生物实验操作步骤详解

生物实验操作步骤详解生物实验是探索生命机制的核心手段，规范的操作流程是保障实验结果可靠、可重复的基石。本文围绕细胞培养、聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质免疫印迹（WesternBlot）三类经典实验，结合实践经验拆解操作细节，为科研工作者提供实用参考。一、细胞培养实验：无菌环境下的生命维持与扩增细胞培养的核心是模拟体内微环境，严格控制污染与细胞状态。以贴壁细胞（如HeLa、293T）传代为例：（一）实验前准备环境灭菌：超净台提前30分钟开紫外，用75%乙醇喷雾台面、器械（移液枪、培养皿）；关闭紫外后通风15分钟，避免残留臭氧损伤细胞。培养箱定期用含氯消毒剂擦拭，维持5%CO₂、37℃、饱和湿度。试剂与耗材：玻璃器皿经121℃高压灭菌20分钟；一次性耗材（离心管、吸头）需无菌包装完整。完全培养基（如DMEM+10%胎牛血清+1%双抗）4℃避光保存，使用前37℃水浴预热；胰蛋白酶-EDTA（Trypsin-EDTA）提前37℃预热，避免低温影响酶活性。（二）细胞传代操作1.细胞观察与弃液：倒置显微镜下确认细胞密度（80%~90%融合）、形态正常（无皱缩、空泡）且无污染（培养基澄清、无黑点/菌丝）。超净台内倾斜培养瓶，用无菌吸头吸弃旧培养基，沿瓶壁加2~3mL预热PBS轻晃清洗，重复1次以去除残留血清（抑制胰酶活性）。2.胰酶消化：加1mL预热Trypsin-EDTA覆盖细胞层，计时（HeLa细胞约1~2分钟），显微镜下观察细胞变圆、间隙增大时，立即加2mL完全培养基终止消化（血清含胰酶抑制剂）。3.吹打与离心：用移液枪反复吹打瓶底（避免气泡），使细胞呈单细胞悬液；转移至离心管，800rpm（~100×g）离心5分钟，弃上清后加新鲜培养基重悬。4.分瓶培养：按1:2~1:5比例接种至新培养瓶，补培养基至合适体积（T25瓶加5mL），十字形轻晃使细胞均匀分布（幅度不宜过大，防止聚团）。放入培养箱，次日观察贴壁及生长状态。（三）关键注意事项无菌操作：全程戴手套，避免说话/咳嗽污染；吸头、移液枪勿接触非无菌区域（如台面、瓶口外侧）。消化控制：胰酶作用过久会损伤细胞，过短则消化不完全；可轻拍培养瓶侧壁辅助细胞脱离。污染预防：若发现细菌污染（培养基浑浊）、真菌污染（菌丝），立即丢弃并彻底消毒培养箱，追溯污染源（耗材、试剂或操作流程）。二、聚合酶链式反应（PCR）：基因片段的特异性扩增PCR通过“变性-退火-延伸”循环实现DNA指数扩增，操作核心是体系精准与程序优化。（一）试剂与器材准备试剂：2×PCR预混液（含Taq酶、dNTPs、Mg²⁺）；上下游引物（10μM，PAGE纯化）；模板DNA（基因组DNA、cDNA或质粒，无核酸酶污染）。器材：PCR仪提前校准温度（梯度PCR验证引物最佳退火温度）；微量移液器用带滤芯吸头（阻挡气溶胶污染，避免交叉污染）。（二）PCR反应体系构建（20μL体系示例）冰上操作，按顺序加样（减少挥发与污染）：2×MasterMix：10μL（提供酶、底物及缓冲环境）上游引物（10μM）：0.5μL（终浓度0.25μM，可依引物Tm值调整）下游引物（10μM）：0.5μL模板DNA：1μL（质粒可减至0.1μL，避免非特异性扩增）ddH₂O：补至20μL用移液器轻吹混合，短暂离心（5000rpm，10s）使液体集中管底，防止挂壁影响反应。