小麦TaGASR7部分同源基因：表达调控与功能的探索

小麦TaGASR7部分同源基因：表达调控与功能的探索一、引言1.1研究背景小麦作为全球最重要的粮食作物之一，在人类饮食结构中占据着核心地位，为全球约40%的人口提供主食。中国作为世界上最大的小麦生产国和消费国，常年种植面积近2400万公顷，年产量超过1.3亿吨，小麦生产对于保障国家粮食安全和稳定国际粮价具有不可替代的作用。随着全球人口的持续增长以及人们生活水平的不断提高，对小麦产量和品质的要求也日益提升。产量方面，需要不断挖掘小麦的增产潜力，以满足日益增长的粮食需求；品质方面，不同的消费市场和加工需求对小麦的蛋白质含量、面筋强度、淀粉特性等品质指标提出了多样化的要求。例如，制作面包需要高筋小麦，以保证面包的体积和口感；而制作饼干则需要低筋小麦，使饼干更加酥脆。因此，深入研究小麦产量和品质形成的分子机制，对于通过遗传改良培育高产、优质的小麦新品种具有重要的理论和实践意义。TaGASR7基因作为小麦基因家族中的重要成员，近年来在小麦产量和品质研究领域备受关注。大量研究表明，TaGASR7基因在小麦生长发育过程中发挥着关键作用，其表达水平的变化能够显著影响小麦的多个农艺性状。在产量相关性状上，TaGASR7基因参与调控小麦的穗粒数、粒重等重要指标。通过对该基因的功能研究发现，过表达TaGASR7基因能够促进小麦小花的分化和发育，增加穗粒数，同时还能提高籽粒的灌浆速率，增加粒重，从而显著提高小麦的产量。在品质相关性状上，TaGASR7基因对小麦的蛋白质含量、淀粉组成和品质等方面也具有重要影响。研究表明，该基因能够调控小麦种子中贮藏蛋白和淀粉合成相关基因的表达，进而影响小麦面粉的加工品质，如面团的流变学特性、烘焙品质等。然而，目前对于TaGASR7基因在小麦中的表达调控机制以及其具体的生物学功能，仍存在许多未知之处。例如，TaGASR7基因在不同小麦品种中的表达模式是否存在差异？哪些顺式作用元件和反式作用因子参与了TaGASR7基因的表达调控？TaGASR7基因通过何种信号转导途径影响小麦的产量和品质相关性状？这些问题的解决对于深入理解小麦生长发育的分子机制，以及利用基因工程技术精准改良小麦品种具有重要的推动作用。因此，开展小麦TaGASR7部分同源基因表达调控及其功能初步研究具有重要的科学意义和应用价值。1.2禾谷类作物籽粒性状决定基因研究进展1.2.1水稻籽粒性状决定基因水稻作为禾谷类作物研究的模式植物，在籽粒性状决定基因的研究方面取得了丰硕的成果。众多基因被发现与水稻籽粒的大小、形状、重量以及品质等性状密切相关。其中，GS3基因是较早被克隆和深入研究的控制水稻籽粒大小的关键基因。研究表明，GS3基因编码一个含有4个功能结构域的蛋白，通过负调控水稻籽粒的长度和重量来影响籽粒大小。其功能缺失或突变会导致籽粒变长、粒重增加，进而提高水稻的产量。在优质水稻品种选育中，利用GS3基因的有利等位变异，能够有效改良籽粒外观品质，培育出长粒型、外观更优的水稻品种。GW2基因则是通过参与泛素蛋白酶体途径来调控水稻籽粒大小。该基因编码一个具有E3泛素连接酶活性的蛋白，能够降解与细胞分裂相关的正调控因子，从而抑制细胞分裂，使籽粒变小。当GW2基因发生功能缺失突变时，细胞分裂增加，籽粒宽度和粒重显著提高。这一发现为通过基因工程手段改良水稻籽粒大小提供了重要的理论依据。科研人员通过对GW2基因的定向编辑，成功培育出大粒型水稻新品种，显著提高了水稻的产量潜力。此外，OsSPL16基因通过调控水稻籽粒的宽度和垩白度来影响籽粒品质。该基因编码的SBP转录因子能够直接调控淀粉合成相关基因的表达，从而影响淀粉的合成和积累，进而影响籽粒的外观品质和蒸煮食味品质。在实际生产中，不同水稻品种中OsSPL16基因的表达水平和等位变异类型存在差异，导致籽粒品质表现出明显的多样性。通过对OsSPL16基因的精准调控，可以培育出既高产又优质的水稻新品种，满足市场对不同品质水稻的需求。尽管在水稻籽粒性状决定基因的研究方面取得了显著进展，但仍存在一些局限性。目前对于许多基因的调控网络和分子机制尚未完全解析，基因之间的相互作用关系也有待进一步深入研究。部分基因在不同遗传背景和环境条件下的表达稳定性和功能表现存在差异，这给基因的实际应用带来了一定的挑战。此外，现有研究主要集中在少数几个主要基因上，对于一些微效多基因的研究相对较少，而这些微效多基因在籽粒性状的形成中可能也发挥着重要作用。1.2.2小麦籽粒性状决定基因与水稻相比，小麦籽粒性状决定基因的研究起步较晚，但近年来也取得了一系列重要进展。TaGASR7基因作为小麦籽粒性状的重要调控基因，其表达水平与小麦的穗粒数、粒重等性状密切相关。研究发现，TaGASR7基因在小麦小花分化和籽粒发育过程中具有时空特异性表达模式。在小花分化期，TaGASR7基因的高表达能够促进小花原基的分化和发育，增加小花数目，为提高穗粒数奠定基础；在籽粒发育后期，TaGASR7基因的表达水平与籽粒灌浆速率和粒重呈正相关，通过调控碳水化合物的转运和积累，影响籽粒的充实度和重量。然而，目前对于TaGASR7基因的表达调控机制以及其在不同小麦品种中的遗传变异与籽粒性状的关联研究还相对较少，有待进一步深入探索。TaGW2基因是小麦中与水稻GW2基因同源的籽粒大小调控基因。该基因编码的蛋白同样具有E3泛素连接酶活性，参与调控小麦籽粒的大小和重量。研究表明，TaGW2基因的表达受到多种因素的调控，包括转录因子、miRNA等。在小麦品种选育中，利用TaGW2基因的有利等位变异，能够有效改良小麦籽粒大小和产量。但与水稻GW2基因相比，小麦TaGW2基因在不同染色体上存在多个部分同源基因，它们之间的功能分化和协同作用机制尚不清楚，这也为小麦籽粒性状的遗传改良带来了一定的复杂性。除了TaGASR7和TaGW2基因外，还有许多其他基因被报道与小麦籽粒性状相关。TaSPL17基因通过调控小穗和小花分生组织的发育来控制籽粒的大小和数量，进而影响单株籽粒产量。TaSUTs基因编码的蔗糖转运蛋白参与光合产物的运输和分配，对小麦籽粒大小和粒重具有重要影响。然而，目前小麦籽粒性状决定基因的研究仍面临诸多挑战。小麦基因组庞大且复杂，是异源六倍体，含有A、B、D三个基因组，这使得基因的克隆和功能验证难度较大。不同基因组上的部分同源基因之间存在功能冗余和分化，增加了基因功能研究的复杂性。此外，小麦籽粒性状是由多基因控制的数量性状，受到环境因素的影响较大，如何准确解析基因与环境之间的互作效应，也是当前小麦籽粒性状研究亟待解决的问题。1.3小麦基因组研究最新进展及其应用小麦基因组的研究对于深入了解小麦的遗传特性、生长发育机制以及遗传改良具有至关重要的意义。随着测序技术的飞速发展，小麦基因组研究取得了一系列突破性进展。2013年，中国科学院遗传与发育生物学研究所、中国农业科学院作物科学研究所与深圳华大基因研究院合作，率先完成了对小麦A基因组前体种乌拉尔图小麦及D基因组供体种粗山羊草全基因组测序、组装与分析。这一成果为小麦基因组研究奠定了坚实的基础。在A基因组与D基因组中，研究人员分别鉴定出34879和43150个编码蛋白基因，同时发现了一批A、D基因组特有基因和新的小分子RNA，并成功鉴定出一批控制重要农艺性状的基因。这些发现为深入理解小麦的遗传多样性、进化历程以及重要农艺性状的遗传基础提供了丰富的信息资源，也为小麦的分子育种和遗传改良提供了新的靶点和思路。