免疫细胞疗法实验操作流程

免疫细胞疗法实验操作流程免疫细胞疗法（如CAR-T、DC-CIK、TIL等）通过调控或增强机体免疫细胞的功能，实现对肿瘤、自身免疫性疾病等的精准干预。实验操作的规范性是保障细胞制剂质量、推动临床转化的核心前提。本文结合细胞生物学、免疫学及临床转化研究的实践要求，系统梳理免疫细胞疗法从细胞采集、分离纯化、活化扩增、基因修饰（如需）、功能质控到临床回输的全流程操作要点，为科研团队及临床机构提供可落地的标准化操作参考。一、细胞采集与预处理细胞来源直接影响后续疗法的效果与安全性，常见来源包括外周血、脐带血、肿瘤组织或自体/异体干细胞。不同来源的采集策略需兼顾细胞活性、纯度及伦理规范：（一）外周血单个核细胞（PBMC）采集采集操作：采用无菌抗凝采血管（如EDTA或肝素抗凝，根据后续实验选择），采集外周静脉血（成人通常采集50~100mL，儿童或特殊人群酌情调整）。采集后立即轻柔颠倒混匀，避免血液凝固。预处理：采集后4小时内进行处理，若需延迟处理，可置于2~8℃冷藏（不超过24小时）。处理前将血液与等体积的磷酸盐缓冲液（PBS，含2%胎牛血清）稀释，降低血液黏度以优化后续分离效果。（二）肿瘤组织来源细胞采集组织处理：手术获取的肿瘤组织立即置于含双抗（青霉素、链霉素）的无血清培养基中，4℃转运至实验室。在超净台中，用无菌剪刀、镊子去除坏死组织、结缔组织，将肿瘤组织剪碎至1~2mm³的小块。细胞解离：采用胶原酶（如CollagenaseIV）或胰蛋白酶（根据组织类型选择）在37℃、5%CO₂环境下消化30~60分钟，期间每10分钟轻柔振荡。消化后用70μm细胞筛网过滤，离心（300×g，5分钟）收集细胞沉淀，用PBS洗涤2次后备用。二、免疫细胞的分离与纯化（一）密度梯度离心法分离PBMC试剂准备：提前将淋巴细胞分离液（如Ficoll-Paque）置于室温平衡，避免温度波动影响密度。操作步骤：1.将稀释后的血液缓慢叠加于等体积的分离液上层（注意保持液面分层，避免混合）；2.室温下离心（400×g，20分钟，无制动），使细胞按密度分层；3.用无菌吸管吸取中间云雾状的单个核细胞层（PBMC），转移至新离心管；4.加入5倍体积的PBS洗涤，离心（300×g，10分钟），弃上清，重复洗涤2次以去除分离液残留。（二）免疫磁珠分选靶细胞以CD3⁺T细胞分选（CAR-T疗法常用）为例：磁珠与抗体孵育：取纯化后的PBMC，加入抗CD3抗体（按说明书推荐浓度），4℃孵育15分钟；随后加入偶联CD3抗体的磁珠（如MiltenyiBiotec的CD3磁珠），室温孵育15分钟。磁性分离：将细胞悬液通过磁性分离柱（置于磁场中），CD3⁺T细胞因结合磁珠被吸附于柱内，未结合细胞随缓冲液流出；用缓冲液洗涤柱体2次后，移除分离柱于磁场外，加入缓冲液并推注，收集分选后的CD3⁺T细胞。三、细胞活化与体外扩增（一）T细胞活化（以CAR-T制备为例）活化体系构建：将分选后的CD3⁺T细胞以1×10⁶个/mL的密度接种于包被有CD3/CD28抗体的培养板（或加入CD3/CD28磁珠，按1:1比例与细胞共孵育），培养基为含10%胎牛血清的RPMI-1640，添加IL-2（100~300IU/mL）。扩增培养：置于37℃、5%CO₂培养箱，每2~3天观察细胞密度，当密度达到2×10⁶个/mL时，按1:2比例传代，补充新鲜培养基与IL-2，维持细胞活力（避免密度过高导致凋亡）。（二）树突状细胞（DC）诱导单核细胞诱导：从PBMC中贴壁分离单核细胞（37℃孵育2小时，未贴壁细胞为淋巴细胞），贴壁细胞用含GM-CSF（50ng/mL）、IL-4（20ng/mL）的无血清培养基诱导，每2天半量换液，补充细胞因子。