赛默飞液相培训课件

赛默飞液相色谱（HPLC/UHPLC）培训课件第一章液相色谱基础概述什么是液相色谱（LC）？液相色谱（LiquidChromatography,LC）是一种强大的分离分析技术，通过流动相（液体溶剂）携带样品流经固定相（色谱柱填料），利用不同化合物在两相间的分配系数差异实现高效分离。该技术的核心原理基于化合物的物理化学性质差异，包括极性、分子大小、电荷状态等。当混合物通过色谱柱时，各组分以不同速率移动，最终在时间轴上分离开来，形成特征性的色谱峰。HPLC与UHPLC的区别颗粒尺寸差异HPLC色谱柱颗粒尺寸通常为3-5μm，而UHPLC采用小于2μm的亚二微米颗粒，显著提高了柱效和分离能力。分离效率提升UHPLC分离效率更高，峰容量更大，可在更短时间内实现更好的分离效果，分析时间通常缩短50-90%。溶剂消耗减少由于流速更低、柱体积更小，UHPLC溶剂消耗量仅为传统HPLC的10-20%，更加环保经济。系统压力要求液相色谱的主要应用领域药物分析用于药物杂质分析、含量测定、稳定性研究、溶出度检测等关键质量控制环节。符合FDA、ICH等国际法规要求，是制药行业的黄金标准。食品安全检测检测食品中的农药残留、兽药残留、食品添加剂、真菌毒素等有害物质，保障公众健康安全，满足国家食品安全标准要求。环境监测监测水体、土壤、大气中的有机污染物、持久性污染物、内分泌干扰物等环境污染物，支持环境保护和生态评估工作。生物大分子分析赛默飞VanquishUHPLC系统Vanquish系列代表了液相色谱技术的巅峰，采用模块化设计理念，提供卓越的灵活性和可扩展性。系统具备业界领先的压力耐受能力、超低系统体积和智能化操作界面。其创新的双梯度泵技术、高精度自动进样器和多种检测器选项，可满足从常规分析到超高通量筛选的各种应用需求。智能诊断功能实时监控系统状态，确保数据质量和仪器可靠性。第二章赛默飞液相色谱系统组成了解液相色谱系统的各个模块及其功能，是掌握仪器操作和维护的基础。本章将详细介绍赛默飞系统的硬件架构和技术特点。主要硬件模块介绍01泵系统高压输送流动相，提供稳定的流速和压力。赛默飞采用双柱塞往复泵或四元低压梯度泵，实现精确的流量控制和梯度混合。02自动进样器精准样品注入系统。采用高精度注射泵和六通阀切换技术，实现微升级进样精度，支持多达数千个样品的自动化分析。03色谱柱及柱温箱分离的核心部件。柱温箱提供±0.1°C的温度控制精度，确保分离的重现性。支持快速加热和强制冷却功能。04检测器信号检测与转换。提供紫外可见光检测器（UV/VWD）、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）以及质谱接口等多种选择。赛默飞泵技术优势技术创新赛默飞泵系统采用专利的脉动补偿技术和智能混合算法，确保流量稳定性达到±0.07%RSD的行业领先水平。双柱塞对称设计有效降低脉动，保证峰形的完美对称性。系统具备宽广的流速范围（0.001-8.000mL/min）和压力范围（最高1500bar），可适配从毛细管到制备级的各种应用。在线脱气装置和溶剂混合优化技术确保梯度精度。低脉动设计，基线噪声<0.2×10⁻⁵AU快速平衡，梯度延迟体积<100μL智能泄漏检测和压力限制保护支持多达四种溶剂的复杂梯度程序自动进样器功能与维护自动化处理能力支持多种样品瓶规格和样品架配置，最多可容纳数千个样品位。具备样品预处理功能，包括稀释、混合、衍生化等。智能样品追踪和条码识别功能提高实验室效率。