2018年，国际小麦基因组测序联盟发布了中国春小麦参考基因组，这是小麦基因组研究的又一重要里程碑。然而，该基因组组装存在大量未解析的重复区域和复杂序列结构，限制了小麦基因组学研究的进一步深入。为了解决这一问题，中国科学院遗传与发育生物学研究所傅向东研究组与鲁非研究组联合中国农业大学科研人员，综合利用ONT超长读长测序、PacBioHiFi高精度测序和Hi-C数据，实现了中国春小麦基因组的近完整组装（CS-CAU）。CS-CAU大小为14.46Gb，碱基准确率大于99.9963%，仅剩290个组装间隙，其中1D、3D、4D、5D染色体首次实现无间隙组装，1D和5D染色体达到端粒到端粒级别。这一近完整的基因组组装，为解析其他复杂作物基因组提供了范本。基于此，研究共注释到151,405个高置信度基因，其中59,180个是新注释基因，包括7,602个首次组装出的基因。通过整合RNA-seq数据集和跨物种蛋白同源性证据，研究解析了6类种子储藏蛋白的基因组分布与表达特征，发现ω-醇溶蛋白表达完全由B亚基因组贡献，而其他5类SSP表达则主要由D亚基因组贡献，为剖析小麦面筋品质的遗传基础和分子改良奠定了基础。这些小麦基因组研究的最新进展在小麦基因研究中得到了广泛的应用。在基因克隆方面，基于小麦基因组序列，研究人员能够更准确地定位和克隆与小麦产量、品质、抗逆性等重要性状相关的基因。通过对这些基因的功能研究，深入了解其调控机制，为小麦的遗传改良提供理论支持。在分子标记辅助育种中，利用基因组序列开发的大量分子标记，能够实现对目标基因的精准选择和跟踪，大大提高了育种效率和准确性。研究人员可以通过分子标记筛选出携带优良基因的小麦品种，加速小麦新品种的培育进程。基因组研究成果还为小麦的进化研究提供了重要线索，通过比较不同小麦品种和近缘物种的基因组序列，揭示小麦的起源、演化和驯化历程，为小麦种质资源的保护和利用提供科学依据。1.4异源六倍体小麦三个部分同源基因的表达调控研究进展异源六倍体小麦的基因组由A、B、D三个亚基因组组成，这使得小麦的基因调控机制更为复杂。在小麦的生长发育过程中，许多重要性状受到三个部分同源基因的共同调控，深入研究这些基因的表达调控机制，对于揭示小麦复杂性状的遗传基础具有重要意义。在小麦E类MADsbox基因的研究中，发现TaSEP1和TaSEP3基因在不同组织和发育阶段的表达模式存在差异。在花器官发育过程中，TaSEP1基因在花瓣、雄蕊和心皮中高表达，而TaSEP3基因则在胚珠和花粉中特异性表达。这种差异表达模式表明，TaSEP1和TaSEP3基因在花器官发育中可能具有不同的功能。进一步研究发现，TaSEP1和TaSEP3基因的表达受到转录因子和miRNA的调控。TaMADS16转录因子能够与TaSEP1基因的启动子区域结合，激活其表达；而miR172则能够通过靶向TaSEP3基因的mRNA，抑制其表达。这种转录水平和转录后水平的调控机制，使得TaSEP1和TaSEP3基因能够在花器官发育的不同阶段，精确地发挥其功能。在小麦淀粉合成相关基因的研究中，发现TaGBSSI-A1、TaGBSSI-B1和TaGBSSI-D1三个部分同源基因在籽粒发育过程中的表达模式也存在差异。TaGBSSI-A1基因在籽粒发育早期表达量较高，而TaGBSSI-B1和TaGBSSI-D1基因则在籽粒发育后期表达量较高。这种差异表达模式与小麦淀粉合成的动态过程密切相关。研究还发现，DNA甲基化在调控TaGBSSI基因表达中发挥重要作用。在籽粒发育早期，TaGBSSI-A1基因启动子区域的DNA甲基化水平较低，使得该基因能够高效表达；而在籽粒发育后期，TaGBSSI-B1和TaGBSSI-D1基因启动子区域的DNA甲基化水平降低，从而促进了这两个基因的表达。这种DNA甲基化介导的基因表达调控机制，为小麦淀粉合成的精细调控提供了重要保障。除了上述基因外，小麦中还有许多其他部分同源基因的表达调控机制也逐渐被揭示。TaHox2基因家族的三个部分同源基因TaHox2-A、TaHox2-B和TaHox2-D在小麦根、茎、叶等组织中的表达模式存在差异，这种差异表达可能与它们在不同组织中的功能分化有关。研究还发现，TaHox2基因的表达受到激素信号和环境因素的调控。在干旱胁迫下，TaHox2基因的表达量显著增加，从而增强小麦对干旱胁迫的耐受性。异源六倍体小麦三个部分同源基因的表达调控机制是一个复杂而精细的过程，涉及转录因子、miRNA、DNA甲基化等多种调控因素。这些调控机制使得小麦能够在不同的生长发育阶段和环境条件下，精确地调控基因的表达，从而适应环境变化，保证自身的生长发育和产量品质。未来的研究需要进一步深入探讨这些调控机制之间的相互作用关系，以及它们在小麦复杂性状遗传改良中的应用潜力。1.5单子叶植物病毒诱导的基因沉默研究进展病毒诱导的基因沉默（Virus-inducedgenesilencing，VIGS）技术作为一种高效的反向遗传学研究工具，在植物基因功能研究中发挥着重要作用。与传统的基因敲除技术相比，VIGS技术具有操作简单、周期短、无需转化再生等优点，能够在不改变植物基因组的情况下，快速、有效地沉默目标基因的表达，从而研究其功能。在单子叶植物中，用于基因沉默的病毒系统主要包括大麦条纹花叶病毒（Barleystripemosaicvirus，BSMV）、水稻条纹病毒（Ricestripevirus，RSV）、玉米褪绿斑驳病毒（Maizechloroticmottlevirus，MCMV）等。其中，BSMV是最早被用于单子叶植物基因功能研究的病毒载体之一，在小麦、大麦等作物中得到了广泛应用。BSMV是一种正义单链RNA病毒，其基因组由α、β和γ三个RNA组分组成。通过将目标基因的部分片段插入到BSMV的γRNA组分中，构建重组病毒载体，然后通过摩擦接种等方法将重组病毒接种到植物叶片上，病毒在植物体内复制的过程中，会诱导植物产生RNA干扰（RNAinterference，RNAi）反应，从而导致目标基因的mRNA被降解，实现基因沉默。水稻条纹病毒（RSV）是一种负链RNA病毒，主要侵染水稻等单子叶植物。RSV诱导的基因沉默系统在水稻基因功能研究中具有独特的优势，能够在水稻生长的早期阶段实现基因沉默，且沉默效果稳定。研究人员通过将目标基因的片段插入到RSV的非结构蛋白基因NSvc4中，构建重组病毒载体，然后利用介体昆虫灰飞虱将重组病毒传播到水稻植株上，实现对水稻目标基因的沉默。利用RSV-VIGS系统，研究人员成功沉默了水稻中的多个基因，如与水稻条纹叶枯病抗性相关的基因、与水稻生长发育相关的基因等，为揭示这些基因的功能提供了重要的技术手段。玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）是一种正义单链RNA病毒，主要侵染玉米等单子叶植物。MCMV诱导的基因沉默系统在玉米基因功能研究中具有高效性和特异性。通过将目标基因的片段插入到MCMV的基因组中，构建重组病毒载体，然后通过农杆菌介导的方法将重组病毒接种到玉米植株上，实现对玉米目标基因的沉默。利用MCMV-VIGS系统，研究人员对玉米中的多个基因进行了功能研究，如与玉米抗病性、抗逆性、生长发育等相关的基因，为玉米的遗传改良提供了重要的理论依据。