一定差异。由Guggenheim等［14］开发的苏黎世龈下生物膜模型最为常见且成熟。该模型将10种牙周炎相关致病菌菌液，等体积混合后接种于含60%人唾液的培养基包被的HA圆盘，厌氧培养64h后获得具有分层结构的生物膜。尽管该模型采用了10种具有代表性的牙周炎致病菌，但并不能完全反映牙周炎患者复杂的口腔微生物环境。从患者口内采集菌斑样本构建的生物膜能在最大程度上接近复杂的口腔微生物环境，但该方法也存在取样伦理问题，以及个体差异性、位点特异性、重复性欠佳等局限性［15］。2.动态生物膜模型：理想的生物膜模型应能模拟包括唾液流、氧张力、温度、pH等在内的口腔微生态环境。尽管静态生物膜模型成本低、易于构建，但细菌大量代谢产物沉积于载体可能加速或抑制其他微生物的生长。而动态生物膜模型利用化学恒流系统，如生物反应器、流动池、微流体通道和趋化恒温器等，可提供恒定的营养供应，避免代谢废物堆积，以高度可控的方式模拟体内的pH、温度、唾液和龈沟液的剪切力等，从而为抗菌药物的测试提供了更为准确的平台［16］。其中，生物反应器常被广泛用于模拟动态条件下生物膜的生长，由流动系统、生物反应器及Robbins装置（唾液包被的HA圆盘）构成的动态生物膜模型，其原理是利用生物反应器控制温度、pH及氧浓度等，通过蠕动泵以恒定的压力将含细菌的培养基泵入Robbins装置，形成高度可重复的多物种生物膜模型，并能维持生物膜长达7d的生长［17］。有研究者在生物反应器中形成菌斑生物膜，用流动系统模拟龈沟液的流动，评估阿莫西林的药代动力学和药效动力学，测试其对生物膜的抗菌作用，结果表明阿莫西林处理导致生物膜外层细菌大量死亡。然而用相同浓度的阿莫西林处理静态苏黎世生物膜模型，并未显著降低总细菌量。这说明静态模型可能低估药物的抗菌能力，而动态模型能更准确地模拟体内药物浓度对生物膜的影响，可为抗菌药物的评估提供更高效的平台［18］。静态生物膜模型成本低、易于构建、允许大量生物膜形成，但存在营养物质和代谢产物沉积的不足；与静态模型相比，动态模型中的生物膜更符合体内环境，但成本较高昂，仪器设备操作相对复杂。二者各有优缺点，体外生物膜模型的构建方法还需研究者根据自己的研究目的、研究计划择需而定。二、细胞模型炎症状态下细胞行为改变常常影响牙周组织的再生修复，简单的细胞模型是理解牙周生物学的基础，利用细胞模型可以监测生理、病理状态下牙周组织中生物活性分子的表达，探索牙周致病菌如何作用于组织并导致组织破坏的过程等，是模拟疾病进展和干预治疗的有效工具［19］。1.单细胞模型：牙周膜干细胞作为组织工程常用的种子细胞，具有自我更新、多向分化的潜能，在牙周组织再生领域具有较好的应用前景［20］。牙龈成纤维细胞（gingivalfibroblasts，GF）在牙周组织中含量较为丰富，其存在有利于维持牙周组织结构和功能的完整，GF可不受控制地激活或过度凋亡，其可能导致慢性炎症持续并促进牙周组织破坏性进展［21］。在牙周炎症期间，巨噬细胞过度激活、极化将导致骨稳态失衡，造成牙槽骨吸收，探索炎症环境下巨噬细胞极化、增殖功能的调节将有利于维持牙周炎骨稳态平衡［22］。大部分研究常以牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis，Pg）及其毒力因子脂多糖作为刺激处理以上3种细胞，研究炎症状态下细胞增殖、分化的分子机制，测试药物逆转炎症状态的效果等［2325］。用于构建体外细胞模型的刺激因子还包括肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNFα）、白细胞介素1β（interleukin1β，IL1β）等。