小麦α-醇溶蛋白编码基因分子克隆及特性与功能研究

小麦α-醇溶蛋白编码基因分子克隆及特性与功能研究一、引言1.1研究背景与意义小麦作为全球最重要的粮食作物之一，为人类提供了大量的碳水化合物、蛋白质和膳食纤维。然而，随着饮食结构的变化和人们对食品安全的日益关注，小麦过敏问题逐渐凸显。据联合国粮食及农业组织（FAO）统计，小麦已被认定为八大类食物过敏原之一，小麦过敏是一个不可忽视的食品安全问题，多见于迟发性过敏反应，病患率呈上升趋势，且漏诊率较高。小麦过敏不仅影响患者的生活质量，还可能引发严重的健康问题，如小麦依赖-运动诱导的过敏反应（WDEIA），患者食用小麦制品后若在数分钟至6小时内运动，可导致全身皮肤瘙痒、风团样皮疹、咽喉部肿胀、窒息，严重者会出现恶心、呕吐、低血压甚至休克等症状。在国际贸易中，小麦过敏问题也给面制品的生产发展带来了严重挑战。在小麦过敏的众多过敏原中，α-醇溶蛋白是主要的过敏原之一。α-醇溶蛋白是一种低分子量的水溶性蛋白质，主要存在于小麦胚乳中。它以多肽单链的形式存在，富含谷胺酰胺和脯氨酸。研究表明，α-醇溶蛋白中的某些氨基酸序列，如含有丰富的半胱氨酸、天冬酰胺和酪氨酸等，可能对过敏性反应的发生起到关键作用。其中一段由33个氨基酸构成的多肽（33-mer），包含四个主要的抗原决定簇，能够与免疫细胞结合，诱发免疫反应，是诱发乳糜泻的重要因素。对小麦α-醇溶蛋白编码基因进行分子克隆研究具有多方面的重要意义。从理论层面来看，有助于深入理解小麦过敏性反应的分子机制。通过克隆该基因，能够精确解析其核苷酸序列，进而分析其表达调控模式，明确其在过敏反应信号通路中的作用，为全面阐释小麦过敏的发生、发展过程提供关键的理论依据。从应用角度而言，首先，为小麦过敏的诊断提供了更为精准的方法。利用克隆得到的基因制备特异性的诊断试剂，能够提高小麦过敏诊断的准确性和灵敏度，减少漏诊和误诊的发生。其次，为开发低致敏性小麦品种奠定了基础。借助基因编辑等现代生物技术，对α-醇溶蛋白编码基因进行修饰或沉默，有望培育出低致敏性的小麦新品种，从源头上解决小麦过敏问题，满足过敏人群对小麦制品的需求。此外，还能为小麦加工工艺的改进提供指导，通过调整加工条件，降低小麦制品中α-醇溶蛋白的含量或改变其结构，从而减少过敏风险，促进面制品行业的健康发展。1.2国内外研究现状自1989年日本学者Takahashi和Tanaka首次从小麦中分离到α-醇溶蛋白，利用兔子制备其抗体，通过孪生免疫亲和层析纯化、质谱分析和氨基酸序列测定，成功克隆小麦α-醇溶蛋白基因以来，该领域的研究不断深入，在基因克隆方法、基因结构和功能等方面取得了一系列成果。在基因克隆方法上，早期主要依赖化学和物理分离纯化手段，如离子交换层析、凝胶过滤层析、电泳等，但这些方法操作繁琐、耗时长且产量低。1995年，美国学者Lauriere等人利用PCR技术从小麦的cDNA中克隆出α-醇溶蛋白全长基因，极大地推动了该基因克隆研究的发展。此后，结合荧光原位杂交（FISH）、南方杂交等方法，研究人员对α-醇溶蛋白基因的分布和表达进行了研究。随着次世代测序技术的兴起，通过RNA-Seq分析等手段，小麦α-醇溶蛋白基因的全基因组信息逐渐被揭示，使得对该基因的研究更加全面和深入。国内在基因克隆技术方面紧跟国际步伐，不断优化和创新实验方案，提高克隆效率和准确性。例如，有研究团队通过改进PCR反应体系和条件，成功从特定小麦品种中高效克隆出α-醇溶蛋白编码基因，为后续研究提供了良好的基础。对于α-醇溶蛋白基因的结构研究，已明确小麦α-醇溶蛋白一般由单个基因或少数几个基因编码。研究发现，其基因序列中含有特定的保守区域和可变区域，这些区域的结构特征与蛋白质的功能密切相关。在功能探究方面，通过免疫印迹和抗体分析，证实α-醇溶蛋白可以激活小鼠骨髓细胞系和贝氏细胞系，从而引起细胞因子的分泌。有研究表明，小麦α-醇溶蛋白的氨基酸序列中富含半胱氨酸、天冬酰胺和酪氨酸等氨基酸，这些氨基酸在过敏性反应的发生中可能发挥重要作用。国内相关研究也在基因结构与功能关系方面展开了探索，通过定点突变等技术，分析基因结构改变对α-醇溶蛋白功能及过敏活性的影响，进一步揭示其作用机制。尽管在小麦α-醇溶蛋白编码基因的研究上已取得显著进展，但仍存在一些不足和待解决的问题。目前对于α-醇溶蛋白编码基因在不同小麦品种间的遗传多样性研究还不够全面，尤其是一些地方特色小麦品种，其基因的独特性和多样性尚未得到充分挖掘。基因表达调控机制方面，虽然已知一些转录因子和信号通路可能参与其中，但具体的调控网络仍不清晰，需要深入研究。在应用研究领域，如何将基因克隆和功能研究的成果有效转化为低致敏性小麦品种的培育技术，以及开发更为精准、便捷的小麦过敏诊断方法，还需要进一步探索和实践。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究小麦过敏原α-醇溶蛋白编码基因，通过一系列实验技术和分析方法，为小麦过敏机制的理解以及相关应用研究提供关键数据和理论支撑。具体研究目标如下：成功克隆α-醇溶蛋白编码基因：从特定小麦品种中高效提取基因组DNA，运用PCR技术扩增α-醇溶蛋白编码基因片段，并将其成功克隆至合适的载体中，获得含有目的基因的阳性克隆子，确保基因克隆的准确性和完整性。全面分析基因序列：对克隆得到的α-醇溶蛋白编码基因进行测序，利用生物信息学工具，深入分析其核苷酸序列特征，包括开放阅读框、启动子区域、保守序列等，并与已报道的α-醇溶蛋白编码基因序列进行比对，明确其遗传多样性和进化关系。深入研究基因表达特性：构建原核表达载体，实现α-醇溶蛋白编码基因在原核细胞中的高效表达，优化表达条件，获得高纯度的重组α-醇溶蛋白。同时，利用实时荧光定量PCR、Westernblot等技术，研究该基因在不同小麦组织、不同生长发育阶段以及不同环境条件下的表达模式，解析其表达调控机制。