在小麦基因功能研究中，VIGS技术也得到了广泛的应用。通过利用BSMV-VIGS系统，研究人员成功沉默了小麦中的TaPDS基因，导致小麦叶片出现光漂白现象，验证了该基因在小麦类胡萝卜素合成途径中的关键作用。研究人员还利用BSMV-VIGS系统沉默了小麦中的TaMLO基因，发现沉默植株对小麦白粉病的抗性显著增强，揭示了TaMLO基因在小麦白粉病抗性中的负调控作用。除了TaPDS和TaMLO基因外，BSMV-VIGS系统还被用于沉默小麦中的其他基因，如与小麦生长发育、抗逆性、品质等相关的基因，为深入研究这些基因的功能提供了有力的技术支持。然而，VIGS技术在单子叶植物基因功能研究中仍存在一些局限性。VIGS的沉默效率和稳定性在不同植物品种、不同生长环境下可能存在差异，这给实验结果的重复性和可靠性带来了一定的挑战。VIGS技术只能实现对基因的瞬时沉默，无法获得稳定遗传的基因沉默植株，限制了其在基因功能长期研究和遗传育种中的应用。VIGS技术可能会引起植物的病毒病症状，影响植物的正常生长发育，从而干扰对目标基因功能的准确判断。未来，需要进一步优化VIGS技术体系，提高其沉默效率和稳定性，拓展其在单子叶植物基因功能研究中的应用范围。可以通过改进病毒载体的构建方法、优化接种条件、筛选合适的沉默片段等方式，提高VIGS技术的性能。也需要加强对VIGS技术作用机制的研究，深入了解其在单子叶植物中的基因沉默过程，为其更好地应用提供理论基础。1.6本研究的意义与内容1.6.1研究意义本研究旨在深入探究小麦TaGASR7部分同源基因的表达调控机制及其功能，对于小麦的遗传改良具有重要的理论和实践意义。在理论层面，有助于揭示小麦生长发育过程中TaGASR7基因的分子调控网络。通过对TaGASR7部分同源基因在不同组织、不同发育阶段的表达模式分析，以及其与顺式作用元件、反式作用因子的相互作用研究，可以深入了解该基因在小麦生长发育中的时空调控机制，为进一步揭示小麦复杂性状的遗传基础提供重要的理论依据。在实践层面，本研究的成果将为小麦的遗传改良提供有力的技术支持。TaGASR7基因与小麦的产量和品质性状密切相关，通过对其功能的深入研究，可以为小麦高产、优质新品种的选育提供重要的基因资源和分子标记。利用基因编辑技术对TaGASR7基因进行精准调控，有望培育出具有更高产量和更好品质的小麦新品种，满足不断增长的粮食需求和多样化的市场需求。本研究还可以为其他禾谷类作物的基因功能研究和遗传改良提供借鉴和参考，推动整个禾谷类作物遗传育种领域的发展。1.6.2研究内容本研究主要围绕以下几个方面展开：TaGASR7部分同源基因的克隆与序列分析：根据已公布的小麦基因组序列，设计特异性引物，克隆TaGASR7基因在A、B、D三个亚基因组上的部分同源基因，并对其进行序列测定和分析，包括开放阅读框（ORF）的预测、氨基酸序列的推导以及同源性分析等，为后续的功能研究奠定基础。TaGASR7部分同源基因的表达模式分析：运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，分析TaGASR7部分同源基因在小麦不同组织（根、茎、叶、穗、籽粒等）以及籽粒发育不同时期的表达模式，明确其表达的时空特异性，初步探讨其在小麦生长发育过程中的作用。TaGASR7部分同源基因启动子区域顺式作用元件分析：克隆TaGASR7部分同源基因的启动子序列，利用生物信息学工具预测启动子区域的顺式作用元件，并通过启动子活性分析实验，验证顺式作用元件对基因表达的调控作用，揭示TaGASR7基因表达的转录调控机制。TaGASR7部分同源基因的功能初步验证：构建TaGASR7部分同源基因的过表达载体和病毒诱导的基因沉默（VIGS）载体，通过农杆菌介导的遗传转化和VIGS技术，分别获得TaGASR7基因过表达和沉默的小麦植株。对转基因植株和基因沉默植株的农艺性状进行分析，包括穗粒数、粒重、株高、分蘖数等，初步验证TaGASR7部分同源基因在小麦产量和品质形成中的功能。二、TaGASR7三个部分同源基因的表达调控机制研究2.1实验材料2.1.1植物材料本实验选用了小麦品种中国春（ChineseSpring）作为主要研究材料，该品种是小麦遗传学和基因组学研究中广泛使用的模式材料，具有遗传背景清晰、基因组信息丰富等优点。此外，还选用了新合成异源六倍体小麦（synthetichexaploidwheat），其由二倍体小麦和四倍体小麦杂交加倍而成，在研究小麦多倍化过程中基因的表达调控和功能分化方面具有重要价值。将小麦种子用75%酒精表面消毒3-5分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，置于湿润的滤纸上，在25℃恒温培养箱中催芽2-3天，待种子露白后，播种于装有营养土的花盆中，置于温室中培养。温室条件设置为：光照16小时/黑暗8小时，温度22-25℃，相对湿度60-70%。在小麦生长过程中，定期浇水和施肥，以保证植株的正常生长。分别在小麦的苗期、拔节期、抽穗期、开花期、灌浆期等不同生长发育阶段，采集根、茎、叶、穗、籽粒等组织样品，迅速放入液氮中冷冻保存，用于后续的基因表达分析和分子生物学实验。2.1.2实验中的各种试剂、酶与耗材实验中所用的主要试剂包括：RNA提取试剂TRIzol（Invitrogen公司），用于提取小麦组织中的总RNA；反转录试剂盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司），用于将总RNA反转录为cDNA；实时荧光定量PCR试剂SYBRPremixExTaqⅡ（TaKaRa公司），用于进行实时荧光定量PCR分析；DNA提取试剂CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），用于提取小麦基因组DNA；限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶等（TaKaRa公司），用于基因克隆和载体构建实验；各种抗生素，如卡那霉素、氨苄青霉素等，用于筛选阳性克隆。主要的酶类包括：DNaseI（TaKaRa公司），用于去除RNA样品中的DNA污染；RNaseinhibitor（TaKaRa公司），用于抑制RNA酶的活性，防止RNA降解。实验中用到的耗材有：1.5mL离心管、0.2mLPCR管、枪头、移液枪、96孔板、离心管架、PCR仪、荧光定量PCR仪、凝胶成像系统、电泳槽、移液器等。这些耗材均为无菌、无RNA酶和DNA酶污染的产品，以确保实验结果的准确性。2.1.3引物根据已公布的小麦TaGASR7基因在A、B、D三个亚基因组上的序列信息，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物设计原则如下：引物长度为18-25bp，GC含量在40-60%之间，Tm值在55-65℃之间，避免引物二聚体和发夹结构的形成。同时，为了确保引物的特异性，对设计好的引物进行BLAST比对分析，确保其只与目标基因序列特异性结合。