TNFα与IL1β都属于多效性促炎细胞因子，二者被认为是诱导附着丧失、破骨细胞活化和牙槽骨吸收的主要因素［26］。目前已有大量研究用TNFα、IL1β作为刺激因子构建细胞模型，证实牙周炎症与丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶B、Wnt/β连环蛋白和核因子κB信号通路相关，并明确了某些天然提取物如槲皮素、陈皮素等可靶向作用于牙周炎相关信号通路，逆转牙周组织的破坏［2729］。2.共培养模型：牙周炎发生发展中许多分子机制都涉及细胞与细胞之间的相互作用，单细胞模型无法模拟宿主体内多细胞串扰，不能准确代表宿主反应，往往高估牙周致病菌的毒力及牙周治疗药物的疗效。因此，多细胞共培养模型可更好地代表宿主体内反应。鉴于上皮细胞、巨噬细胞在牙周炎发生发展中的多功能作用，Bodet等［30］构建了比例为1∶100和1∶5的巨噬细胞/上皮细胞共培养物，并用脂多糖刺激检测细胞因子的产生，结果发现1∶100的共培养物检测到的促炎因子比1∶5少，这说明巨噬细胞的积累可增强促炎因子的分泌。牙周病原体与上皮细胞、GF之间的相互作用有广泛的研究，但细菌与干细胞间的相互作用却尚未明确。Kriebel等［31］首次将上皮细胞、间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）在厌氧条件下共培养，探索MSC对Pg刺激的反应，结果发现在与MSC共培养中，分泌的促炎因子较牙龈上皮细胞模型少，这可能与MSC免疫调节功能有关；细菌的黏附和侵袭也显著降低，表明MSC对细菌感染的耐受性更强，更适合用于体外模型的构建。此外，transwell共培养模型在研究细胞通信中也较常见，Bates等［32］将树突状细胞添加至12孔板底部，将牙龈角质形成细胞置于中间，T细胞添加至顶部，三者通过可渗透膜分隔，以防止细胞间相互接触，但允许细胞因子等小分子在细胞层之间移动，以Pg的血凝素B（hemagglutininB，HagB）作为促炎激动剂，比较HagB诱导的共培养模型和单细胞模型的基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMP）反应，发现相对于单细胞模型，3种细胞共培养模型的MMP反应明显减弱，这些结果表明应用多细胞类型反映细胞间相互作用的必要性，有助于更好地了解牙周炎症发生发展的过程并有针对性地开发新的治疗策略。细胞模型因其简单、价廉、可重复，在牙周炎研究中的应用非常广泛。单细胞模型常用于探索牙周组织中细胞的增殖、分化等，单一细胞构建的体外模型可快速获取结果，但由于缺乏细胞间的相互作用，具有一定的局限。而多细胞共培养模型可模拟细胞间通信，弥补了单细胞模型的不足，但由于无法得知体内细胞的比例，因此也难以完全模拟体内反应。三、牙龈组织模型尽管二维细胞模型在研究分子机制层面具有简单、直观的优势，但无法模拟天然牙龈组织复杂的结构和功能，难以准确代表宿主对病原微生物刺激的响应。三维牙龈模型介于细胞模型和动物模型之间，相比细胞模型，三维模型可以更准确地模拟自然组织、器官的生理状态，反映细胞间信号传导，又避免了使用动物模型高昂的成本，为研究牙周组织与微生物间的相互作用、免疫反应及炎症反应相关信号通路提供了更准确的平台，有利于新型牙周炎靶向治疗药物的开发［33］。1.静态牙龈模型：从最初的单层上皮组织或结缔组织，进化到人源化细胞构建的全层三维牙龈组织模型，牙龈组织模型在牙周炎的研究中越来越成熟。