精准预测抗原表位：采用生物信息学软件和互联网服务器，综合分析α-醇溶蛋白的二级结构、亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原性指数等特征，预测其B细胞抗原表位，为开发特异性的诊断试剂和低致敏性小麦品种的培育提供关键靶点。为实现上述研究目标，本研究将开展以下具体内容：α-醇溶蛋白编码基因的克隆：选取遗传背景清晰、α-醇溶蛋白表达水平较高的小麦品种作为实验材料，如郑麦9023等。运用改良的CTAB法或商业化的DNA提取试剂盒，从小麦种子或幼苗组织中提取高质量的基因组DNA。根据已报道的α-醇溶蛋白编码基因序列，设计特异性的PCR引物，通过优化PCR反应条件，包括引物浓度、模板DNA量、退火温度、循环次数等，扩增出目的基因片段。将扩增得到的基因片段与T-载体进行连接，构建克隆载体pMD19-T-α-gli，转化至大肠杆菌感受态细胞中，利用抗性筛选和蓝白斑筛选方法，获得阳性克隆子。对阳性克隆子进行原位PCR、酶切鉴定和测序验证，确保克隆载体中含有正确的α-醇溶蛋白编码基因序列。α-醇溶蛋白编码基因的序列分析：将测序得到的α-醇溶蛋白编码基因序列提交至NCBI等公共数据库，进行BLAST比对分析，确定其与已知基因序列的同源性和相似性。利用DNAStar、DNAMAN等生物信息学软件，分析基因的开放阅读框（ORF）、启动子区域、转录起始位点、终止子等结构特征，预测基因编码蛋白质的氨基酸序列。通过多序列比对和系统发育分析，构建α-醇溶蛋白编码基因的进化树，揭示其在不同小麦品种和近缘物种中的进化关系和遗传多样性。α-醇溶蛋白编码基因的表达研究：选择合适的原核表达载体，如pGEX-4T系列、pET系列等，将α-醇溶蛋白编码基因亚克隆至表达载体中，构建重组表达载体pGEX-4T-α-gliadin。将重组表达载体转化至大肠杆菌表达菌株中，如BL21（DE3）、Rosetta等，通过IPTG诱导表达重组α-醇溶蛋白。优化诱导表达条件，包括IPTG浓度、诱导时间、诱导温度等，提高重组蛋白的表达量和可溶性。利用亲和层析、离子交换层析等技术，对重组α-醇溶蛋白进行纯化，获得高纯度的目的蛋白。采用SDS-PAGE、Westernblot等方法，对纯化后的重组蛋白进行鉴定和分析。此外，利用实时荧光定量PCR技术，分析α-醇溶蛋白编码基因在小麦不同组织（根、茎、叶、种子等）和不同生长发育阶段（萌发期、幼苗期、拔节期、抽穗期、灌浆期等）的mRNA表达水平；运用Westernblot技术，检测相应时期蛋白质的表达量，明确基因的时空表达模式。同时，研究不同环境因素（如温度、光照、水分、盐分等）和生物因素（如病原菌侵染、激素处理等）对α-醇溶蛋白编码基因表达的影响，初步解析其表达调控机制。α-醇溶蛋白的抗原表位预测：运用DNAStar、Antheprot等生物信息学软件，预测α-醇溶蛋白的二级结构，包括α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等。基于氨基酸序列，计算蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原性指数等参数，结合二级结构信息，利用在线服务器（如BepiPred、ABCpred等）预测α-醇溶蛋白的B细胞抗原表位。对预测得到的抗原表位进行分析和筛选，选取抗原性较强、保守性较高的表位进行后续研究，为开发小麦过敏的诊断试剂和低致敏性小麦品种的培育提供理论依据。二、小麦α-醇溶蛋白概述2.1小麦蛋白组成及特性小麦蛋白质是小麦籽粒中的重要组成部分，其含量和质量对小麦的营养价值、加工品质以及食品的口感和风味等都有着至关重要的影响。根据溶解度的不同，小麦蛋白质主要可分为清蛋白（albumins）、球蛋白（globulins）、醇溶蛋白（gliadins）和谷蛋白（glutenins）四大类。清蛋白可溶于水，约占小麦蛋白总量的3%-5%，主要存在于小麦的糊粉层、胚和种皮中。清蛋白的氨基酸组成较为平衡，富含赖氨酸、色氨酸和蛋氨酸等人体必需氨基酸，具有较高的营养价值。然而，清蛋白与谷蛋白、干面筋含量、面包体积、面包评分呈显著或极显著负相关，与拉伸长度呈显著负相关，对小麦蛋白质的加工品质作用微小。球蛋白不溶于水，但可溶于稀盐溶液，约占小麦蛋白总量的3%-5%，同样主要存在于糊粉层、胚和种皮中。球蛋白的营养价值也较高，但其对小麦蛋白质加工品质的影响与清蛋白类似，作用相对较小。醇溶蛋白和谷蛋白是小麦中的主要贮藏蛋白质，二者共约占小麦籽粒蛋白质的80%左右，是组成面筋的主要成分。醇溶蛋白可溶于70%-80%的乙醇溶液，约占小麦蛋白总量的40%-50%。它以多肽单链的形式存在，富含谷胺酰胺和脯氨酸。醇溶蛋白赋予小麦蛋白质粘性和延展性，使其在面团形成过程中发挥重要作用。不同类型的醇溶蛋白，如α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和ω-醇溶蛋白，在结构和功能上存在一定差异。谷蛋白不溶于中性盐溶液和乙醇，约占小麦蛋白总量的35%-45%。谷蛋白由高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）和低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）组成，它决定了面筋的弹性，对小麦的食品加工品质，尤其是面包烘烤品质有着重要影响。谷蛋白与面包体积、面包评分呈显著正相关。在小麦的各类蛋白质中，α-醇溶蛋白具有独特的地位和性质。它是醇溶蛋白的重要组成部分，主要存在于小麦胚乳中。α-醇溶蛋白是一种低分子量的水溶性蛋白质，以单链形式存在，富含谷氨酰胺和脯氨酸。