（三）扩增与产物检测扩增程序：设置为“95℃5min（预变性）；循环：95℃30s（变性）、退火（Tm-5℃）30s、72℃1min/kb（延伸）；72℃10min（终延伸）；4℃保温”。过程中勿开盖，避免温度波动导致非特异性扩增。电泳验证：配制1%~2%琼脂糖凝胶（小片段用高浓度），加核酸染料（如Safe染料）。取5~10μL产物与LoadingBuffer混合，上样后120V电泳20~30分钟，紫外灯下观察条带位置、亮度，判断扩增效率与特异性。（四）常见问题及解决无条带：检查模板质量（是否降解）、引物设计（Tm值是否合适）、PCR仪温度（是否实际达标）；可调整退火温度（梯度PCR筛选）或增加模板量。非特异性条带：降低引物浓度、缩短延伸时间、提高退火温度；或重新设计引物（避免发夹结构、引物二聚体）。条带弥散：可能是模板浓度过高、酶量过多或电泳胶浓度不当，可稀释模板、减少酶量或调整凝胶浓度。三、蛋白质免疫印迹（WesternBlot）：蛋白的定性与定量分析WesternBlot通过“电泳分离-转膜-抗体孵育”检测目标蛋白，核心是蛋白完整性与抗体特异性结合。（一）样品制备与电泳前处理1.蛋白提取：细胞弃培养基，预冷PBS洗2次，加RIPA裂解液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）冰上裂解30分钟，每10分钟涡旋10秒；4℃、____rpm离心15分钟，取上清（总蛋白）。组织样品液氮研磨后同法处理。2.蛋白定量：BCA法或Bradford法测定蛋白浓度，确保上样量一致（如20~50μg/孔）。3.SDS胶制备：分离胶（如10%）按比例混合缓冲液、丙烯酰胺、水、APS、TEMED，倒入胶板后加无水乙醇封层（加速凝固）；积层胶（5%）混合后插入梳子，待凝固后清理加样孔。（二）电泳与转膜1.上样与电泳：样品与LoadingBuffer（含β-巯基乙醇）1:1混合，100℃煮5分钟（还原蛋白），冰浴冷却后上样。恒压电泳：积层胶50V，分离胶100V，至溴酚蓝到达胶底。2.湿法转膜：裁剪PVDF膜（比胶略大），甲醇预激活10秒（激活疏水基团，未激活会降低蛋白结合效率）；滤纸、胶、膜依次浸泡转膜缓冲液（含甲醇，维持蛋白疏水性），按“负极-滤纸-胶-膜-滤纸-正极”组装转膜夹（排除气泡，否则转膜不完全）。恒压转膜（30kD以下200mA30分钟，100kD以上200mA60分钟），冰浴降温（防止蛋白降解、膜过热）。（三）封闭与抗体孵育封闭：转膜后，膜入含5%脱脂牛奶的TBST（磷酸化蛋白用BSA，避免牛奶内源性蛋白干扰），室温摇床封闭1小时。一抗孵育：按说明书稀释一抗（如1:1000），4℃摇床过夜（或室温2小时）；TBST洗膜3次（每次10分钟，彻底去除未结合抗体）。二抗孵育：HRP标记二抗（如1:5000）室温孵育1小时；TBST洗膜3次（每次10分钟）。（四）显影与分析化学发光显影：混合显影液（如超敏ECL），均匀滴膜上，避光反应1~5分钟；吸去多余显影液，凝胶成像仪曝光（依条带亮度调整时间，如10秒、30秒、1分钟）。结果分析：ImageJ定量条带灰度，与内参（如GAPDH、β-actin）对比，计算目标蛋白相对表达量。（五）操作要点蛋白完整性：裂解全程冰上操作，加抑制剂防降解；煮样后立即冷却，避免蛋白变性不均。转膜效率：胶与膜紧密贴合，无气泡；转膜缓冲液新鲜配制，甲醇含量不足会导致蛋白扩散。抗体特异性：一抗4℃过夜孵育提高结合特异性