牙龈组织模型常由细胞和支架两部分构成，用于构建牙龈模型的牙龈上皮细胞和GF，包括原代细胞、永生细胞系。原代细胞形成的分层上皮在解剖生理上近似牙龈组织，但存在活检标本有限、易污染等问题，而永生细胞系在保持牙龈组织解剖特点的同时，克服了原代细胞易衰老、依赖新鲜牙龈组织供应的问题［34］。牙龈组织模型构建的另一个关键要素是为细胞提供支架的基质，理想的基质应具有良好的生物相容性、孔隙率、稳定性和机械性能。其中，最常见的是鼠尾Ⅰ型胶原蛋白，但其抗收缩性有限，易影响细胞的存活和功能［33］。细胞和支架是模拟天然牙龈结构、功能的基础，而牙周袋中从常氧到低氧的梯度决定了生物膜的结构及其与宿主细胞的相互作用。在研究宿主与微生物的相互作用中，绝大多数模型忽略了牙周袋内天然氧张力的存在，由于缺乏天然氧气和代谢条件，无法维持菌斑生物膜的复杂性。Adelfio等［35］首次构建了支持氧气扩散、营养输送的多孔牙龈组织模型，通过将人GF包埋在Ⅰ型胶原蛋白中并接种到支架以复制结缔组织；将人牙龈上皮细胞接种在支架的顶端部分以构建上皮组织。最后，植入树脂牙并接种龈下菌斑微生物以重建天然牙周袋。该模型在上皮层创建了需氧环境，在袋深部创建了缺氧环境，重建了具有氧张力并支持需氧菌、兼性厌氧菌、厌氧菌生长的天然牙周袋，但不足之处在于微生物培养仅持续24h，且缺乏牙周组织中的关键成分：骨、血管和免疫细胞等。牙龈结缔组织中的脉管系统及免疫细胞在宿主响应牙周微生物的免疫反应和炎症反应中发挥着重要作用，在口腔与全身系统联系中起到桥梁作用。Makkar等［36］首次将微血管内皮细胞、GF嵌入纤维蛋白基质，构建血管化牙龈结缔组织，基于微生物定植的时空顺序，研究宿主对早、中、晚期定植微生物的免疫反应，可视化微生物对基质和脉管系统的侵入，为组织水平研究牙周炎发病机制、免疫细胞迁移与极化、牙周炎与系统性疾病的关联提供了新的平台。2.动态牙龈模型：静态牙龈模型常因细菌代谢产物的蓄积对组织细胞造成损害，而不能用于长期研究宿主与微生物的相互作用。龈沟液和唾液不仅起到缓冲pH、维持细菌生长代谢的作用，流动产生的机械剪切应力还能促进上皮更新，增强屏障作用，提高牙周微生态的稳定性，有利于宿主与微生物间相互作用的长期研究［37］。Bao等［38］首次利用灌注生物反应器构建体外感染牙龈组织模型，将GF、牙龈上皮细胞、巨噬细胞接种于生物反应器内的胶原海绵中，并引入苏黎世生物膜模型以构建微生物感染的牙周组织，与生物膜共培养24h后，发现某些细菌的生长受到抑制，表明在动态环境中纳入免疫细胞增强了组织的抗菌能力。但也有研究认为动态牙龈模型中某些细菌（弯曲杆菌、链球菌、韦荣菌、放线菌和Pg等）受到抑制，可能是由于模型未模拟牙周袋天然氧梯度的结果。而Adelfio等［35，

39］在模拟天然牙周袋从常氧到低氧梯度的人源化牙龈模型的基础上，利用生物反应器引入高度模拟口内唾液黏弹性的人工唾液，开发了反映口腔生物力学特征的动态牙龈模型。与静态模型相比，长时间暴露于脂多糖的动态模型显示出更强的细胞活力，增强了上皮屏障的完整性，更适合长期研究宿主与微生物的相互作用。为进一步增强模型对微生物的抵抗力，还可考虑将中性粒细胞、T淋巴细胞等免疫细胞纳入动态牙龈模型中。牙周健康到疾病状态的转变是菌斑生物膜与宿主免疫防御长期相互作用导致，尽管静态牙龈模型最大程度上还原了天然牙周组织的生理和表型，但由于细菌代谢产物蓄积损害组织，模型仅能维持较短的时间。而动态模型通过模拟唾液的流动，增强了上皮的完整性，提高了组织对致病菌的抵抗力，更适合长时间研究宿主与微生物间的相互作用。