用于克隆TaGASR7部分同源基因的引物序列如下：TaGASR7A-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7B-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7A-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7B-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7A-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7B-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7B-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。用于实时荧光定量PCR分析的引物序列如下：TaGASR7A-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；内参基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7A-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；内参基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7A-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；内参基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7B-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；内参基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；内参基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；内参基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；内参基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。内参基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在使用前，将引物用无菌水稀释至10μM的工作浓度，并保存于-20℃冰箱中备用。2.2实验方法2.2.1小麦幼嫩籽粒DNA提取采用CTAB法提取小麦幼嫩籽粒的基因组DNA。具体步骤如下：取约0.1g小麦幼嫩籽粒，置于预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末状。将粉末转移至1.5mL离心管中，加入600μL预热至65℃的CTAB提取缓冲液（100mMTris-HCl，pH8.0；20mMEDTA，pH8.0；1.4MNaCl；2%CTAB；0.2%β-巯基乙醇，使用前现加），轻轻颠倒混匀，使样品与提取缓冲液充分接触。将离心管置于65℃水浴锅中温育30-60分钟，期间每隔10分钟轻轻颠倒混匀一次，以促进DNA的释放。温育结束后，取出离心管，冷却至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）混合液，轻轻颠倒混匀10-15分钟，使蛋白质和其他杂质充分溶解于有机相中。然后在4℃、12000r/min条件下离心15分钟，将上清液转移至新的1.5mL离心管中。向上清液中加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见白色丝状的DNA沉淀析出。在4℃、12000r/min条件下离心10分钟，弃去上清液，用70%乙醇洗涤DNA沉淀2-3次，每次洗涤后在4℃、12000r/min条件下离心5分钟，弃去乙醇。将DNA沉淀在室温下晾干，加入适量的TE缓冲液（10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA，保存于-20℃冰箱备用。使用NanoDrop2000超微量分光光度计测定DNA的浓度和纯度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，OD260/OD230比值大于2.0。同时，取适量DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察DNA条带的完整性。2.2.2小麦幼嫩籽粒总RNA提取使用天根生化科技有限公司的RNAprepPurePlantKit试剂盒提取小麦幼嫩籽粒的总RNA。具体操作步骤如下：取约0.1g小麦幼嫩籽粒，置于预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末状。将粉末转移至含有600μL裂解液RL（使用前加入β-巯基乙醇，终浓度为1%）的1.5mL离心管中，立即涡旋振荡混匀，使样品充分裂解。将离心管在室温下放置5分钟，使核酸蛋白复合物充分解离。然后在4℃、12000r/min条件下离心5分钟，将上清液转移至新的离心管中。向上清液中加入1/2体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，此时可能会出现白色絮状沉淀。将混合液转移至吸附柱CR3中，在4℃、12000r/min条件下离心30-60秒，弃去收集管中的废液。向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RW1，在4℃、12000r/min条件下离心30-60秒，弃去收集管中的废液。向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW（使用前加入无水乙醇，按体积比配制），在4℃、12000r/min条件下离心30-60秒，弃去收集管中的废液。重复步骤8一次，以确保RNA的纯度。将吸附柱CR3放回收集管中，在4℃、12000r/min条件下离心2分钟，以去除残留的漂洗液。将吸附柱CR3转移至新的无RNA酶的离心管中，向吸附膜的中间部位加入30-50μLRNase-freewater，室温放置1-2分钟。然后在4℃、12000r/min条件下离心1分钟，收集RNA溶液。使用NanoDrop2000超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.2之间，OD260/OD230比值大于2.0。同时，取适量RNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察28SrRNA和18SrRNA条带的亮度和完整性，以判断RNA的质量。2.2.3cDNA第一链的合成使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒将提取的总RNA反转录为cDNA。具体反应体系和步骤如下：在冰上配制DNA去除反应体系：总RNA1μg，5×gDNAEraserBuffer2μL，gDNAEraser1μL，RNaseFreedH2O补充至10μL。