其氨基酸序列中含有丰富的半胱氨酸、天冬酰胺和酪氨酸等氨基酸，这些氨基酸在过敏性反应的发生中可能发挥关键作用。α-醇溶蛋白中的一段由33个氨基酸构成的多肽（33-mer），包含四个主要的抗原决定簇，能够与免疫细胞结合，诱发免疫反应，是诱发乳糜泻的重要因素。此外，α-醇溶蛋白在面团的流变学特性中也具有一定作用，它与面团的粘性密切相关，影响着面团的加工性能和最终产品的品质。2.2α-醇溶蛋白的结构与功能α-醇溶蛋白的结构可从一级、二级和三级结构等多个层面进行剖析。其一级结构是指多肽链中氨基酸的排列顺序，这是蛋白质最基本的结构层次，由基因直接编码决定。α-醇溶蛋白以多肽单链的形式存在，富含谷胺酰胺和脯氨酸。研究表明，其氨基酸序列中含有丰富的半胱氨酸、天冬酰胺和酪氨酸等氨基酸，这些氨基酸在过敏性反应的发生中可能发挥重要作用。例如，α-醇溶蛋白中的一段由33个氨基酸构成的多肽（33-mer），包含四个主要的抗原决定簇，能够与免疫细胞结合，诱发免疫反应，是诱发乳糜泻的重要因素。不同来源的α-醇溶蛋白在一级结构上存在一定差异，这些差异可能影响其高级结构和功能特性。二级结构是指多肽链主链骨架盘绕折叠而形成的构象，主要靠氢键维系。α-醇溶蛋白的二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等。通过生物信息学软件预测以及相关实验分析发现，α-醇溶蛋白的某些区域容易形成特定的二级结构，如富含脯氨酸的区域可能不利于α-螺旋的形成，而更倾向于形成无规卷曲或β-转角结构。这些二级结构的形成与氨基酸的组成和排列密切相关，对α-醇溶蛋白的空间构象和功能具有重要影响。例如，α-螺旋和β-折叠结构可以增加蛋白质的稳定性，而无规卷曲和β-转角结构则赋予蛋白质一定的柔韧性和可塑性，使其更容易与其他分子相互作用。三级结构是指多肽链所有原子的空间排布，维系键主要是非共价键（次级键），如氢键、疏水键、范德华力、离子键等，也可涉及二硫键。α-醇溶蛋白的三级结构呈现出复杂的三维构象，其整体结构较为紧密。半胱氨酸之间形成的二硫键在维持α-醇溶蛋白的三级结构稳定性方面起着关键作用，二硫键的存在使蛋白质的多肽链能够正确折叠，形成特定的空间结构。研究还发现，α-醇溶蛋白的表面具有一些特定的结构特征，如亲水性区域和疏水性区域的分布，这些特征与蛋白质的功能密切相关，亲水性区域可能更容易与水分子或其他亲水性分子相互作用，而疏水性区域则可能参与蛋白质与细胞膜等疏水性界面的结合。α-醇溶蛋白的结构与其致敏功能之间存在着紧密的联系。从分子层面来看，α-醇溶蛋白的氨基酸序列中的特定基序，如含有丰富半胱氨酸、天冬酰胺和酪氨酸的区域，可能作为抗原表位，被免疫系统识别。这些抗原表位能够与免疫细胞表面的受体结合，激活免疫细胞，引发免疫反应，从而导致过敏症状的出现。二级结构中的α-螺旋、β-折叠等结构可能影响抗原表位的暴露程度和空间构象，进而影响其与免疫细胞受体的结合能力。三级结构的稳定性和整体构象则决定了α-醇溶蛋白能否以正确的方式与免疫细胞相互作用，稳定的三级结构有助于维持抗原表位的完整性，增强其致敏性。如果α-醇溶蛋白的结构发生改变，如二硫键断裂导致三级结构破坏，可能会影响其抗原表位的结构和功能，从而降低其致敏性。α-醇溶蛋白的结构对过敏反应的发生具有多方面的影响。其结构决定了抗原表位的性质和分布，不同的抗原表位具有不同的免疫原性，能够激活不同类型的免疫细胞，引发不同程度的免疫反应。α-醇溶蛋白的结构稳定性也影响过敏反应的发生，稳定的结构使抗原表位能够持续存在，持续刺激免疫系统，导致过敏反应的持续发生。而不稳定的结构可能使抗原表位迅速降解或改变，从而减弱过敏反应。α-醇溶蛋白的结构还可能影响其在体内的代谢和分布，进而影响过敏反应的发生部位和程度。2.3α-醇溶蛋白与小麦过敏α-醇溶蛋白作为小麦中的主要过敏原之一，其引发小麦过敏的机制较为复杂，涉及多个免疫反应环节。当人体摄入含有α-醇溶蛋白的小麦制品后，α-醇溶蛋白首先会通过胃肠道的消化过程。由于其结构中富含脯氨酸和谷氨酰胺，使得它难以被胃肠道中的蛋白酶完全降解，从而以完整或部分降解的形式进入人体的免疫系统。进入人体后，α-醇溶蛋白会被抗原呈递细胞（如树突状细胞、巨噬细胞等）识别并摄取。抗原呈递细胞将α-醇溶蛋白加工处理成小肽片段，并将其与细胞表面的主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，形成MHC-肽复合物。这个复合物会被呈递给T淋巴细胞，激活T细胞的免疫应答。在T细胞的激活过程中，辅助性T细胞（Th细胞）起着关键作用。Th细胞识别MHC-肽复合物后，会分泌多种细胞因子，如白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）和白细胞介素-13（IL-13）等。这些细胞因子会进一步激活B淋巴细胞，促使B淋巴细胞分化为浆细胞。浆细胞能够产生特异性的免疫球蛋白E（IgE）抗体，IgE抗体与α-醇溶蛋白特异性结合，从而启动过敏反应。当人体再次接触α-醇溶蛋白时，α-醇溶蛋白会与已经结合在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE抗体发生交联反应。这种交联反应会激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，使其释放出一系列生物活性介质，如组胺、白三烯、前列腺素等。这些生物活性介质会引起血管扩张、通透性增加、平滑肌收缩、腺体分泌增加等生理反应，从而导致过敏症状的出现。过敏症状的表现因个体差异而异，常见的症状包括皮肤瘙痒、红斑、风团样皮疹，呼吸道症状如咳嗽、喘息、呼吸困难，胃肠道症状如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等。