四、器官芯片模型模型的有效性取决于与亲本组织的相似性。尽管二维细胞模型和三维组织模型是牙周炎相关研究中常用的简单、便捷的工具，但其与人体组织复杂的生理特性仍有较大的差异。随着组织工程和再生医学的发展，研究者们越来越倾向于寻找人源化体外研究平台以替代动物模型。器官芯片（organonachip，OOAC）作为一种新兴技术，基于微流控技术，结合生物学、材料学和工程学，可实现在器官水平甚至生物体水平模拟人类的结构和功能特性，为研究健康或疾病状态下牙周组织的微环境、微生理提供了更有效的平台［40］。OOAC模型是由透明的、生物相容性微流体细胞培养装置构成，包括中央培养室和中空微通道，通过流动系统控制营养供给、机械刺激等，小型化OOAC可以最大程度减少样品量和试剂量，最大程度模拟人体微环境［37］。OOAC的出现为研究牙周炎发病机制、新型治疗药物的评估提供了更准确、更个性化的体外研究平台，目前，已有“芯片上的牙龈”“芯片上的龈沟”“芯片上的上皮毛细血管”“芯片上的牙周膜牙槽骨”等模型［4144］。二维细胞模型和三维牙龈组织模型的来源往往是人体牙龈组织，OOAC模型通过小型化解决了人牙龈组织数量少、体积小的问题，可在流动条件下长期培养全层牙龈组织，在减少样品用量的同时，提高了灵敏度。Gard等［41］开发了一种多细胞共培养的多层、多表型牙龈组织的高通量微流体OOAC模型，该模型通过在微流体膜双层平台中顺序接种人口腔角质形成细胞、人内皮细胞和人GF，在单向、循环液体流动下分化并形成多层组织屏障长达4周时间构建而成，模拟了体内观察到的GF和角质形成细胞的多层结构，并结合了微血管内皮屏障模拟血管化牙周软组织。将TNFα和IL1β引入模型，发现近10种促炎因子分泌增加，内皮细胞数量减少、形态改变，屏障通透性增加。使用p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂，则观察到促炎因子水平降低，表明该模型通过降低屏障功能、增加促炎因子的分泌响应炎症刺激，可通过检测低浓度、难测量的细胞因子，实现长期、可重复地观察组织对炎症刺激和保护剂的反应，为体外研究牙周组织健康或疾病状态分子机制提供了稳定的平台。牙周膜与牙槽骨是牙周组织的关键组成部分，在维持牙周组织稳态中发挥重要作用。Vurat等［44］首次使用活细胞和生物分子构建了模拟牙周膜牙槽骨界面的微流控芯片三维生物打印微组织模型，该模型以牙周膜成纤维细胞与明胶甲基丙烯酰（gelatinmethacryloyl，GelMA）生物墨水混合打印模拟牙周膜组织，成骨细胞与抗压强度更高的含HA磁性氧化铁纳米颗粒GelMA生物墨水混合打印模拟牙槽骨组织，在微流控芯片内形成三维打印的牙周微组织模型。在持续7d的培养过程中，细胞形状保真度高、分布均匀，稳定性较好。在该模型中评估四环素在牙周膜牙槽骨界面的吸收，初步证实与体内药物吸收一致，该模型可用于牙周膜牙槽骨微环境下评估药物与细胞相互作用。但该模型未将微血管纳入其中，牙周膜中含有丰富的脉管系统，牙周膜的软组织由20%的血管体积组成［45］，将脉管系统纳入体外模型以评估药物毒性及药代动力学等至关重要，构建血管化牙周膜牙槽骨微环境能更准确地模拟体内生物过程。OOAC是利用微流体和微纳加工技术在动态条件下进行小型化细胞培养的模型，相对于传统模型，其透明的装置利于直观观察细胞间相互作用、实时评估药物渗透等，在模拟牙周微环境的基础上，小型化模型可减少样本量，降低污染，提高灵敏度，有利于长期、可重复的体外研究。尽管OOAC在体外研究中有一定优势，但也存在成本高昂、设计复杂，难以全面推进