日常维护要点定期更换进样针（建议每3-6个月或10,000次进样），检查转子密封圈磨损情况。使用10%硝酸溶液清洗样品通路，去除蛋白质和盐沉积。保持进样口清洁，避免交叉污染。校准程序定期进行进样体积校准（推荐频率：每月或每1000次进样）。使用标准品验证进样精度和准确度。校准程序包括针头定位校准、阀切换时间优化和进样量验证。故障排查技巧进样量不准确：检查注射器密封性和针头堵塞。峰面积重复性差：检查样品混合均匀性和进样阀泄漏。保留时间漂移：确认系统压力稳定和温度控制。检测器类型及应用紫外可见光检测器（UV/VWD）最常用的液相检测器，适用于具有紫外吸收的化合物。工作波长190-800nm，灵敏度高达0.5×10⁻⁶AU。适合药物、农药、芳香化合物等分析。二极管阵列检测器（DAD）可同时获取全波长光谱信息，提供化合物定性鉴定的额外维度。支持峰纯度检测和光谱库匹配。扫描速度可达80Hz，不损失分离效率。质谱联用接口实现高灵敏度和高选择性检测。电喷雾离子化（ESI）接口适合极性和离子化合物。提供分子量和结构信息，是复杂基质分析的首选技术。液相色谱系统架构完整的液相色谱系统由溶剂输送、样品导入、分离、检测和数据处理五大部分组成。流动相从溶剂瓶经泵加压后与样品在色谱柱中混合分离，分离后的组分进入检测器产生信号，最终由数据系统采集处理生成色谱图。系统中的每个连接点、管路内径和死体积都经过精心设计，以最小化峰展宽和保持分离效率。模块化设计允许根据应用需求灵活配置和升级系统。第三章液相色谱方法开发与优化方法开发是液相色谱应用的核心技能。科学的方法开发流程能够大幅缩短开发时间，提高方法的稳健性和可靠性。方法开发基本流程化合物特性分析了解目标化合物的pKa、logP、分子量、溶解性等理化性质，预测最适合的分离模式。固定相选择根据化合物极性选择C18、C8、苯基、氨基等不同键合相。考虑柱长、内径和颗粒尺寸。流动相设计选择合适的有机相和水相组成，优化pH值和添加剂。设计等度或梯度洗脱程序。参数优化调整柱温、流速、进样量等参数，平衡分离度、分析时间和峰形。系统的方法开发通常需要2-5天时间，但通过质量源于设计（QbD）理念和计算机辅助优化可以大幅提高效率。赛默飞方法开发实用技巧快速筛选策略使用赛默飞的方法开发工具包，通过色谱柱筛选套装快速评估不同固定相的分离效果。Accucore色谱柱系列采用固相核心技术，在较低背压下提供UHPLC级别的效率。软件辅助优化Chromeleon色谱数据系统集成的方法开发向导可自动生成优化方案。输入分离目标和约束条件，软件自动计算最优梯度、温度和流速组合，减少试错次数。方法转移注意事项使用等效色谱柱和相同品牌溶剂调整流速补偿系统体积差异验证关键分离对的分离度进行系统适用性测试确认样品制备与前处理1样品溶解选择与流动相相容的溶剂，避免沉淀和峰形异常。必要时使用超声或涡旋辅助溶解。2过滤除杂使用0.22μm或0.45μm滤膜去除颗粒物，保护色谱柱和进样阀。选择合适材质避免样品吸附。3固相萃取（SPE）用于复杂基质的净化和富集，提高检测灵敏度和选择性。选择合适的SPE柱和洗脱条件。4衍生化反应对于不具备检测基团的化合物，进行柱前或柱后衍生化，提高检测响应。关键提示：样品前处理是保证数据质量的第一道关口。不当的前处理可能导致色谱柱污染、峰形拖尾、重复性差等问题。建议制定标准化的样品处理流程并严格执行。方法验证与系统适用性测试专属性/选择性验证方法能够准确测定目标化合物而不受基质干扰。通过空白样品、安慰剂样品和加标样品对比确认。线性与范围建立至少5个浓度点的校准曲线，相关系数r≥0.999。线性范围应覆盖实际样品的预期浓度。准确度与精密度准确度通常要求回收率98-102%。精密度包括重复性（RSD<2%）和中间精密度（RSD<3%）评估。检测限与定量限LOD信噪比≥3:1，LOQ信噪比≥10:1。通过标准偏差法或信噪比法确定。稳定性评估样品溶液、标准溶液在不同条件下的稳定性，包括室温、冷藏和冻融循环。系统适用性每次分析前检查保留时间、分离度、理论塔板数、拖尾因子等参数，确保系统处于良好状态。第四章仪器维护与故障诊断预防性维护和及时的故障诊断是保证仪器长期稳定运行的关键。本章将介绍实用的维护技巧和常见问题的解决方案。日常维护要点1溶剂系统维护每周更换溶剂过滤头，防止颗粒进入泵系统。使用HPLC级或更高纯度溶剂，避免缓冲盐结晶。长期不用时用纯水或甲醇冲洗系统。2泵密封圈更换根据压力波动和泄漏情况判断，通常3-6个月更换一次。使用原厂配件确保密封性能。更换后需进行泄漏测试和压力校准。3进样系统保养每月用50%异丙醇溶液清洗进样针和样品通路。检查针头弯曲和磨损情况。样品盘和针座保持清洁干燥，避免腐蚀。4色谱柱维护使用保护柱延长分析柱寿命。定期反冲色谱柱去除强保留杂质。存放时用合适溶剂封存，避免固定相塌陷和柱效损失。常见故障及排查泵压力异常压力过高：检查在线过滤器堵塞保护柱或色谱柱污染管路连接处堵塞压力过低：泵密封圈磨损泄漏单向阀损坏管路连接松动基线问题噪声增大：流动相未充分脱气检测器灯能量衰减流通池污染或气泡基线漂移：柱温箱温度不稳定流动相配比误差色谱柱平衡不充分进样系统故障堵塞现象：样品过滤不充分进样针内壁沉积转子密封圈碎屑泄漏问题：转子密封圈磨损定子表面划伤连接管路老化赛默飞硬件维护实操演示泵泄漏测试程序关闭出口阀，设定压力至400bar并保持5分钟。观察压力下降速率，标准为<5bar/min。如超出范围，检查密封圈和单向阀状态。进样阀拆解清洗使用专用工具拆卸转子和定子组件。用软布蘸取50%异丙醇擦拭密封表面，检查划痕和磨损。安装新密封圈时涂抹少量硅脂。检测器灯管更换关闭电源并等待冷却。按说明书取出旧灯管，安装新灯管时避免触碰石英窗口。更换后预热30分钟并进行波长校准。安全提示：维护操作前务必关闭电源并释放系统压力。使用原厂配件和工具，遵循标准操作程序。不熟悉的操作应联系赛默飞技术支持。软件操作与数据处理基础Chromeleon色谱数据系统赛默飞ChromeleonCDS是业界领先的色谱数据管理平台，提供直观的用户界面和强大的数据处理功能。核心功能模块：Cobra向导：智能化仪器控制，简化方法设置和序列创建流程SmartPeaks™：自动峰检测和积分，减少人工干预eWorkflow：集成样品管理、数据采集、处理和报告的完整工作流法规遵从：满足FDA21CFRPart11和数据完整性要求系统支持多仪器控制、远程访问和云端数据同步，实现实验室的数字化转型。基本操作流程启动系统并检查仪器状态创建或加载分析方法设置样品序列和进样顺序启动序列并监控运行审核数据和峰积分结果生成标准化报告数据归档和备份第五章液相色谱典型应用案例通过实际案例深入理解液相色谱技术的应用价值。本章将展示药物、食品、环境等领域的成功应用实例。药物分析案例药物杂质检测与含量测定采用AccucoreC18色谱柱（100×2.1mm,2.6μm）分析某头孢类抗生素原料药。流动相为乙腈-0.05M磷酸盐缓冲液（pH3.0）梯度洗脱，DAD检测波长254nm。方法能够在8分钟内分离主成分和7个相关杂质，杂质检出限达0.05%，满足药典要求。主成分含量测定的RSD<0.5%，加标回收率99.2-100.8%。