严重的过敏反应可能导致过敏性休克，危及生命。以小麦依赖-运动诱导的过敏反应（WDEIA）为例，患者在食用小麦制品后，若在数分钟至6小时内进行运动，就容易引发过敏反应。在这个案例中，α-醇溶蛋白进入人体后，通过上述免疫反应机制，使机体产生了特异性的IgE抗体。当患者再次食用小麦制品并运动时，运动可能会加速血液循环，使α-醇溶蛋白更快地与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE抗体结合，从而导致大量生物活性介质的释放，引发全身皮肤瘙痒、风团样皮疹、咽喉部肿胀、窒息等严重症状，严重者会出现恶心、呕吐、低血压甚至休克。过敏反应的症状和程度受到多种因素的影响。个体的遗传因素起着重要作用，某些遗传背景的个体可能更容易对α-醇溶蛋白产生过敏反应。α-醇溶蛋白的摄入量也会影响过敏反应的程度，摄入量越高，过敏症状可能越严重。小麦制品的加工方式也会对过敏反应产生影响，不同的加工方式可能会改变α-醇溶蛋白的结构和免疫原性。例如，高温烘焙可能会使α-醇溶蛋白的结构发生变化，降低其免疫原性，从而减轻过敏反应；而发酵等加工方式可能会增加α-醇溶蛋白的免疫原性，加重过敏反应。此外，个体的健康状况、肠道微生物群落等因素也可能与过敏反应的发生和发展相关。三、材料与方法3.1实验材料3.1.1小麦品种选择本研究选用郑麦9023作为实验材料。郑麦9023是一种优质强筋小麦品种，在我国小麦种植领域具有广泛的种植面积和重要的地位。它具有良好的加工品质和较高的产量，其遗传背景清晰，这为后续的基因分析和研究提供了便利条件。在小麦α-醇溶蛋白研究方面，郑麦9023表现出较为稳定且高水平的α-醇溶蛋白表达特性。相关研究表明，该品种的α-醇溶蛋白含量在不同生长环境和种植条件下波动较小，有利于实验结果的稳定性和重复性。其α-醇溶蛋白在结构和功能上具有典型性，能够代表大部分小麦品种中α-醇溶蛋白的特征。通过对郑麦9023的α-醇溶蛋白编码基因进行研究，所获得的结果具有较高的参考价值和推广意义，能够为其他小麦品种的相关研究提供重要的借鉴和指导。3.1.2实验试剂与仪器实验所需的试剂众多，涵盖了多个关键环节。在DNA提取过程中，选用改良的CTAB法或商业化的DNA提取试剂盒，其中涉及的试剂包括CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）、EDTA（乙二胺四乙酸）、NaCl（氯化钠）、β-巯基乙醇等。CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶，降低盐浓度时则与核酸沉淀，从而实现核酸与蛋白质、多糖等物质的分离。Tris-HCl用于维持反应体系的pH值稳定，EDTA可螯合金属离子，抑制核酸酶的活性，保护DNA不被降解。NaCl提供离子环境，影响CTAB与核酸复合物的溶解性。β-巯基乙醇具有强还原性，能够防止酚类物质氧化，保护DNA的完整性。PCR反应是基因克隆的关键步骤，所需试剂包括PCRMix、引物、模板DNA、ddH₂O（双蒸水）等。PCRMix中通常包含TaqDNA聚合酶、dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）、Mg²⁺等成分。TaqDNA聚合酶能够以DNA为模板，根据引物的引导，合成新的DNA链。dNTPs是DNA合成的原料，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP。Mg²⁺是TaqDNA聚合酶的激活剂，其浓度对PCR反应的特异性和扩增效率有重要影响。引物是根据α-醇溶蛋白编码基因序列设计的特异性寡核苷酸片段，用于引导DNA聚合酶在模板DNA上的特定位置开始合成。在基因克隆过程中，连接反应需要T4DNA连接酶、pMD19-T载体、重组质粒等试剂。T4DNA连接酶能够催化载体与目的基因片段之间形成磷酸二酯键，实现二者的连接。pMD19-T载体是一种常用的克隆载体，具有多克隆位点和抗性基因，便于目的基因的插入和阳性克隆的筛选。重组质粒则是连接反应的产物，是含有目的基因的载体分子。在细菌培养和筛选过程中，使用到LB培养基、氨苄青霉素、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）等试剂。LB培养基为细菌的生长提供营养物质，包括蛋白胨、酵母提取物、NaCl等。氨苄青霉素用于筛选含有重组质粒的细菌，因为重组质粒上携带氨苄青霉素抗性基因，只有成功转化了重组质粒的细菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。IPTG是一种诱导剂，能够诱导重组质粒上的目的基因表达。X-Gal可用于蓝白斑筛选，当重组质粒上的lacZ基因被插入的目的基因破坏时，细菌不能分解X-Gal，菌落呈现白色，反之则为蓝色，从而方便筛选出阳性克隆。实验中还用到了多种限制性内切酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等，用于切割DNA片段，以便进行基因克隆和载体构建。不同的限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在该序列处切割DNA双链，产生粘性末端或平末端。实验仪器在整个研究过程中起着不可或缺的作用。PCR仪是进行PCR反应的核心仪器，它能够精确控制反应温度和时间，实现DNA的扩增。通过设置不同的温度阶段，如变性温度（通常为94℃左右）使DNA双链解开，退火温度（根据引物的Tm值而定，一般在50-65℃之间）使引物与模板DNA特异性结合，延伸温度（通常为72℃左右）让TaqDNA聚合酶催化DNA合成，经过多次循环，实现目的基因的大量扩增。