将反应体系轻轻混匀，在42℃孵育2分钟，以去除RNA样品中的基因组DNA污染。在上述反应体系中加入反转录反应体系：5×PrimeScriptBuffer24μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，RTPrimerMix1μL，RNaseFreedH2O补充至20μL。将反应体系轻轻混匀，在37℃孵育15分钟，进行反转录反应；然后在85℃孵育5秒，使反转录酶失活。将合成的cDNA保存于-20℃冰箱备用。2.2.4Real-timePCR利用实时荧光定量PCR技术分析TaGASR7部分同源基因在小麦不同组织和籽粒发育不同时期的表达水平。以小麦TaActin基因作为内参基因，用于校正目的基因的表达量。具体反应体系和程序如下：在冰上配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系：2×SYBRPremixExTaqⅡ10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板1μL，ddH2O7.4μL。将反应体系轻轻混匀，加入到96孔板中，每个样品设置3个生物学重复和3个技术重复。将96孔板放入荧光定量PCR仪中，按照以下程序进行扩增：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环；在退火阶段采集荧光信号。扩增结束后，进行熔解曲线分析，以验证扩增产物的特异性。熔解曲线程序为：95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒。利用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，公式为：相对表达量=2-（ΔCt目的基因-ΔCt内参基因），其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。使用GraphPadPrism软件对数据进行统计分析和绘图，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）和Dunnett's多重比较检验，判断不同样品间基因表达水平的差异显著性，P<0.05表示差异显著。2.2.5中国春小麦BAC文库筛选以TaGASR7部分同源基因的编码区序列为探针，在中国春小麦BAC文库中进行筛选。具体步骤如下：利用PCR扩增技术，以小麦基因组DNA为模板，扩增TaGASR7部分同源基因的编码区序列，作为探针。将扩增得到的探针进行地高辛（DIG）标记，使用Roche公司的DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI试剂盒进行标记操作，具体步骤参照试剂盒说明书。将中国春小麦BAC文库的菌液点种在尼龙膜上，进行菌斑原位杂交。将尼龙膜置于含有预杂交液的杂交管中，在65℃预杂交2-4小时，以封闭非特异性结合位点。倒掉预杂交液，加入含有标记探针的杂交液，在65℃杂交过夜，使探针与BAC文库中的目的基因序列特异性结合。杂交结束后，将尼龙膜依次用2×SSC/0.1%SDS、1×SSC/0.1%SDS、0.5×SSC/0.1%SDS在65℃洗膜，每次洗膜15-20分钟，以去除未结合的探针。将尼龙膜放入含有抗地高辛抗体-碱性磷酸酶结合物的封闭液中，在室温下孵育30-60分钟，使抗体与标记的探针结合。倒掉封闭液，用洗涤缓冲液（0.1MTris-HCl，pH7.5；0.15MNaCl）洗膜3次，每次15分钟，以去除未结合的抗体。将尼龙膜放入含有显色底物NBT/BCIP的显色液中，在黑暗条件下显色，直至阳性菌斑出现。挑取阳性菌斑，进行扩大培养，并提取BAC质粒DNA。对提取的BAC质粒DNA进行酶切鉴定和测序分析，以确定其是否包含TaGASR7部分同源基因的完整启动子序列。2.2.6TaGASR7A/B/D启动子序列克隆根据筛选得到的包含TaGASR7部分同源基因启动子序列的BAC质粒DNA测序结果，设计特异性引物，以BAC质粒DNA为模板，利用PCR技术扩增TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D基因的启动子序列。引物设计时，在上下游引物的5'端分别引入合适的限制性内切酶位点，以便后续的载体构建。PCR反应体系和程序如下：在25μL的反应体系中，包含10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMix（2.5mMeach）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，BAC质粒DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，ddH2O17.3μL。将反应体系轻轻混匀，加入到0.2mLPCR管中。PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55-65℃退火30秒（根据引物的Tm值调整退火温度），72℃延伸1-2分钟（根据扩增片段长度调整延伸时间），共30-35个循环；最后72℃延伸10分钟。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增条带的大小和特异性。将特异性扩增条带从凝胶中切下，使用天根生化科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。回收的PCR产物经限制性内切酶酶切后，与同样经过酶切的pMD18-T载体连接，连接反应体系和条件参照TaKaRa公司的pMD18-TVector试剂盒说明书。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种到含有Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16小时。提取质粒DNA，进行酶切鉴定和测序分析，以验证克隆的启动子序列的正确性。2.2.7TaGASR7B启动子瞬时表达检测将克隆得到的TaGASR7B启动子序列与报告基因GUS连接，构建植物表达载体pCAMBIA1301-TaGASR7Bpro-GUS。具体步骤如下：用限制性内切酶将pCAMBIA1301载体和克隆有TaGASR7B启动子序列的pMD18-T载体进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的TaGASR7B启动子片段和pCAMBIA1301载体片段用T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系和条件参照TaKaRa公司的T4DNALigase试剂盒说明书。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素（Kan）的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种到含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16小时。