成熟诱导：第6~7天加入LPS（1μg/mL）或TNF-α（10ng/mL）诱导DC成熟，24小时后收集成熟DC，用于后续负载肿瘤抗原或回输。四、基因修饰（以CAR-T为例）（一）慢病毒载体转导病毒滴度测定：提前通过荧光定量PCR或空斑实验测定慢病毒滴度，确保MOI（感染复数）在5~10范围内（根据细胞类型调整）。转导操作：1.将活化2~3天的T细胞调整密度至1×10⁶个/mL，加入慢病毒（MOI=5）与Polybrene（8μg/mL，增强转导效率）；2.37℃、5%CO₂孵育12~16小时后，更换新鲜培养基，继续培养以扩增CAR-T细胞。（二）转导效率检测转导后48小时，通过流式细胞术检测CAR分子的表达（利用CAR的抗原结合域对应的抗体或抗原蛋白进行染色），转导效率通常需>50%方可进入后续流程。五、细胞表型与功能质控（一）表型分析（流式细胞术）检测细胞表面标志物以验证纯度与分化状态：T细胞：CD3、CD4、CD8、CD45RA（初始T细胞）、CD45RO（记忆T细胞）；DC细胞：CD1a、CD80、CD86、HLA-DR；质控标准：T细胞纯度>90%，DC成熟标志物阳性率>80%。（二）功能验证细胞毒性实验：采用CFSE标记靶细胞（如肿瘤细胞），与效应细胞（如CAR-T）按不同效靶比（E:T=1:1、5:1、10:1）共培养4~24小时，通过流式细胞术检测靶细胞凋亡率（AnnexinV/PI双染）。细胞因子分泌：收集培养上清，用ELISA检测IFN-γ、IL-2等细胞因子水平，或通过ELISPOT检测分泌细胞因子的细胞数量，验证细胞的免疫活性。六、细胞制剂制备与放行（一）制剂制备细胞洗涤与浓缩：收集扩增后的细胞，用无血清培养基洗涤2次，离心（300×g，10分钟）后重悬于临床级生理盐水或专用细胞保存液，调整细胞浓度至1×10⁸~1×10⁹个/mL。制剂分装：按临床回输剂量分装（如成人单次回输1×10⁸个细胞），置于2~8℃或液氮冻存（根据细胞类型选择保存方式）。（二）放行质控每批细胞制剂需通过以下检测方可放行：细胞活力：台盼蓝拒染法检测，活力>90%；无菌检测：需氧/厌氧培养14天，支原体PCR检测阴性；内毒素：鲎试剂法检测，内毒素<5EU/kg；表型与功能：符合预先设定的纯度、活性标准。七、临床回输与不良反应监测（一）回输准备制剂复温：冻存的细胞制剂需在37℃水浴中快速复温（<2分钟），避免反复冻融；新鲜制剂需在2~8℃保存不超过24小时。患者预处理：根据方案给予抗过敏药物（如苯海拉明）或激素（如地塞米松），预防过敏反应。（二）回输操作途径选择：静脉回输（最常用）、瘤内注射、腹腔注射等，根据疾病类型与治疗方案确定。速度控制：首次回输速度宜慢（如10~20滴/分钟），观察30分钟无不良反应后，调整至正常速度（40~60滴/分钟）。（三）不良反应监测回输后密切监测患者生命体征（体温、血压、心率），警惕细胞因子释放综合征（CRS，表现为发热、低血压、呼吸困难）、神经毒性（头痛、意识障碍）等，及时给予托珠单抗（CRS）、甘露醇（神经毒性）等对症治疗。质量控制与注意事项1.无菌操作：全程在超净台或生物安全柜中进行，定期监测环境菌落数（沉降菌、浮游菌），操作人员严格执行手消、穿无菌服等规范。2.试剂与耗材质控：所有试剂（如细胞因子、抗体、分离液）需验证效价与纯度，耗材（离心管、培养板）需无菌无热源。3.实验记录：详细记录每一步的操作时间、试剂批号、细胞密度、活力、表型数据，确保可追溯性，为后续优化提供依据。结语免疫细胞疗法的实验操作流程是一