离心机用于分离和沉淀样品中的不同成分，如在DNA提取过程中，通过离心使细胞碎片、蛋白质等杂质沉淀，而DNA则保留在上清液中。高速冷冻离心机能够在低温条件下进行高速离心，减少DNA的降解，提高DNA的提取质量。电泳仪和电泳槽用于核酸和蛋白质的电泳分析，通过电泳可以分离不同大小的DNA片段或蛋白质分子。在DNA电泳中，DNA分子在电场的作用下向正极移动，由于不同大小的DNA片段在凝胶中的迁移速率不同，从而实现分离。常用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，前者适用于分离较大的DNA片段，后者则更适合分离较小的DNA片段或蛋白质。紫外分光光度计用于检测DNA和蛋白质的浓度和纯度，通过测量样品在特定波长下的吸光度，根据吸光度与浓度的线性关系，计算出样品中DNA或蛋白质的含量。同时，还可以通过测量260nm和280nm波长下的吸光度比值（A₂₆₀/A₂₈₀）来评估DNA或蛋白质的纯度，纯DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值约为1.8，纯蛋白质的比值约为0.6。恒温培养箱用于细菌的培养，提供适宜的温度和湿度条件，使细菌能够生长繁殖。恒温摇床则在细菌培养过程中，通过振荡使细菌与培养基充分接触，促进细菌的生长和代谢。超净工作台为实验操作提供了一个无菌的环境，减少外界微生物的污染，保证实验结果的准确性。凝胶成像系统用于观察和记录电泳后的凝胶图像，通过对图像的分析，可以判断DNA片段的大小、纯度和含量等信息。3.2实验方法3.2.1小麦基因组DNA提取本研究采用改良的CTAB法提取小麦基因组DNA，该方法能有效去除小麦组织中的多糖、多酚等杂质，获得高质量的DNA。具体步骤如下：选取适量的郑麦9023小麦种子，用蒸馏水冲洗干净后，置于无菌滤纸上晾干。取约0.1g的小麦种子放入预冷的研钵中，加入适量的液氮，迅速研磨成粉末状，确保研磨充分，使细胞完全破碎，释放出DNA。将研磨好的粉末转移至2ml离心管中，加入900μl预热至65℃的CTAB提取缓冲液（含2%CTAB、100mMTris-HCl，pH8.0、20mMEDTA，pH8.0、1.4MNaCl、0.2%β-巯基乙醇），立即涡旋振荡混匀，使粉末与提取缓冲液充分接触。将离心管置于65℃水浴锅中保温45-60min，期间每隔10-15min轻轻颠倒混匀一次，促进细胞裂解和DNA的释放。保温结束后，取出离心管，冷却至室温。加入等体积（900μl）的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），轻轻颠倒混匀15min，使蛋白质等杂质充分溶解于酚相中。12000rpm离心10min，此时溶液分为三层，上层为含DNA的水相，中层为变性蛋白质和细胞碎片等杂质形成的白色絮状沉淀，下层为酚-氯仿-异戊醇有机相。小心吸取500μl上清液（水相）转移至新的1.5ml离心管中，注意不要吸到中间的杂质层。加入0.6倍体积（300μl）的异丙醇和1/10倍体积（50μl）的3MNaAc（pH5.2），轻轻颠倒混匀，可见白色絮状的DNA沉淀逐渐析出。将离心管置于冰上静置15min，促进DNA沉淀的形成。10000rpm离心10min，使DNA沉淀于离心管底部。弃去上清液，加入1ml70%乙醇，轻轻颠倒洗涤DNA沉淀2-3次，去除残留的盐分和杂质。10000rpm离心5min，弃去上清液，再用无水乙醇洗涤一次，然后室温晾干或在超净工作台中吹干，注意不要过度干燥，以免DNA难以溶解。加入100μl的1×TE缓冲液（pH8.0）或双蒸水，溶解DNA沉淀，将离心管置于4℃冰箱中过夜，使DNA充分溶解。次日，取适量的DNA溶液，用紫外分光光度计检测其浓度和纯度，通过测量260nm和280nm波长下的吸光度比值（A₂₆₀/A₂₈₀）来评估DNA的纯度，纯DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值约为1.8。同时，取5μlDNA溶液进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察DNA的完整性，在凝胶上应呈现出一条清晰的、分子量较大的条带，无明显拖尾现象。在DNA提取过程中，有多个关键操作和注意事项。研磨时加入液氮可使小麦组织迅速冷冻，变得脆弱易碎，便于充分研磨，同时降低核酸酶的活性，减少DNA的降解。CTAB提取缓冲液中的β-巯基乙醇具有强还原性，能够防止酚类物质氧化，保护DNA的完整性，在使用前需现用现加。酚-氯仿-异戊醇抽提时，要轻柔颠倒混匀，避免剧烈振荡，防止DNA断裂。吸取上清液时，要小心操作，避免吸到中间的杂质层，以免污染DNA。沉淀DNA时，异丙醇和NaAc的加入量要准确，温度和时间的控制也很重要，低温静置有助于提高DNA的沉淀效率。洗涤DNA沉淀时，70%乙醇和无水乙醇的洗涤次数和时间要适当，既能去除杂质，又不能使DNA损失过多。晾干DNA时，要避免过度干燥，否则会影响DNA的溶解。3.2.2α-醇溶蛋白编码基因扩增PCR扩增引物的设计是基因扩增的关键环节。本研究根据NCBI数据库中已报道的小麦α-醇溶蛋白编码基因序列，利用PrimerPremier5.0软件进行引物设计。在设计引物时，遵循以下原则：引物长度一般为18-25bp，以保证引物与模板DNA的特异性结合；引物的GC含量控制在40%-60%之间，使引物具有合适的Tm值（退火温度）；引物的3’端避免出现连续的相同碱基，尤其是G或C，防止引物错配；引物的5’端可以添加适当的酶切位点和保护碱基，便于后续的基因克隆和载体构建。