该方法已成功应用于三批次验证和稳定性研究，数据稳健可靠。生物制药蛋白质纯度分析使用MAbPacSEC-1色谱柱进行单克隆抗体聚集体分析。流动相为50mM磷酸钾缓冲液（pH6.8）含200mM氯化钠，等度洗脱。UV检测280nm，流速0.4mL/min。方法能够有效分离单体、二聚体和高分子量聚集体，分离度>2.0。单体峰面积百分比的重复性RSD<1%。该方法适用于抗体药物的质量控制和工艺优化，支持生物制药的发展。食品安全检测案例农药残留多残留筛查建立QuEChERS前处理结合UHPLC-MS/MS的方法，同时测定水果蔬菜中150种农药残留。样品用乙腈提取，经C18和PSA净化后进样分析。采用HypersilGOLDC18色谱柱（100×2.1mm,1.9μm），乙腈-5mM甲酸铵梯度洗脱，分析时间12分钟。ESI正负离子切换模式，MRM检测。方法线性范围0.5-100μg/kg，定量限达到欧盟标准要求。基质加标回收率70-120%，RSD<15%。已应用于数千个样品的日常检测。食品添加剂定量分析开发HPLC-DAD方法同时测定饮料中的10种合成色素。样品经聚酰胺吸附净化后直接进样。使用AcclaimC18色谱柱（250×4.6mm,5μm），甲醇-乙酸铵缓冲液梯度洗脱。DAD全波长扫描（200-700nm），各色素在最大吸收波长处定量。方法能够实现柠檬黄、日落黄、胭脂红等色素的基线分离，线性范围0.5-50mg/L，回收率95-105%。满足国家食品安全标准的检测要求。环境监测案例水体有机污染物分析采用固相萃取-UHPLC-MS/MS方法检测地表水中的多环芳烃（PAHs）。水样经HLB固相萃取柱富集1000倍后进样。HypersilGOLDaQC18色谱柱分离，乙腈-水梯度洗脱，APCI离子源MRM检测。方法检出限达到0.1-1.0ng/L，满足国家地表水环境质量标准。土壤有机污染物检测建立索氏提取-柱层析净化-HPLC-FLD方法测定土壤中的苯并芘等PAHs。土样用二氯甲烷提取，硅胶柱净化后浓缩进样。荧光检测器（激发260nm，发射430nm）提供高灵敏度和选择性。方法回收率85-115%，检出限0.01mg/kg，用于污染场地调查和修复效果评估。赛默飞LC-MS联用技术简介技术优势与特点液相色谱-质谱联用（LC-MS）结合了液相色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度、高选择性检测优势，是现代分析化学最强大的工具之一。超高灵敏度：检出限可达pg-fg级别，比UV检测提高2-3个数量级结构鉴定：提供分子量和碎片离子信息，实现化合物确证高选择性：通过多反应监测（MRM）模式消除基质干扰宽动态范围：线性范围可达5个数量级多组分分析：一次进样可同时检测数百种化合物赛默飞提供QExactive、TSQ系列等多款高性能质谱平台，搭配VanquishUHPLC系统，实现无缝对接和最优性能。接口技术电喷雾离子化（ESI）：适用于极性、离子性化合物，是生物分子分析的首选。大气压化学离子化（APCI）：适用于中低极性化合物，热稳定性好。H-ESI探头：赛默飞专利技术，提高离子化效率和稳定性。第六章培训总结与资源推荐恭喜您完成赛默飞液相色谱技术培训！持续学习和实践是提升分析技能的关键。让我们回顾重点并探索更多学习资源。赛默飞技术支持与学习资源官方学习中心访问赛默飞官网学习中心，获取免费在线课程、应用文献、操作视频和技术手册。涵盖液相色谱、质谱、样品前处理等全方位内容。网址：/lear