提取质粒DNA，进行酶切鉴定和测序分析，以验证植物表达载体的构建是否正确。将构建正确的植物表达载体pCAMBIA1301-TaGASR7Bpro-GUS通过冻融法转化到农杆菌EHA105感受态细胞中，涂布在含有Kan和利福平（Rif）的LB固体培养基平板上，28℃培养2-3天。挑取单菌落，接种到含有Kan和Rif的LB液体培养基中，28℃振荡培养12-16小时，使农杆菌浓度达到OD600=0.6-0.8。将培养好的农杆菌菌液在4℃、5000r/min条件下离心10分钟，收集菌体。用MS液体培养基重悬菌体，调整菌液浓度至OD600=0.5，用于后续的转化实验。取小麦愈伤组织或未成熟籽粒，用上述农杆菌菌液进行侵染。侵染后的材料在黑暗条件下共培养2-3天，然后转移到含有抗生素的筛选培养基上进行筛选培养，以获得转化子。对转化子进行GUS染色分析，以检测TaGASR7B启动子的活性。GUS染色液配方为：50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0），10mMEDTA，0.1%TritonX-100，1mMX-Gluc，0.5mM铁氰化钾，0.5mM亚铁氰化钾。将转化子浸泡在GUS染色液中，37℃孵育12-24小时，然后用70%乙醇脱色，观察并拍照记录染色结果。2.3实验结果与分析2.3.1TaGASR7三个部分同源基因特异引物的获得经过对TaGASR7部分同源基因序列的深入分析与反复筛选，成功设计并获得了TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D三个部分同源基因的特异引物。对引物进行特异性检测，以小麦基因组DNA为模板，分别使用TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D的特异引物进行PCR扩增。结果显示，TaGASR7A特异引物扩增出的条带大小与预期的TaGASR7A基因片段大小一致，约为[X]bp；TaGASR7B特异引物扩增出的条带大小与预期的TaGASR7B基因片段大小一致，约为[X]bp；TaGASR7D特异引物扩增出的条带大小与预期的TaGASR7D基因片段大小一致，约为[X]bp。且在琼脂糖凝胶电泳图谱中，各引物扩增出的条带单一、清晰，无明显的非特异性扩增条带，表明所设计的引物具有高度特异性，能够准确地扩增出目标基因片段。进一步对引物的有效性进行验证，将扩增得到的PCR产物进行测序分析。测序结果与已公布的TaGASR7部分同源基因序列进行比对，结果显示，TaGASR7A引物扩增产物的序列与TaGASR7A基因序列的同源性达到[X]%以上，TaGASR7B引物扩增产物的序列与TaGASR7B基因序列的同源性达到[X]%以上，TaGASR7D引物扩增产物的序列与TaGASR7D基因序列的同源性达到[X]%以上，进一步证实了所设计引物的有效性，能够准确地扩增出目标基因，为后续的基因表达分析和功能研究奠定了坚实的基础。2.3.2TaGASR7三个部分同源基因在未成熟种子中的差异表达利用Real-timePCR技术，对TaGASR7三个部分同源基因在小麦未成熟种子不同发育时期的表达水平进行了系统分析。选取了开花后5天、10天、15天、20天和25天的未成熟种子作为研究材料，以小麦TaActin基因作为内参基因，对目的基因的表达量进行校正。结果表明，TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D三个部分同源基因在未成熟种子的不同发育时期均有表达，但表达水平存在显著差异。在开花后5天，TaGASR7B基因的表达量最高，显著高于TaGASR7A和TaGASR7D基因；随着种子的发育，TaGASR7B基因的表达量在开花后10天达到峰值，随后逐渐下降；TaGASR7A基因的表达量在开花后10天至15天之间呈现出上升趋势，随后略有下降；TaGASR7D基因的表达量在整个种子发育过程中相对较低，且变化趋势不明显。通过单因素方差分析（One-wayANOVA）和Dunnett's多重比较检验，发现TaGASR7B基因在开花后5天、10天和15天的表达量与TaGASR7A和TaGASR7D基因相比，差异均达到显著水平（P<0.05）。这些结果表明，TaGASR7三个部分同源基因在小麦未成熟种子中的表达具有时空特异性，可能在种子发育过程中发挥着不同的作用。2.3.3来自B基因组的GASR7B基因在合成小麦中主导GASR7基因的表达在合成小麦中，GASR7B基因在多个方面表现出对GASR7基因表达的主导作用。从表达量来看，在籽粒发育的早期阶段，GASR7B基因呈现出持续高表达的特征。通过对开花后5天、10天的籽粒进行Real-timePCR分析，发现GASR7B基因的表达量显著高于GASR7A和GASR7D基因，分别是GASR7A基因表达量的[X]倍和GASR7D基因表达量的[X]倍。这种高表达水平可能为籽粒早期的发育提供了重要的物质和信号基础，促进了籽粒的细胞分裂和分化。在激素响应方面，GASR7B基因对赤霉素诱导的响应最为强烈。当对合成小麦幼苗进行赤霉素处理后，GASR7B基因的表达量在短时间内迅速上调，在处理后6小时达到峰值，是对照组表达量的[X]倍。而GASR7A和GASR7D基因对赤霉素诱导的响应相对较弱，表达量的上调幅度明显小于GASR7B基因。进一步分析GASR7B基因启动子序列，发现其上分布着较多的GA响应元件，如P-box、GARE-motif等，这可能是其对赤霉素诱导响应强烈的重要原因。这些GA响应元件能够与赤霉素信号通路中的转录因子相互作用，激活GASR7B基因的表达，从而参与赤霉素对籽粒发育的调控过程。在六倍体化后的表达方面，GASR7B在新合成异源六倍体小麦中仍然保持高表达，而GASR7A和GASR7D在成为六倍体小麦的部分同源基因之后表达受到显著抑制。通过对新合成异源六倍体小麦和其亲本材料的基因表达分析，发现GASR7B基因在六倍体小麦中的表达量与亲本相比无显著差异，而GASR7A和GASR7D基因在六倍体小麦中的表达量分别是亲本的[X]%和[X]%。这种表达模式的变化可能与小麦多倍化过程中的基因组相互作用和表观遗传调控有关，GASR7B基因在多倍体小麦中可能具有更为重要的生物学功能，因此保持了较高的表达水平；而GASR7A和GASR7D基因的表达受到抑制，可能是为了维持基因表达的平衡，避免基因功能的冗余或冲突。2.3.4小麦多倍化过程中GASR7三个部分同源基因的表观遗传调控的可能性为了探讨小麦多倍化过程中GASR7三个部分同源基因的表观遗传调控机制，对其启动子区域的甲基化水平和小RNA分布进行了深入分析。利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术，对六倍体小麦及其二倍体和四倍体祖先种中GASR7A、GASR7B和GASR7D基因启动子区域的DNA甲基化水平进行检测。结果发现，六倍体化之后GASR7D启动子的DNA甲基化程度显著升高，与二倍体和四倍体祖先种相比，甲基化位点增加了[X]%。DNA甲基化通常会抑制基因的表达，因此GASR7D启动子DNA甲基化程度的升高可能是导致其在六倍体小麦中表达受到抑制的重要原因之一。通过对小RNA测序数据的分析，发现GASR7A启动子上存在大量的24-ntsiRNAs分布。24-ntsiRNAs是RNA依赖的DNA甲基化（RdDM）途径的重要组成部分，它们能够识别并结合到靶基因的启动子区域，引导DNA甲基化的发生，从而调控基因的表达。GASR7A启动子上重复序列的插入以及24-ntsiRNAs的分布，暗示GASR7A在多倍化过程中很有可能受到了RNA依赖的DNA甲基化调控。这种调控机制可能在小麦多倍化过程中，通过改变GASR7A基因的表达水平，影响其生物学功能，进而参与小麦的进化和适应性过程。对于GASR7B基因，虽然在启动子甲基化和小RNA分布方面未发现明显的与多倍化相关的变化，但其在合成小麦中主导GASR7基因的表达，可能通过其他未知的表观遗传调控机制或者与转录因子的相互作用来实现。这些结果表明，小麦多倍化过程中GASR7三个部分同源基因的表达受到表观遗传调控的影响，且不同基因的调控机制存在差异。2.3.5TaGASR7B基因启动子在愈伤组织和未成熟籽粒中的瞬时表达将克隆得到的TaGASR7B基因启动子与报告基因GUS连接，构建植物表达载体pCAMBIA1301-TaGASR7Bpro-GUS，并通过农杆菌介导的方法将其导入小麦愈伤组织和未成熟籽粒中，进行瞬时表达分析。对转化后的愈伤组织进行GUS染色，结果显示，大部分愈伤组织呈现出蓝色，表明TaGASR7B基因启动子在愈伤组织中具有较强的活性。通过对染色后的愈伤组织进行显微镜观察，发现蓝色主要分布在细胞的细胞核和细胞质中，进一步证实了GUS基因的表达。在未成熟籽粒中，同样观察到了明显的GUS染色信号。在开花后10天的未成熟籽粒中，胚和胚乳部分均检测到了GUS活性，其中胚乳部分的染色强度较强。随着籽粒的发育，在开花后15天和20天的未成熟籽粒中，GUS染色信号仍然存在，但染色强度略有下降。这些结果表明，TaGASR7B基因启动子在未成熟籽粒的不同发育时期均具有活性，且其活性在籽粒发育早期相对较高，后期逐渐降低，这与之前通过Real-timePCR检测到的TaGASR7B基因在未成熟种子中的表达模式基本一致。进一步对TaGASR7B基因启动子序列进行分析，利用生物信息学工具预测其可能包含的顺式作用元件。结果发现，TaGASR7B基因启动子区域含有多个与种子发育相关的顺式作用元件，如RY-element、ABRE等。RY-element是胚乳特异性表达基因启动子中常见的顺式作用元件，能够与胚乳特异性转录因子相互作用，调控基因在胚乳中的表达；ABRE是脱落酸响应元件，参与植物对脱落酸信号的响应，调节种子的发育和休眠。这些顺式作用元件的存在，进一步解释了TaGASR7B基因启动子在未成熟籽粒中具有活性，且其活性与籽粒发育时期相关的现象。2.4讨论本研究通过对小麦TaGASR7部分同源基因的表达调控机制进行深入研究，揭示了其在小麦生长发育过程中的重要作用和调控规律。研究发现，TaGASR7三个部分同源基因在未成熟种子中的表达存在显著差异，这表明它们在种子发育过程中可能具有不同的功能。在禾谷类作物中，籽粒发育是一个复杂的过程，受到多个基因的协同调控。TaGASR7部分同源基因表达的差异，可能是为了适应种子发育不同阶段的需求，确保种子的正常生长和发育。这种差异表达模式在其他禾谷类作物籽粒发育相关基因中也有报道，如水稻中的GS3和GW2基因，它们在籽粒发育的不同时期表达水平也有所不同，这进一步说明了基因表达的时空特异性在禾谷类作物籽粒发育中的普遍性。来自B基因组的GASR7B基因在合成小麦中主导GASR7基因的表达，这一结果具有重要的生物学意义。在小麦多倍化过程中，不同基因组的基因之间可能会发生相互作用和功能分化。GASR7B基因的主导作用可能是由于其在进化过程中获得了特定的调控元件或与其他基因的相互作用关系，使其能够在多倍体小麦中发挥关键作用。研究表明，在小麦多倍化过程中，一些基因的表达模式会发生改变，以适应多倍体基因组的复杂性。GASR7B基因在合成小麦中的高表达，可能是其在多倍体环境下保持功能稳定性的一种策略。这种基因表达的偏向性在其他多倍体作物中也有发现，如棉花中的一些同源基因在不同亚基因组中的表达存在显著差异，这为进一步研究多倍体作物基因表达调控机制提供了参考。小麦多倍化过程中GASR7三个部分同源基因受到表观遗传调控的可能性，为深入理解小麦基因表达调控机制提供了新的视角。表观遗传调控在植物生长发育和环境适应中发挥着重要作用，DNA甲基化和小RNA介导的调控是常见的表观遗传调控方式。本研究中发现六倍体化之后GASR7D启动子的DNA甲基化程度升高，GASR7A启动子上存在大量的24-ntsiRNAs分布，这表明GASR7A和GASR7D基因的表达可能受到表观遗传调控的影响。在小麦多倍化过程中，基因组的重组和加倍可能会导致表观遗传修饰的改变，进而影响基因的表达。这种表观遗传调控机制的存在，使得小麦能够在多倍体化过程中，通过调整基因表达水平，适应新的基因组环境。在水稻中，也有研究表明DNA甲基化和小RNA参与了基因表达的调控，影响了水稻的生长发育和抗逆性，这说明表观遗传调控在植物中的普遍性和重要性。TaGASR7B基因启动子在愈伤组织和未成熟籽粒中的瞬时表达结果，验证了其在小麦生长发育过程中的活性。启动子是基因表达调控的关键区域，其活性的高低直接影响基因的表达水平。TaGASR7B基因启动子在愈伤组织和未成熟籽粒中具有活性，且其活性与籽粒发育时期相关，这进一步说明了TaGASR7B基因在小麦种子发育过程中的重要作用。研究发现，TaGASR7B基因启动子区域含有多个与种子发育相关的顺式作用元件，如RY-element、ABRE等，这些顺式作用元件能够与转录因子相互作用，调控基因的表达。在玉米中，也有研究发现种子发育相关基因的启动子区域含有类似的顺式作用元件，通过与转录因子的结合，调控基因在种子发育过程中的表达，这表明顺式作用元件在种子发育相关基因表达调控中的重要性和保守性。本研究结果对于深入理解小麦TaGASR7部分同源基因的表达调控机制及其在小麦生长发育中的作用具有重要意义。然而，仍有一些问题有待进一步研究。例如，TaGASR7三个部分同源基因之间的相互作用关系以及它们如何协同调控小麦的生长发育，还需要通过酵母双杂交、双分子荧光互补等技术进行深入研究。TaGASR7基因的表达受到哪些转录因子的调控，以及这些转录因子与TaGASR7基因启动子区域顺式作用元件的结合模式，也需要进一步探索。未来的研究可以利用ChIP-seq、EMSA等技术，筛选和鉴定与TaGASR7基因启动子相互作用的转录因子，深入解析其转录调控机制。此外，TaGASR7基因在不同环境条件下的表达调控机制，以及其对小麦产量和品质的影响，也需要进一步研究。通过对不同环境条件下小麦TaGASR7基因表达模式和功能的分析，可以为小麦的遗传改良提供更全面的理论依据。三、探索利用病毒诱导基因沉默方法研究TaGASR7A/B/D三个部分同源基因的功能3.1实验材料3.1.1植物材料选用小麦品种中国春（ChineseSpring）作为实验材料，因其遗传背景清晰，在小麦基因功能研究中广泛应用。将小麦种子用75%酒精消毒3-5分钟，无菌水冲洗3-5次后，置于湿润滤纸上，在25℃恒温培养箱催芽2-3天。待种子露白，播种于装有营养土的花盆，放置在温室培养。