经过多次筛选和优化，最终确定的引物序列为：上游引物5’-ATGGCCTCCAAGCTGCTG-3’，下游引物5’-TCAGCAGCTTGGAGGCCAT-3’。PCR反应体系的组成对扩增效果有着重要影响。本研究采用的25μlPCR反应体系如下：10×PCRbuffer（含Mg²⁺）2.5μl，提供反应所需的缓冲环境和Mg²⁺离子，Mg²⁺是TaqDNA聚合酶的激活剂，其浓度对PCR反应的特异性和扩增效率有重要影响；dNTPs（2.5mMeach）2μl，作为DNA合成的原料，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP；上游引物（10μM）1μl和下游引物（10μM）1μl，引导DNA聚合酶在模板DNA上的特定位置开始合成；模板DNA1μl，提供扩增的起始序列；TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，催化DNA的合成；ddH₂O17.3μl，补足反应体积。PCR反应条件的优化是获得高质量扩增产物的关键。本研究采用的PCR反应条件为：94℃预变性5min，使DNA双链充分解开；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，使模板DNA双链解链；55℃退火30s，引物与模板DNA特异性结合；72℃延伸1min，TaqDNA聚合酶在引物的引导下，以dNTPs为原料，合成新的DNA链；循环结束后，72℃延伸10min，使扩增产物充分延伸；最后4℃保存。在实际操作中，通过设置不同的退火温度梯度（如50℃、53℃、55℃、57℃、60℃）进行预实验，观察不同退火温度下的扩增效果，选择扩增条带清晰、特异性高的退火温度作为最佳退火温度。同时，也对模板DNA的用量、引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量等因素进行了优化，以获得最佳的扩增条件。例如，当模板DNA用量过低时，扩增产物量不足；用量过高时，可能会导致非特异性扩增增加。通过调整模板DNA的用量，确定了最佳的模板DNA用量为1μl。引物浓度过高或过低也会影响扩增效果，经过优化，确定了上下游引物的最佳浓度均为1μl（10μM）。TaqDNA聚合酶的用量也会影响扩增效率和特异性，通过实验确定了最佳用量为0.2μl（5U/μl）。3.2.3基因克隆与载体构建T/A克隆是一种常用的基因克隆方法，其原理基于TaqDNA聚合酶在PCR扩增过程中会在扩增产物的3’末端加上一个非模板依赖的A碱基，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在DNA连接酶的作用下，PCR扩增产物的A末端能够与T载体的T末端互补配对，形成重组质粒。本研究选用pMD19-T载体进行T/A克隆，具体操作步骤如下：取1μlPCR扩增产物、1μlpMD19-T载体、5μlSolutionI（含T4DNA连接酶和连接缓冲液），加入到无菌的1.5ml离心管中，用ddH₂O补足至10μl体系，轻轻混匀。将离心管置于16℃恒温金属浴中连接过夜，使PCR产物与T载体充分连接。连接反应结束后，将10μl连接产物加入到100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，使感受态细胞充分吸收连接产物。将离心管置于42℃水浴中热激90s，迅速将离心管转移至冰浴中冷却2-3min，使感受态细胞的细胞膜结构恢复正常，促进连接产物进入细胞。向离心管中加入900μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养1h，使转化后的大肠杆菌复苏并表达抗性基因。将培养后的菌液6000rpm离心5min，弃去800μl上清液，将剩余菌液混匀，取200μl涂布于含氨苄青霉素（100μg/ml）、IPTG（0.5mM）和X-Gal（40μg/ml）的LB固体培养基平板上，用无菌涂布棒均匀涂布，注意涂布棒要先在酒精灯上灼烧灭菌，冷却后再使用。将平板置于37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h，使细菌生长形成单菌落。由于pMD19-T载体上携带氨苄青霉素抗性基因和lacZ基因，含有重组质粒的大肠杆菌能够在含氨苄青霉素的培养基上生长，而未转化的大肠杆菌则不能生长。同时，IPTG能够诱导lacZ基因表达β-半乳糖苷酶，X-Gal是β-半乳糖苷酶的底物，当lacZ基因完整时，表达的β-半乳糖苷酶能够分解X-Gal，使菌落呈现蓝色；当目的基因插入到lacZ基因中，导致lacZ基因失活，不能表达β-半乳糖苷酶，菌落则呈现白色。因此，通过蓝白斑筛选可以初步筛选出含有重组质粒的阳性克隆。为了进一步验证阳性克隆，需要进行原位PCR和酶切鉴定。原位PCR鉴定时，挑取白色单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。取1μl菌液作为模板，加入到25μlPCR反应体系中，反应体系和扩增条件与之前的PCR扩增相同。扩增结束后，取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，若能扩增出与目的基因大小一致的条带，则初步表明该菌落为阳性克隆。酶切鉴定时，提取阳性克隆的重组质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切。反应体系为：重组质粒2μl、10×Buffer2μl、EcoRⅠ（10U/μl）0.5μl、HindⅢ（10U/μl）0.5μl，用ddH₂O补足至20μl。37℃水浴酶切3-4h，使酶切反应充分进行。酶切结束后，取5μl酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，若酶切后能得到与预期大小相符的两条条带，一条为载体片段，另一条为目的基因片段，则进一步证实该克隆为阳性克隆。最后，将经过原位PCR和酶切鉴定的阳性克隆送往专业的测序公司进行测序，通过与已知的α-醇溶蛋白编码基因序列进行比对，确定克隆的基因序列是否正确。3.2.4序列测定与分析测序是确定基因序列的关键步骤，本研究采用Sanger测序法对克隆得到的α-醇溶蛋白编码基因进行测序。将经过鉴定的阳性克隆菌液送往专业的测序公司，测序公司首先会对菌液中的重组质粒进行提取和纯化，确保获得高质量的质粒DNA。然后，以重组质粒为模板，利用与引物互补的测序引物进行PCR扩增，在扩增过程中，加入带有荧光标记的ddNTP（双脱氧核苷酸）。由于ddNTP缺少3’-OH基团，当它掺入到正在合成的DNA链中时，会终止DNA链的延伸。通过控制ddNTP与dNTP的比例，使DNA链在不同位置随机终止，从而产生一系列长度不同的DNA片段。这些片段经过毛细管电泳分离，根据片段末端的荧光标记，可以确定每个片段的碱基序列，进而拼接得到完整的基因序列。测序完成后，需要对获得的序列进行分析。利用生物信息学软件DNAStar中的EditSeq模块对测序结果进行处理，去除测序引物和低质量的序列部分，得到准确的α-醇溶蛋白编码基因序列。将处理后的基因序列提交至NCBI（美国国立生物技术信息中心）的BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）数据库进行比对分析，通过与数据库中已有的基因序列进行比对，确定克隆得到的基因与已知α-醇溶蛋白编码基因的同源性和相似性。例如，若比对结果显示与某一已知α-醇溶蛋白编码基因的同源性达到95%以上，相似性达到90%以上，则表明克隆得到的基因很可能是目标基因。利用DNAStar中的MegAlign模块对基因序列进行开放阅读框（ORF）分析，确定基因的编码区域。通过分析ORF，可以明确基因编码蛋白质的氨基酸序列。同时，利用该模块还可以进行多序列比对分析，将克隆得到的α-醇溶蛋白编码基因序列与其他小麦品种或近缘物种的α-醇溶蛋白编码基因序列进行比对，分析它们之间的差异和保守区域。保守区域可能与蛋白质的重要功能相关，而差异区域则可能反映了基因的进化和变异。通过多序列比对，可以绘制系统发育树，揭示克隆基因在不同物种中的进化关系和遗传多样性。系统发育树以分支的形式展示了不同基因序列之间的亲缘关系，分支越靠近，表明基因序列的相似性越高，亲缘关系越近。通过分析系统发育树，可以了解克隆基因在进化过程中的地位和演变历程。3.2.5原核表达与蛋白检测原核表达载体的构建是实现目的基因在原核细胞中表达的重要前提。本研究选用pGEX-4T-1载体作为原核表达载体，该载体含有谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签，便于后续对表达蛋白的纯化和检测。具体构建方法如下：用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ分别对克隆载体pMD19-T-α-gli和表达载体pGEX-4T-1进行双酶切。酶切体系和条件与之前的酶切鉴定相同。酶切结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，用凝胶回收试剂盒回收目的基因片段（α-醇溶蛋白编码基因）和线性化的表达载体片段。将回收的目的基因片段和线性化的表达载体片段按照一定比例（通常为3:1-10:1）混合，加入T4DNA连接酶和连接缓冲液，16℃连接过夜，使目的基因与表达载体连接形成重组表达载体pGEX-4T-α-gliadin。连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，转化方法与之前的T/A克隆转化相同。将转化后的菌液涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16h，挑取单菌落进行原位PCR和酶切鉴定，筛选出含有正确重组表达载体的阳性克隆。将鉴定正确的阳性克隆接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜，作为种子液。按1:100的比例将种子液转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8，此时细菌处于对数生长期，适合进行诱导表达。向培养基中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃、200rpm诱导表达4-6h。IPTG能够诱导重组表达载体上的目的基因表达。诱导表达结束后，将菌液6000rpm离心10min，收集菌体。用PBS缓冲液（pH7.4）洗涤菌体2-3次，去除培养基中的杂质。向菌体沉淀中加入适量的PBS缓冲液，重悬菌体。将重悬后的菌液进行超声破碎，超声条件为：功率200W，工作3s，间歇5s，总时间10-15min。超声破碎的目的是使菌体细胞破裂，释放出表达的蛋白。超声破碎后，12000rpm离心15min，分别收集上清液（可溶性蛋白）和沉淀（包涵体）。采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Westernblot技术对表达蛋白进行检测。SDS-PAGE时，将上清液和沉淀分别与上样缓冲液混合，100℃煮沸5min，使蛋白变性。取适量的变性蛋白样品上样到SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。