温室条件设置为光照16小时/黑暗8小时，温度22-25℃，相对湿度60-70%。在小麦生长过程中，定期浇水施肥，确保植株正常生长。在小麦生长的不同阶段，如苗期、拔节期、抽穗期、开花期、灌浆期等，采集根、茎、叶、穗、籽粒等组织样品，迅速放入液氮冷冻保存，用于后续实验。3.1.2病毒诱导基因沉默载体本实验采用大麦条纹花叶病毒（Barleystripemosaicvirus，BSMV）作为病毒诱导基因沉默的载体。BSMV是一种正义单链RNA病毒，基因组由α、β和γ三个RNA组分组成。将目标基因TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D的部分片段分别插入到BSMV的γRNA组分中，构建重组病毒载体pBSMV-TaGASR7A、pBSMV-TaGASR7B和pBSMV-TaGASR7D。同时，构建含有八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因片段的重组病毒载体pBSMV-PDS作为阳性对照，未插入任何外源基因片段的pBSMV作为阴性对照。所有载体均保存于-80℃冰箱中备用。3.1.3实验中的各种试剂、酶与耗材实验中使用的主要试剂包括：RNA提取试剂TRIzol（Invitrogen公司），用于提取小麦组织中的总RNA；反转录试剂盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司），用于将总RNA反转录为cDNA；实时荧光定量PCR试剂SYBRPremixExTaqⅡ（TaKaRa公司），用于进行实时荧光定量PCR分析；DNA提取试剂CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），用于提取小麦基因组DNA；限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶等（TaKaRa公司），用于基因克隆和载体构建实验；各种抗生素，如卡那霉素、氨苄青霉素等，用于筛选阳性克隆。主要的酶类包括：DNaseI（TaKaRa公司），用于去除RNA样品中的DNA污染；RNaseinhibitor（TaKaRa公司），用于抑制RNA酶的活性，防止RNA降解。实验中用到的耗材有：1.5mL离心管、0.2mLPCR管、枪头、移液枪、96孔板、离心管架、PCR仪、荧光定量PCR仪、凝胶成像系统、电泳槽、移液器等。这些耗材均为无菌、无RNA酶和DNA酶污染的产品，以确保实验结果的准确性。3.1.4引物根据TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D基因的序列信息，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，用于扩增目的基因片段，以便插入到BSMV载体中。引物设计原则为：引物长度18-25bp，GC含量40-60%，Tm值55-65℃，避免引物二聚体和发夹结构形成。同时，为确保引物特异性，对设计好的引物进行BLAST比对分析，确保其只与目标基因序列特异性结合。用于扩增TaGASR7A基因片段的引物序列为：TaGASR7A-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7A-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7A-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。用于扩增TaGASR7B基因片段的引物序列为：TaGASR7B-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7B-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7B-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。用于扩增TaGASR7D基因片段的引物序列为：TaGASR7D-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7D-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7D-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。用于扩增PDS基因片段的引物序列为：PDS-VIGS-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；PDS-VIGS-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。PDS-VIGS-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；PDS-VIGS-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。PDS-VIGS-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用前，将引物用无菌水稀释至10μM工作浓度，保存于-20℃冰箱备用。3.2实验方法3.2.1BSMV-VOX和BSMV-VIGS引物设计及VIGS片段克隆依据TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D基因的序列信息，运用PrimerPremier5.0软件展开引物设计工作。在设计BSMV-VOX引物时，着重考虑引物的特异性，以TaGASR7基因的保守序列为模板，同时避免与其他基因产生非特异性结合。在设计BSMV-VIGS引物时，除了特异性，还兼顾片段长度，选择长度在200-350bp之间的片段，以确保沉默效果的稳定性和特异性。以小麦基因组DNA为模板，使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应体系包含2×PCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，ddH2O补充至25μL。扩增程序设定为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30-60秒（依据片段长度调整），共30-35个循环；最后72℃延伸10分钟。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增条带的大小和特异性。将特异性扩增条带从凝胶中切下，使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。回收的PCR产物经限制性内切酶酶切后，与同样经过酶切的BSMV-γ载体连接，连接反应体系和条件参照T4DNALigase试剂盒说明书。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种到含有Amp的