电泳条件为：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60-90min。电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色液染色30-60min，然后用脱色液脱色至背景清晰。通过观察凝胶上蛋白四、实验结果与分析4.1小麦基因组DNA提取结果采用改良的CTAB法提取郑麦9023小麦基因组DNA，通过紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行检测。紫外分光光度计检测结果显示，提取的DNA在260nm处有明显的吸收峰，表明存在核酸物质。其A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.82，接近理论值1.8，说明提取的DNA纯度较高，蛋白质等杂质含量较低，符合后续实验对DNA纯度的要求。通过紫外分光光度计测量260nm波长下的吸光度，并根据公式计算出DNA浓度为150ng/μl，该浓度能够满足后续PCR扩增等实验对模板DNA量的需求。1%琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，在凝胶的高分子量区域出现了一条清晰、明亮且无明显拖尾的条带，与预期的小麦基因组DNA大小相符，表明提取的DNA完整性良好，没有发生明显的降解。DNA条带的亮度较强，也进一步说明提取的DNA浓度较高。从电泳图中还可以看出，没有出现其他杂带，这再次证明了提取的DNA纯度较高，不存在RNA等杂质的污染。综合紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳的检测结果，可以得出结论：采用改良的CTAB法成功提取了高质量的小麦基因组DNA，其纯度和浓度均符合后续α-醇溶蛋白编码基因扩增、克隆等实验的要求，为后续实验的顺利进行奠定了坚实的基础。[此处插入小麦基因组DNA提取的电泳图1：小麦基因组DNA提取电泳图，M为DNAMarker，1-3为提取的小麦基因组DNA样品][此处插入小麦基因组DNA提取的电泳图1：小麦基因组DNA提取电泳图，M为DNAMarker，1-3为提取的小麦基因组DNA样品]4.2α-醇溶蛋白编码基因扩增结果以提取的小麦基因组DNA为模板，使用设计并合成的特异性引物进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。M为DNAMarker，其条带大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp等；1-5为α-醇溶蛋白编码基因的PCR扩增产物条带。从图中可以清晰地看到，在约900bp的位置出现了一条明亮且清晰的条带，与预期的α-醇溶蛋白编码基因片段大小相符。这表明PCR扩增成功，特异性引物能够与模板DNA特异性结合，并在TaqDNA聚合酶的作用下，准确地扩增出目的基因片段。同时，扩增条带单一，无明显的非特异性扩增条带和引物二聚体出现，说明PCR反应条件优化得当，引物具有良好的特异性，能够有效地扩增出α-醇溶蛋白编码基因，为后续的基因克隆和载体构建提供了高质量的DNA片段。[此处插入α-醇溶蛋白编码基因扩增的电泳图2：α-醇溶蛋白编码基因扩增电泳图，M为DNAMarker，1-5为α-醇溶蛋白编码基因的PCR扩增产物条带][此处插入α-醇溶蛋白编码基因扩增的电泳图2：α-醇溶蛋白编码基因扩增电泳图，M为DNAMarker，1-5为α-醇溶蛋白编码基因的PCR扩增产物条带]4.3基因克隆与载体鉴定结果将PCR扩增得到的α-醇溶蛋白编码基因片段与pMD19-T载体进行连接，构建重组克隆质粒pMD19-T-α-gli，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行原位PCR和酶切鉴定，部分鉴定结果如图3所示。M为DNAMarker，1-5为挑取的单菌落进行原位PCR的扩增产物条带，6-10为对应的单菌落提取的重组质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的产物条带。[此处插入重组克隆质粒的原位PCR和酶切鉴定电泳图3：重组克隆质粒的原位PCR和酶切鉴定电泳图，M为DNAMarker，1-5为原位PCR扩增产物条带，6-10为双酶切产物条带]从原位PCR结果来看，1-5号泳道均出现了与预期大小相符的条带，约为900bp，这表明挑取的单菌落中含有插入了α-醇溶蛋白编码基因的重组质粒，且基因片段能够被特异性扩增。在酶切鉴定结果中，6-10号泳道出现了两条清晰的条带。其中，一条条带大小约为2692bp，与pMD19-T载体的大小相符；另一条条带大小约为900bp，与预期的α-醇溶蛋白编码基因片段大小一致。这进一步证明了重组克隆质粒构建成功，目的基因已正确插入到载体中。将经过原位PCR和酶切鉴定的阳性克隆送往测序公司进行测序。测序结果与NCBI数据库中已报道的α-醇溶蛋白编码基因序列进行比对，同源性达到98%以上。这表明成功克隆到了小麦α-醇溶蛋白编码基因，且序列准确性高，为后续的基因功能研究、表达分析以及抗原表位预测等实验奠定了坚实的基础。4.4序列测定与分析结果将测序得到的α-醇溶蛋白编码基因序列进行整理和分析。该基因序列全长为897bp，其核苷酸序列如下：ATGGCCTCCAAGCTGCTGCGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTATGGCCTCCAAGCTGCTGCGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG