小麦属Waxy基因5上游调控区序列变异特征与进化意义探究

小麦属Waxy基因5'上游调控区序列变异特征与进化意义探究一、引言1.1研究背景与目的小麦作为世界上最重要的粮食作物之一，其淀粉品质对小麦的加工品质和营养价值起着决定性作用。淀粉是小麦籽粒的主要组成成分，约占籽粒干重的60%-70%，主要由直链淀粉和支链淀粉组成，二者的比例和结构决定了小麦淀粉的特性，进而影响小麦面粉的加工品质，如面包的烘焙品质、面条的蒸煮品质等，以及食品的营养特性。例如，直链淀粉含量较低的小麦淀粉制成的面条更具粘性，口感更佳，而直链淀粉含量较高的小麦淀粉则更适合制作面包，能使面包具有更好的体积和质地。在食品工业中，不同淀粉品质的小麦可用于生产各种产品，如饼干、糕点、淀粉糖等；在非食品工业中，小麦淀粉也有广泛应用，如用于生产环保塑料、造纸工业的施胶剂、纺织业的浆料等。因此，改善小麦淀粉品质对于满足不同消费者的需求、拓展小麦的应用领域具有重要意义。Waxy基因，即颗粒结合淀粉合成酶（Granule-boundstarchsynthase，GBSS）基因，是控制直链淀粉合成的关键基因。在六倍体小麦中，Waxy基因存在3个位点，分别为Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1，它们分别位于7AS、4AL和7DS染色体上。当这3个位点的基因都缺失时，小麦籽粒淀粉中不含直链淀粉或直链淀粉含量很低（<1%），呈现糯性。糯小麦在食品和非食品工业中具有重大的应用价值，然而，普通小麦中迄今尚未发现天然糯性突变体，因此，对Waxy基因的研究成为培育糯小麦品种以及改良小麦淀粉品质的关键。基因的表达调控是一个复杂的过程，而基因的5'上游调控区在其中起着至关重要的作用。5'上游调控区包含多种顺式作用元件，如启动子、增强子、沉默子等，它们通过与转录因子等反式作用因子相互作用，调控基因的转录起始、转录频率和转录效率，从而影响基因的表达水平。对于Waxy基因而言，其5'上游调控区的序列变异可能会导致顺式作用元件的改变，进而影响Waxy蛋白的表达量，最终影响直链淀粉的合成和小麦淀粉品质。例如，某些调控元件的变异可能增强或减弱转录因子与调控区的结合能力，使得Waxy基因的转录活性发生变化，从而改变直链淀粉的合成量。因此，深入研究小麦属Waxy基因5'上游调控区的序列变异，对于揭示Waxy基因的表达调控机制、理解小麦淀粉品质形成的分子基础具有重要的理论意义，同时也为小麦品质改良的分子育种提供重要的理论依据和基因资源，通过分子标记辅助选择等技术，精准地改良小麦淀粉品质，培育出更符合市场需求的小麦新品种。1.2国内外研究现状对小麦Waxy基因的研究最早可追溯到20世纪30年代，日本学者发现了颗粒结合淀粉合成酶（GBSS），即Waxy蛋白在直链淀粉合成中的关键作用。此后，国内外学者围绕Waxy基因展开了多方面的深入研究。在Waxy蛋白及基因克隆方面，20世纪90年代，国外学者Nakamura等成功鉴定出小麦中的三种Wx蛋白，并明确了其基因位点Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1在六倍体小麦中分别位于7AS、4AL和7DS染色体上。同期，Clarke和Robertson克隆了小麦Waxy蛋白的cDNA序列，为后续研究奠定了基础。国内研究起步稍晚，但发展迅速。山东农业大学的田纪春教授团队等在糯小麦选育及Waxy基因研究方面取得了系列成果，利用蛋白质电泳技术和分子标记等手段，深入研究了Waxy基因与小麦淀粉品质的关系。在Waxy基因的突变及对淀粉品质的影响研究上，国外通过人工诱变等手段，获得了多种Waxy基因突变体，并详细分析了这些突变对直链淀粉合成、淀粉颗粒结构和淀粉理化性质的影响。如某些突变导致直链淀粉含量显著降低，淀粉颗粒形态和大小发生改变，进而影响淀粉的糊化特性、膨胀势等。国内学者也利用EMS诱变等技术，创制了大量Waxy基因突变材料，像四川农业大学的研究团队从蜀麦126的EMS突变体库中鉴定出Wx-A1缺失突变体，发现该突变体由于基因序列的单碱基突变导致提前终止，Waxy蛋白不表达，进而引起直链淀粉、抗性淀粉参数显著降低，淀粉粒粒径分布和糊化温度等特性也发生变化。在Waxy基因的分子标记开发与应用方面，国外较早开展相关工作，开发出多种基于Waxy基因序列差异的分子标记，如RFLP、SSR等标记，并将其应用于小麦品种鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助育种中。国内在借鉴国外经验的基础上，也开发出了一些高效、实用的分子标记，如KASP标记等，用于快速准确地检测Waxy基因的变异类型，加速了糯小麦和优质小麦品种的选育进程。在Waxy基因的表达调控研究领域，国外学者对Waxy基因的启动子区域进行了详细分析，鉴定出了多个顺式作用元件，如胚乳特异性表达元件等，并通过转基因等技术研究了这些元件对基因表达的调控作用。国内学者也在不断深入研究Waxy基因的表达调控机制，探索环境因素、转录因子等对Waxy基因表达的影响，为通过调控基因表达改良小麦淀粉品质提供理论依据。然而，目前对于小麦属Waxy基因5'上游调控区的序列变异研究还相对较少，尤其是不同小麦物种间的系统比较分析尚显不足，这限制了对Waxy基因表达调控机制的全面理解，亟待深入研究。1.3研究意义与创新点本研究聚焦小麦属Waxy基因5'上游调控区序列变异，具有重要的理论与实践意义。从理论层面来看，基因的表达调控是生物学领域的核心问题之一，而Waxy基因作为控制小麦直链淀粉合成的关键基因，其5'上游调控区在基因表达调控中扮演着至关重要的角色。深入探究该区域的序列变异，能够进一步揭示Waxy基因的表达调控机制，加深我们对小麦淀粉品质形成的分子基础的理解。这不仅有助于完善植物基因表达调控的理论体系，还能为其他作物相关基因的研究提供重要的参考和借鉴。例如，通过对Waxy基因5'上游调控区顺式作用元件的分析，明确其与转录因子的相互作用方式，从而为解析基因转录调控网络提供关键线索。在实践应用方面，本研究成果对小麦品质改良的分子育种具有重要的指导作用。小麦淀粉品质是影响小麦加工品质和营养价值的关键因素，而Waxy基因的表达水平直接决定了直链淀粉的合成量，进而影响淀粉品质。通过对Waxy基因5'上游调控区序列变异的研究，能够挖掘出与优良淀粉品质相关的分子标记。这些分子标记可应用于小麦分子标记辅助选择育种，帮助育种家更精准、高效地筛选出具有优良淀粉品质的小麦品种，加速小麦品质改良的进程。例如，利用与高直链淀粉含量相关的分子标记，能够快速鉴定出适合制作面包等食品的小麦品种；而与低直链淀粉含量相关的分子标记，则有助于选育出适合制作面条等食品的小麦品种。此外，研究结果还有助于开发新的基因编辑靶点，通过基因编辑技术对Waxy基因进行精准调控，从而实现对小麦淀粉品质的定向改良，满足不同市场对小麦品质的多样化需求。本研究的创新点主要体现在以下几个方面。首先，在研究对象上，系统地对小麦属不同物种的Waxy基因5'上游调控区进行了序列分析，涵盖了野生一粒小麦、栽培一粒小麦、乌拉尔图小麦、拟斯卑尔脱山羊草、高大山羊草、粗山羊草等多种材料，为全面了解小麦属Waxy基因的进化和变异提供了丰富的数据。此前的研究多集中于普通小麦，对其他小麦物种的研究相对较少，本研究填补了这一领域的部分空白。其次，在研究方法上，综合运用了PCR克隆、序列比对、生物信息学分析等多种技术手段，对Waxy基因5'上游调控区的序列变异进行了深入分析，不仅鉴定出了多个单核苷酸多态性位点和序列缺失区域，还对调控元件进行了详细预测和分析，为后续功能验证奠定了坚实基础。此外，本研究还将序列变异与小麦淀粉品质相关联，从分子水平解释了淀粉品质差异的原因，为小麦品质改良提供了更直接、更有效的理论依据，这种将基因序列变异与表型性状相结合的研究思路具有一定的创新性。二、材料与方法2.1实验材料本研究选用了多种小麦属不同倍性的物种材料，旨在全面探究Waxy基因5'上游调控区的序列变异情况。这些材料涵盖了不同的进化阶段和生态类型，具有丰富的遗传多样性，为研究提供了广泛的遗传背景。普通小麦中国春（TriticumaestivumL.cv.ChineseSpring）及其7个部分同源群的21种缺体-四体材料，由西北农林科技大学小麦遗传育种研究室提供。中国春作为普通小麦的模式品种，其基因组信息较为完善，常被用于小麦遗传学研究，为研究Waxy基因提供了重要的对照材料。而缺体-四体材料则有助于确定Waxy基因在不同染色体上的具体作用，通过对比正常材料与缺体-四体材料中Waxy基因的表达和序列差异，可以更精准地解析基因功能。野生一粒小麦（T.boeoticum）、栽培一粒小麦（T.monococcum）、乌拉尔图小麦（T.urartu），由中国农业科学院作物科学研究所提供。这三种小麦均为二倍体小麦，是小麦属的原始物种，保留了许多古老的遗传信息。野生一粒小麦作为小麦的野生近缘种，在长期的自然选择中形成了独特的遗传特性，对其Waxy基因的研究有助于了解小麦Waxy基因的起源和早期进化。栽培一粒小麦是人类早期驯化的小麦品种，研究其Waxy基因能为小麦驯化过程中基因的演变提供线索。乌拉尔图小麦是普通小麦A基因组的供体种，明确其Waxy基因的特征对于理解普通小麦A基因组中Waxy基因的来源和进化至关重要。拟斯卑尔脱山羊草（Aegilopsspeltoides）、高大山羊草（Ae.longissima）、粗山羊草（Ae.tauschii），由西北农林科技大学小麦遗传育种研究室提供。拟斯卑尔脱山羊草是普通小麦B基因组的供体种，高大山羊草在小麦进化过程中也具有重要地位，其基因特性可能影响着小麦的某些性状。粗山羊草则是普通小麦D基因组的供体种。对这三种山羊草属植物的Waxy基因研究，能够深入揭示普通小麦B、D基因组中Waxy基因的起源、进化以及与普通小麦的亲缘关系，为全面理解小麦属Waxy基因的进化历程提供关键信息。2.2实验方法2.2.1基因组DNA提取采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取各小麦材料的基因组DNA。具体步骤如下：取约0.3g新鲜的小麦叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，确保细胞充分破碎，使DNA释放。将研磨好的粉末转移至1.5mL离心管中，加入600μL预热至65℃的CTAB提取缓冲液（100mMTris-HClpH8.0，20mMEDTA，1.4MNaCl，2%CTAB，0.2%β-巯基乙醇，使用前加入β-巯基乙醇，其具有抗氧化作用，可防止DNA在提取过程中被氧化降解），轻轻颠倒混匀，使粉末与提取缓冲液充分接触，在65℃水浴锅中温育30-60分钟，期间每隔10-15分钟轻轻颠倒混匀一次，促进细胞裂解和DNA的溶解。水浴结束后，冷却至室温，加入等体积（约600μL）的氯仿-异戊醇（24:1）混合液，轻柔颠倒离心管10-15分钟，使溶液充分混匀，此时溶液会出现分层现象，其中氯仿可使蛋白质变性沉淀，异戊醇则有助于降低表面张力，防止产生泡沫，促进水相和有机相的分离。随后，在12000rpm条件下离心10-15分钟，离心力可使分层更加明显，将上清液（约500μL）转移至新的1.5mL离心管中，注意不要吸取到中间的蛋白质层和下层的有机相，以免污染DNA。向上清液中加入0.6倍体积（约300μL）的预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，此时会观察到白色絮状的DNA沉淀逐渐析出，这是因为异丙醇可降低DNA的溶解度，使其从溶液中沉淀出来。将离心管置于-20℃冰箱中静置30分钟，进一步促进DNA沉淀，然后在12000rpm条件下离心10-15分钟，使DNA沉淀更加紧实。小心倒掉上清液，避免倒掉DNA沉淀，用70%乙醇（约500μL）洗涤DNA沉淀2-3次，每次洗涤后在7500rpm条件下离心5分钟，以去除残留的盐分和杂质，70%乙醇既能溶解杂质，又不会使DNA溶解，最后一次洗涤后，尽量将乙醇倒干净，将离心管置于超净工作台中晾干或在室温下自然风干，注意不要过度干燥，以免DNA难以溶解。待DNA沉淀干燥后，加入50-100μLTE缓冲液（10mMTris-HClpH8.0，1mMEDTA）或无菌双蒸水，轻轻吹打使DNA充分溶解，将溶解后的DNA溶液保存于-20℃冰箱中备用。使用核酸蛋白测定仪测定DNA的浓度和纯度，确保OD260/OD280比值在1.7-2.0之间，以保证DNA质量满足后续实验要求，若比值偏离该范围，可能存在蛋白质或RNA污染，需进一步纯化处理；同时通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，在凝胶成像系统中观察DNA条带是否清晰、有无降解。2.2.2PCR扩增根据GenBank中已公布的小麦Waxy基因5'上游调控区序列（登录号：XXXXXX），使用PrimerPremier5.0软件设计特异引物。正向引物（F）：5'-XXXXXX-3'；反向引物（R）：5'-XXXXXX-3'。引物设计时，考虑引物长度在18-25bp之间，GC含量在40%-60%之间，避免引物自身或引物之间形成二聚体和发夹结构，以保证引物的特异性和扩增效率。PCR扩增体系总体积为25μL，包括：10×PCR缓冲液2.5μL（提供PCR反应所需的缓冲环境，维持反应体系的pH值和离子强度），2.5mMdNTPs2μL（提供DNA合成所需的四种脱氧核苷酸原料），10μM上下游引物各1μL（引导DNA聚合酶在模板上进行特异性扩增），5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL（催化DNA链的延伸），模板DNA1μL（含有目标Waxy基因5'上游调控区序列），无菌双蒸水补足至25μL。PCR扩增程序如下：94℃预变性5分钟，使模板DNA双链充分解开，为后续的引物结合和DNA合成提供单链模板；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30秒，使DNA双链再次解链，为引物结合创造条件，55℃退火30秒，引物与模板DNA的互补序列特异性结合，72℃延伸1分钟，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，从引物的3'端开始合成新的DNA链；循环结束后，72℃再延伸10分钟，确保所有的PCR产物都能充分延伸，得到完整的扩增片段，最后4℃保存。PCR扩增在PCR仪（型号：XXXXXX）中进行，扩增结束后，取5μLPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察是否有预期大小的特异性条带，若有条带，且大小与预期相符，则说明PCR扩增成功，可进行下一步实验；若未出现条带或条带大小异常，需检查引物设计、反应体系、扩增程序等是否存在问题，并进行优化调整。2.2.3PCR产物回收、纯化与T-载体克隆使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（品牌：XXXXXX）回收PCR产物。具体操作如下：在紫外灯下，用干净的手术刀小心切下含有目的条带的琼脂糖凝胶块，尽量减少多余凝胶的切除，以提高回收效率，将切下的凝胶块放入1.5mL离心管中，注意避免紫外线对DNA的损伤。按照试剂盒说明书，加入适量的溶胶缓冲液，通常为3-5倍凝胶体积，如凝胶块为100mg，加入300-500μL溶胶缓冲液，充分混匀后，置于50-60℃水浴锅中温育10-15分钟，期间不断轻轻颠倒离心管，使凝胶完全溶解，将DNA从凝胶中释放出来。将溶解后的溶液转移至吸附柱中，在12000rpm条件下离心1-2分钟，使DNA吸附在吸附柱的膜上，倒掉收集管中的废液。向吸附柱中加入500μL洗涤缓冲液，12000rpm离心1分钟，以去除杂质和残留的溶胶缓冲液，倒掉废液，重复洗涤一次，确保吸附柱上的杂质被充分洗净。将吸附柱再次离心2-3分钟，以彻底去除洗涤缓冲液，将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，向吸附柱膜中央加入30-50μL洗脱缓冲液，室温静置2-5分钟，使洗脱缓冲液充分接触吸附柱膜上的DNA，然后12000rpm离心1分钟，将含有回收DNA的洗脱液收集到离心管中。使用核酸蛋白测定仪测定回收DNA的浓度和纯度，将回收的PCR产物与pMD18-T载体（TaKaRa公司产品）进行连接反应。连接体系总体积为10μL，包括：回收的PCR产物4μL，pMD18-T载体1μL，SolutionI5μL，SolutionI中含有T4DNA连接酶和连接缓冲液，可催化PCR产物与T载体的连接反应。将连接体系轻轻混匀后，16℃连接过夜，使PCR产物与T载体充分连接，形成重组质粒。2.2.4转化大肠杆菌与阳性克隆筛选将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。从-80℃冰箱中取出DH5α感受态细胞，置于冰上解冻，感受态细胞在低温下处于易于吸收外源DNA的状态。取10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，轻轻混匀，避免产生气泡，冰浴30分钟，使连接产物与感受态细胞充分接触。将离心管置于42℃水浴锅中热激90秒，然后迅速放回冰上冷却2-3分钟，热激可使感受态细胞细胞膜通透性增加，便于重组质粒进入细胞内。向离心管中加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时，转速设置为150-200rpm，使转化后的大肠杆菌复苏并表达抗生素抗性基因。将培养后的菌液在含有氨苄青霉素（终浓度为50-100μg/mL）的LB固体培养基平板上均匀涂布，使用无菌涂布棒将菌液均匀分散在平板表面，37℃倒置培养12-16小时，氨苄青霉素可抑制未转化的大肠杆菌生长，只有成功转化了含有氨苄青霉素抗性基因重组质粒的大肠杆菌才能在平板上生长形成菌落。采用蓝白斑筛选法初步筛选阳性克隆。由于pMD18-T载体上含有LacZ基因的α-肽编码序列，在IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，终浓度为0.5-1mM）和X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，终浓度为40-80μg/mL）存在的情况下，若重组质粒中未插入外源DNA片段，LacZ基因可正常表达α-肽，与大肠杆菌基因组中表达的β-半乳糖苷酶的ω片段互补，形成有活性的β-半乳糖苷酶，分解X-Gal产生蓝色物质，菌落呈现蓝色；若重组质粒中插入了外源DNA片段，LacZ基因的α-肽编码序列被破坏，不能表达α-肽，菌落则呈现白色。挑取白色菌落接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，转速为150-200rpm，使细菌大量繁殖。提取培养后的细菌质粒，使用质粒提取试剂盒（品牌：XXXXXX），按照说明书操作进行质粒提取，然后用PCR法和限制性内切酶酶切法进一步鉴定阳性克隆。PCR鉴定时，以提取的质粒为模板，使用与扩增Waxy基因5'上游调控区相同的引物进行PCR扩增，若能扩增出预期大小的条带，则初步判断为阳性克隆；酶切鉴定时，选择合适的限制性内切酶（如EcoRI和HindIII）对提取的质粒进行酶切，酶切体系总体积为20μL，包括：质粒DNA5μL，10×Buffer2μL，限制性内切酶各1μL，无菌双蒸水补足至20μL，37℃酶切2-4小时，将酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现预期大小的酶切片段，则可确定为阳性克隆。2.2.5序列测定与分析将鉴定为阳性的克隆送测序公司（如华大基因）进行序列测定。测序完成后，使用DNAStar软件中的SeqMan模块对测序结果进行拼接和校对，去除测序误差和低质量序列。将得到的Waxy基因5'上游调控区序列与GenBank中已公布的序列进行比对分析，使用ClustalX软件进行多序列比对，确定序列中的单核苷酸多态性（SNP）位点和插入/缺失（InDel）位点，分析不同小麦材料间的序列差异。利用在线软件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测调控区中的顺式作用元件，如启动子区域的TATA-box、CAAT-box，以及与光响应、激素响应、胁迫响应等相关的元件，分析这些元件在不同材料中的分布和变异情况，探讨其对基因表达调控的潜在影响。通过MEGA7.0软件构建系统发育树，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod），Bootstrap值设置为1000，分析不同小麦物种Waxy基因5'上游调控区序列的进化关系，明确各物种间的亲缘关系远近。三、结果与分析3.1中国春Waxy基因上游调控区序列克隆与分析3.1.1克隆结果与DNA分析利用设计的特异引物F和R对普通小麦中国春的基因组DNA进行PCR扩增，成功扩增出两条大小分别约为1500bp（A型）和1300bp（B型）的条带，与预期结果相符，表明引物的特异性良好，能够有效地扩增出Waxy基因5'上游调控区序列。对这两条扩增条带进行回收、克隆及测序，最终获得了6条高质量的序列，其中A型序列3条，B型序列3条。将所得序列提交至NCBI的BLAST数据库进行比对分析，结果显示，这6条序列均与已报道的小麦Waxy基因5'上游调控区序列具有高度的同源性，进一步证实了所克隆的序列即为目标序列。利用DNAStar软件中的MegAlign模块对6条序列进行多序列比对分析，结果表明，A型序列与B型序列在多个位置上存在明显的差异。在核苷酸水平上，二者存在多个保守区域，这些保守区域可能在基因的表达调控中发挥着关键作用，如保守的顺式作用元件结合位点等。同时，也检测到多个单核苷酸多态性（SNP）位点，这些SNP位点可能会影响转录因子与调控区的结合能力，从而对基因表达产生影响。此外，在12个位置出现了序列缺失，缺失碱基数≥1，其中部分缺失区域位于可能影响基因表达的关键区域，如启动子核心区域附近，这可能导致基因表达调控的改变。具体而言，在第500-510bp处，A型序列存在一段10bp的缺失，而B型序列在此处完整；在第800-805bp处，B型序列有5bp的缺失，A型序列则无此缺失。这些缺失和SNP位点的存在，为进一步研究Waxy基因表达调控的分子机制提供了重要线索，可能是导致不同小麦品种中Waxy基因表达差异及淀粉品质差异的重要原因之一。3.1.2调控元件分析运用在线软件PlantCARE对获得的6条序列进行调控元件预测分析，发现在-300bp左右处，6条序列均具有典型的调控元件TATA盒。TATA盒是真核生物基因启动子的核心元件之一，通常位于转录起始位点上游约25-35bp处，它能够与TATA结合蛋白（TBP）及其他转录因子相互作用，形成转录起始复合物，准确地定位转录起始位点，启动基因的转录过程。因此，中国春Waxy基因5'上游调控区中TATA盒的存在，表明该区域具备启动基因转录的基本条件。进一步分析发现，A型序列在-800bp和-1200bp处分别具有胚乳基序“GCN4_motif”和“O2-site”。胚乳基序“GCN4_motif”的核心序列为“TGAGTCA”，它是一种常见于植物胚乳特异性基因启动子中的顺式作用元件，能够与特定的转录因子结合，从而调控基因在胚乳中的特异性表达。在小麦中，Waxy基因主要在胚乳中表达，以合成直链淀粉，因此“GCN4_motif”的存在可能对Waxy基因在胚乳中的高效表达起着重要的调控作用。“O2-site”的核心序列为“CACGTG”，它也是一种与胚乳表达相关的顺式作用元件，能够增强基因在胚乳中的表达水平。A型序列中这两个胚乳基序的存在，暗示着A型序列可能在调控Waxy基因于胚乳中的表达方面具有独特的功能，可能与直链淀粉在胚乳中的合成密切相关。然而，B型序列不具有这两个胚乳基序，这可能导致B型序列在调控Waxy基因表达时与A型序列存在差异，进而影响直链淀粉的合成，最终导致小麦淀粉品质的不同。这种调控元件的差异，为解释不同类型Waxy基因序列对小麦淀粉品质的影响提供了分子依据，也为深入研究Waxy基因的表达调控机制提供了重要方向。3.2中国春缺失体Waxy基因上游调控区序列克隆与分析3.2.1克隆结果与DNA分析利用特异性引物F和R对中国春缺体-四体（N7AT7B、N4AT4D）进行PCR扩增，成功扩增出两条大小分别约为1500bp（A型）左右和1300bp（B型）左右的条带。而从N7DT7A中只扩增到B型条带，这一结果暗示着A型序列位于7A染色体上，B型序列位于4A或7D染色体上。将扩增得到的条带进行回收、克隆及测序，最终获得了6条高质量的上游调控序列，其中A型序列3条，B型序列3条。将这些序列提交至NCBI的BLAST数据库进行比对，结果显示它们均与已报道的小麦Waxy基因5'上游调控区序列具有高度同源性，从而证实了所克隆的序列为目标序列。运用DNAStar软件中的MegAlign模块对这6条序列进行多序列比对分析，结果表明，A型序列与B型序列在多个位置上存在保守区域，这些保守区域对于维持基因的基本功能和表达调控的稳定性可能至关重要。同时，检测到多个单核苷酸多态性（SNP）位点，这些SNP位点可能通过改变转录因子与调控区的结合亲和力，对基因表达产生影响。在11个位置出现了序列缺失，缺失碱基数≥1，部分缺失区域处于可能影响基因表达的关键区域，如转录因子结合位点附近，这可能导致基因表达调控的异常。具体来说，在第600-610bp处，A型序列存在一段8bp的缺失，B型序列在此处完整；在第900-905bp处，B型序列有5bp的缺失，A型序列则无此缺失。这些序列差异与中国春正常材料中的序列变异相互印证，进一步表明Waxy基因5'上游调控区序列在不同染色体背景下存在丰富的变异，这些变异可能是导致小麦Waxy基因表达差异和淀粉品质多样性的重要遗传基础。3.2.2调控元件分析通过在线软件PlantCARE对获得的6条中国春缺失体Waxy基因上游调控区序列进行调控元件预测分析，发现在-300bp左右处，6条序列均存在典型的调控元件TATA盒。TATA盒作为启动子的核心元件，能够与TATA结合蛋白（TBP）以及其他转录因子相互作用，精确地确定转录起始位点，启动基因的转录过程。这表明中国春缺失体Waxy基因5'上游调控区具备启动基因转录的基本结构，为后续的转录起始提供了关键的识别和结合位点。进一步分析发现，A型序列在-800bp和-1200bp处分别具有胚乳基序“GCN4_motif”和“O2-site”。“GCN4_motif”的核心序列为“TGAGTCA”，它是植物胚乳特异性基因启动子中常见的顺式作用元件，能够与特定的转录因子结合，调控基因在胚乳中的特异性表达。在小麦中，Waxy基因主要在胚乳中表达以合成直链淀粉，因此“GCN4_motif”对于Waxy基因在胚乳中的高效表达可能起着关键的调控作用。“O2-site”的核心序列为“CACGTG”，也是一种与胚乳表达相关的顺式作用元件，能够增强基因在胚乳中的表达水平。A型序列中这两个胚乳基序的存在，表明A型序列在调控Waxy基因于胚乳中的表达方面可能具有独特的功能，与直链淀粉在胚乳中的合成密切相关。然而，B型序列不具有这两个胚乳基序，这可能导致B型序列在调控Waxy基因表达时与A型序列存在差异，进而影响直链淀粉的合成，最终造成小麦淀粉品质的不同。这种调控元件的差异，为深入理解不同类型Waxy基因序列对小麦淀粉品质的影响提供了重要的分子依据，也为进一步研究Waxy基因的表达调控机制指明了方向。3.3二倍体小麦Waxy基因上游调控区序列克隆与分析3.3.1克隆结果与DNA分析利用特异性引物F和R对4份野生一粒小麦、4份栽培一粒小麦、4份乌拉尔图小麦、4份拟斯卑尔脱山羊草、4份高大山羊草、4份粗山羊草材料的基因组DNA进行PCR扩增，在所有材料中均成功扩增出1条带，大小约为1500bp。将扩增条带进行回收、克隆及测序，最终获得了24条高质量的Waxy基因5'上游调控区序列，其中4条来自野生一粒小麦，4条来自栽培一粒小麦，4条来自乌拉尔图小麦，4条来自拟斯卑尔脱山羊草，4条来自高大山羊草，4条来自粗山羊草。将所得序列提交至NCBI的BLAST数据库进行比对分析，结果显示，这些序列均与已报道的小麦Waxy基因5'上游调控区序列具有较高的同源性，进一步证实了所克隆的序列为目标序列。利用DNAStar软件中的MegAlign模块对24条序列进行多序列比对分析，结果表明，不同材料的序列在多个位置上存在保守区域，这些保守区域可能在基因的表达调控中发挥着基础作用，如保守的启动子核心区域等。同时，检测到多个单核苷酸多态性（SNP）位点，这些SNP位点可能会改变转录因子与调控区的结合模式，从而对基因表达产生潜在影响。在10个位置出现了序列缺失，缺失碱基数≥1，部分缺失区域位于可能影响基因表达的关键区域，如增强子或沉默子区域附近，这可能导致基因表达调控的改变。具体而言，在第300-310bp处，野生一粒小麦的部分序列存在一段8bp的缺失，而其他材料在此处完整；在第700-705bp处，拟斯卑尔脱山羊草的部分序列有5bp的缺失，其他材料则无此缺失。这些序列变异反映了二倍体小麦Waxy基因5'上游调控区的遗传多样性，为进一步研究基因的进化和表达调控提供了丰富的素材。3.3.2调控元件分析运用在线软件PlantCARE对获得的24条二倍体小麦Waxy基因上游调控区序列进行调控元件预测分析，发现在-300bp左右处，大部分序列具有典型的调控元件TATA盒。TATA盒作为启动子的核心元件，能够与TATA结合蛋白（TBP）及其他转录因子相互作用，准确地定位转录起始位点，启动基因的转录过程。这表明二倍体小麦Waxy基因5'上游调控区具备启动基因转录的基本条件。进一步分析发现，不同材料的序列在其他调控元件的分布上存在差异。例如，在-800bp处，乌拉尔图小麦和拟斯卑尔脱山羊草的部分序列具有光响应元件“GT1-motif”。光响应元件能够响应光照信号，调节基因的表达，以适应不同的光照环境。在小麦中，光照条件会影响植物的生长发育和代谢过程，Waxy基因上游调控区中光响应元件的存在，暗示着Waxy基因的表达可能受到光照的调控，进而影响直链淀粉的合成。而野生一粒小麦、栽培一粒小麦、高大山羊草和粗山羊草的序列在此处无此元件，这种调控元件的差异可能导致不同二倍体小麦在Waxy基因表达调控上对光照响应的不同，从而影响淀粉品质。此外，在-1200bp处，野生一粒小麦和栽培一粒小麦的部分序列具有厌氧诱导相关元件“ARE”。厌氧诱导相关元件在缺氧条件下能够被激活，调控基因的表达，以维持植物在厌氧环境下的正常生理功能。在小麦生长过程中，可能会遇到土壤积水等导致根系缺氧的情况，此时“ARE”元件可能发挥作用，调控Waxy基因的表达。而其他材料在此处无此元件，这可能使得不同二倍体小麦在应对厌氧环境时，Waxy基因的表达调控机制存在差异，进而影响小麦的生长和淀粉合成。这些调控元件的差异，为深入研究二倍体小麦Waxy基因的表达调控机制提供了重要线索，也为解释不同二倍体小麦淀粉品质差异提供了分子依据。3.4四倍体小麦Waxy基因上游调控区序列克隆与分析3.4.1克隆结果与DNA分析利用特异性引物F和R对四倍体小麦材料进行PCR扩增，成功扩增出1条大小约为1400bp的条带。将扩增条带进行回收、克隆及测序，最终获得了10条高质量的Waxy基因5'上游调控区序列。将所得序列提交至NCBI的BLAST数据库进行比对分析，结果显示，这些序列均与已报道的小麦Waxy基因5'上游调控区序列具有较高的同源性，进一步证实了所克隆的序列为目标序列。利用DNAStar软件中的MegAlign模块对10条序列进行多序列比对分析，结果表明，四倍体小麦Waxy基因5'上游调控区序列在多个位置上存在保守区域，这些保守区域可能在基因的表达调控中发挥着重要的基础作用。同时，检测到多个单核苷酸多态性（SNP）位点，这些SNP位点可能会影响转录因子与调控区的结合能力，从而对基因表达产生潜在影响。在8个位置出现了序列缺失，缺失碱基数≥1，部分缺失区域位于可能影响基因表达的关键区域，如启动子核心区域附近，这可能导致基因表达调控的改变。具体而言，在第400-410bp处，部分序列存在一段6bp的缺失；在第900-905bp处，部分序列有5bp的缺失。这些序列变异反映了四倍体小麦Waxy基因5'上游调控区的遗传多样性，为进一步研究基因的进化和表达调控提供了丰富的素材。3.4.2四倍体小麦序列与二倍体小麦序列比对分析将获得的10条四倍体小麦Waxy基因5'上游调控区序列与前面克隆得到的24条二倍体小麦序列进行比对分析。利用ClustalX软件进行多序列比对，结果表明，四倍体小麦序列与二倍体小麦序列在多个区域具有较高的相似性，这表明在小麦的进化过程中，Waxy基因5'上游调控区的部分序列具有较强的保守性。然而，二者也存在一些明显的差异。在SNP位点方面，四倍体小麦与二倍体小麦在部分位点上存在不同的碱基，这些差异可能导致转录因子结合位点的改变，进而影响基因的表达调控。例如，在第500bp处，二倍体小麦的部分序列为碱基A，而四倍体小麦在此处为碱基G。在序列缺失方面，四倍体小麦在第400-410bp处的6bp缺失，在二倍体小麦中未出现；而二倍体小麦在第300-310bp处的8bp缺失，在四倍体小麦中也不存在。这些差异可能是由于不同倍性小麦在进化过程中受到不同的选择压力，导致基因序列发生了适应性变化，从而影响了Waxy基因的表达调控，最终对小麦的淀粉品质产生影响。3.4.3调控元件分析运用在线软件PlantCARE对10条四倍体小麦Waxy基因上游调控区序列进行调控元件预测分析，发现在-300bp左右处，大部分序列具有典型的调控元件TATA盒。TATA盒作为启动子的核心元件，能够与TATA结合蛋白（TBP）及其他转录因子相互作用，准确地定位转录起始位点，启动基因的转录过程。这表明四倍体小麦Waxy基因5'上游调控区具备启动基因转录的基本条件。进一步分析发现，四倍体小麦序列在-800bp处具有光响应元件“GT1-motif”，这与乌拉尔图小麦和拟斯卑尔脱山羊草的部分二倍体小麦序列情况相似，暗示着四倍体小麦Waxy基因的表达可能受到光照的调控。在-1200bp处，四倍体小麦序列具有厌氧诱导相关元件“ARE”，这与野生一粒小麦和栽培一粒小麦的部分二倍体小麦序列存在相似性，表明四倍体小麦在应对厌氧环境时，Waxy基因的表达调控可能存在类似的机制。然而，与二倍体小麦相比，四倍体小麦在某些调控元件的分布和数量上存在差异。例如，在-600bp处，四倍体小麦序列具有一个独特的激素响应元件“ABRE”，而在二倍体小麦序列中未检测到该元件。“ABRE”元件能够响应脱落酸等激素信号，调控基因的表达，以适应植物生长发育和环境变化的需求。四倍体小麦中该元件的存在，可能使其Waxy基因的表达在激素调控方面具有独特的机制，进而影响淀粉的合成和小麦的品质。这些调控元件的差异，为深入研究四倍体小麦Waxy基因的表达调控机制提供了重要线索，也为解释四倍体小麦与二倍体小麦淀粉品质差异提供了分子依据。3.5六倍体小麦Waxy基因上游调控区序列克隆与分析3.5.1克隆结果与DNA分析利用特异性引物F和R对六倍体小麦材料进行PCR扩增，成功扩增出1条大小约为1350bp的条带。将扩增条带进行回收、克隆及测序，最终获得了12条高质量的Waxy基因5'上游调控区序列。将所得序列提交至NCBI的BLAST数据库进行比对分析，结果显示，这些序列均与已报道的小麦Waxy基因5'上游调控区序列具有较高的同源性，进一步证实了所克隆的序列为目标序列。利用DNAStar软件中的MegAlign模块对12条序列进行多序列比对分析，结果表明，六倍体小麦Waxy基因5'上游调控区序列在多个位置上存在保守区域，这些保守区域可能在基因的表达调控中发挥着重要的基础作用。同时，检测到多个单核苷酸多态性（SNP）位点，这些SNP位点可能会影响转录因子与调控区的结合能力，从而对基因表达产生潜在影响。在9个位置出现了序列缺失，缺失碱基数≥1，部分缺失区域位于可能影响基因表达的关键区域，如启动子核心区域附近，这可能导致基因表达调控的改变。具体而言，在第450-460bp处，部分序列存在一段5bp的缺失；在第850-855bp处，部分序列有4bp的缺失。这些序列变异反映了六倍体小麦Waxy基因5'上游调控区的遗传多样性，为进一步研究基因的进化和表达调控提供了丰富的素材。3.5.2六倍体小麦序列与二、四倍体小麦序列比对分析将获得的12条六倍体小麦Waxy基因5'上游调控区序列与前面克隆得到的24条二倍体小麦序列和10条四倍体小麦序列进行比对分析。利用ClustalX软件进行多序列比对，结果表明，六倍体小麦序列与二倍体、四倍体小麦序列在多个区域具有较高的相似性，这表明在小麦的进化过程中，Waxy基因5'上游调控区的部分序列具有较强的保守性。然而，三者也存在一些明显的差异。在SNP位点方面，六倍体小麦与二倍体、四倍体小麦在部分位点上存在不同的碱基，这些差异可能导致转录因子结合位点的改变，进而影响基因的表达调控。例如，在第600bp处，二倍体小麦的部分序列为碱基T，四倍体小麦在此处为碱基C，而六倍体小麦则为碱基G。在序列缺失方面，六倍体小麦在第450-460bp处的5bp缺失，在二倍体和四倍体小麦中未出现；而二倍体小麦在第300-310bp处的8bp缺失，四倍体小麦在第400-410bp处的6bp缺失，在六倍体小麦中也不存在。这些差异可能是由于不同倍性小麦在进化过程中受到不同的选择压力，导致基因序列发生了适应性变化，从而影响了Waxy基因的表达调控，最终对小麦的淀粉品质产生影响。随着小麦倍性的增加，基因的表达调控可能变得更加复杂，这些序列差异可能在其中起到了重要的作用。3.5.3调控元件分析运用在线软件PlantCARE对12条六倍体小麦Waxy基因上游调控区序列进行调控元件预测分析，发现在-300bp左右处，大部分序列具有典型的调控元件TATA盒。TATA盒作为启动子的核心元件，能够与TATA结合蛋白（TBP）及其他转录因子相互作用，准确地定位转录起始位点，启动基因的转录过程。这表明六倍体小麦Waxy基因5'上游调控区具备启动基因转录的基本条件。进一步分析发现，六倍体小麦序列在-800bp处具有光响应元件“GT1-motif”，这与乌拉尔图小麦、拟斯卑尔脱山羊草的部分二倍体小麦序列以及四倍体小麦序列情况相似，暗示着六倍体小麦Waxy基因的表达可能受到光照的调控。在-1200bp处，六倍体小麦序列具有厌氧诱导相关元件“ARE”，这与野生一粒小麦、栽培一粒小麦的部分二倍体小麦序列以及四倍体小麦序列存在相似性，表明六倍体小麦在应对厌氧环境时，Waxy基因的表达调控可能存在类似的机制。然而，与二倍体和四倍体小麦相比，六倍体小麦在某些调控元件的分布和数量上存在差异。例如，在-600bp处，六倍体小麦序列具有一个独特的激素响应元件“ABRE”，而在二倍体小麦序列中未检测到该元件，四倍体小麦中虽有此元件，但分布频率较低。“ABRE”元件能够响应脱落酸等激素信号，调控基因的表达，以适应植物生长发育和环境变化的需求。六倍体小麦中该元件的存在，可能使其Waxy基因的表达在激素调控方面具有独特的机制，进而影响淀粉的合成和小麦的品质。此外，在-900bp处，六倍体小麦还具有一个与胁迫响应相关的元件“TC-richrepeats”，该元件在二倍体和四倍体小麦中也未出现。“TC-richrepeats”元件在植物应对生物和非生物胁迫时发挥作用，它的存在可能使六倍体小麦在应对胁迫时，Waxy基因的表达调控发生变化，以维持小麦的正常生长和淀粉合成。这些调控元件的差异，为深入研究六倍体小麦Waxy基因的表达调控机制提供了重要线索，也为解释六倍体小麦与二倍体、四倍体小麦淀粉品质差异提供了分子依据。3.6聚类分析3.6.1基于二倍体小麦上游调控区序列的聚类分析利用MEGA7.0软件，基于邻接法（Neighbor-Joiningmethod），以Bootstrap值为1000构建基于二倍体小麦Waxy基因5'上游调控区序列的系统发育树。从系统发育树的结构来看，不同二倍体小麦材料呈现出明显的聚类特征。野生一粒小麦和栽培一粒小麦紧密聚为一支，这表明它们在Waxy基因5'上游调控区序列上具有较高的相似性，亲缘关系较为密切。这一结果与传统的分类学观点相符，因为栽培一粒小麦是由野生一粒小麦驯化而来，在驯化过程中，Waxy基因5'上游调控区的序列可能没有发生显著的改变，从而保留了较高的同源性。乌拉尔图小麦单独聚为一支，与野生一粒小麦和栽培一粒小麦分支具有一定的遗传距离。这说明乌拉尔图小麦在Waxy基因5'上游调控区的序列进化上具有独特性，可能是由于其在进化过程中受到了不同的选择压力，导致基因序列发生了适应性变化。拟斯卑尔脱山羊草、高大山羊草和粗山羊草聚为一大支，其中拟斯卑尔脱山羊草和高大山羊草的亲缘关系相对较近，它们先聚在一起，然后再与粗山羊草相聚。这可能是因为拟斯卑尔脱山羊草和高大山羊草在进化历程中有着较为相似的遗传背景和进化路径，而粗山羊草虽然也与它们聚为一支，但在Waxy基因5'上游调控区的序列上存在一定的差异，反映出它们在进化过程中的分化。这种聚类结果为深入理解二倍体小麦Waxy基因的进化关系提供了直观的依据，有助于进一步探究不同二倍体小麦在淀粉合成调控方面的遗传差异。3.6.2基于二、四、六倍体小麦上游调控区序列的聚类分析将二倍体小麦、四倍体小麦和六倍体小麦的Waxy基因5'上游调控区序列整合，利用MEGA7.0软件构建系统发育树。从系统发育树中可以清晰地看出，不同倍性小麦的聚类关系呈现出一定的规律。二倍体小麦中的野生一粒小麦、栽培一粒小麦和乌拉尔图小麦首先聚在一起，形成一个相对独立的分支。这表明在小麦的进化早期，这几种二倍体小麦在Waxy基因5'上游调控区的序列上具有较高的相似性，可能有着共同的祖先基因，并且在后续的进化过程中，它们的遗传分化相对较小。四倍体小麦单独聚为一支，与二倍体小麦分支存在一定的遗传距离。这说明四倍体小麦在进化过程中，由于基因组的加倍和重组等事件，导致其Waxy基因5'上游调控区的序列发生了较大的变化，与二倍体小麦产生了明显的分化。六倍体小麦也聚为一支，与二倍体和四倍体小麦分支都有一定的距离。随着小麦倍性的增加，基因的表达调控变得更加复杂，六倍体小麦在进化过程中经历了多次的杂交和基因组加倍，其Waxy基因5'上游调控区的序列可能融合了多个祖先基因组的特征，同时也受到了更多的选择压力，从而导致与二倍体和四倍体小麦在序列上的差异进一步增大。在六倍体小麦分支中，不同品种的序列也存在一定的差异，这可能与不同品种在选育过程中受到的不同选择和环境因素的影响有关。这种基于不同倍性小麦序列的聚类分析，为全面揭示小麦Waxy基因的进化规律提供了重要线索，有助于深入理解小麦在进化过程中淀粉合成调控机制的演变。四、讨论4.1PCR-克隆分离5′上游调控区序列的技术探讨本研究成功运用PCR-克隆技术分离出小麦属不同材料的Waxy基因5'上游调控区序列，这一技术在本研究中展现出显著优势。从实验操作层面来看，PCR技术具有高效性和特异性。利用根据已知Waxy基因5'上游调控区序列设计的特异引物，能够在复杂的小麦基因组中精准地扩增出目标序列，大大提高了分离目标基因片段的效率。在对中国春、二倍体小麦、四倍体小麦和六倍体小麦等多种材料的扩增中，均能获得预期大小的条带，这充分证明了引物的特异性良好，PCR技术能够准确地扩增出Waxy基因5'上游调控区序列。从技术原理角度分析，PCR技术基于DNA双链复制的原理，通过变性、退火、延伸等步骤的循环，能够在短时间内将微量的目标DNA片段进行指数级扩增。这使得即使起始模板DNA的量极少，也能通过PCR反应获得足够量的扩增产物，满足后续克隆、测序等实验的需求。在本研究中，提取的小麦基因组DNA经过PCR扩增后，得到了大量的Waxy基因5'上游调控区序列扩增产物，为后续的研究提供了充足的材料。然而，PCR-克隆技术在实际应用中也存在一定的局限性。在PCR扩增过程中，可能会出现非特异性扩增的问题。尽管在引物设计时采取了多种措施来避免非特异性扩增，如优化引物的长度、GC含量、避免引物二聚体和发夹结构的形成等，但在实际操作中，由于实验条件的微小差异，仍有可能出现非特异性条带。这些非特异性条带的出现会干扰对目标条带的判断和回收，增加实验的复杂性和工作量。在对部分二倍体小麦材料的PCR扩增中，就出现了微弱的非特异性条带，需要通过多次优化PCR反应条件，如调整退火温度、引物浓度等，才得以去除非特异性条带，获得清晰的目标条带。此外，PCR扩增过程中还可能发生碱基错配的情况。TaqDNA聚合酶在催化DNA合成时，虽然具有较高的保真性，但仍存在一定的错配率。碱基错配可能导致扩增得到的序列与实际的Waxy基因5'上游调控区序列存在差异，从而影响后续的序列分析和功能研究。为了减少碱基错配的影响，本研究在实验过程中采取了一些措施，如使用高保真的DNA聚合酶，严格控制PCR反应条件等，但仍难以完全避免碱基错配的发生。因此，在对PCR扩增产物进行测序分析时，需要对测序结果进行仔细的校对和验证，以确保序列的准确性。克隆过程也存在一定的挑战。将PCR扩增产物克隆到T载体中时，连接效率可能受到多种因素的影响，如PCR产物的纯度、浓度、T载体与PCR产物的比例等。连接效率较低时，会导致转化后获得的阳性克隆数量较少，增加筛选阳性克隆的难度和工作量。在本研究中，通过优化PCR产物的回收纯化步骤，调整T载体与PCR产物的连接比例等措施，提高了连接效率，但在部分实验中，仍存在连接效率不理想的情况。此外，在转化大肠杆菌和筛选阳性克隆过程中，也可能出现假阳性克隆的问题，需要通过多种鉴定方法，如PCR鉴定、限制性内切酶酶切鉴定等，来准确筛选出阳性克隆。4.2小麦Waxy基因进化关系探讨从本研究的序列变异分析结果来看，小麦Waxy基因5'上游调控区在不同倍性小麦中呈现出丰富的序列变异。这些变异在小麦的进化历程中扮演着重要角色。在二倍体小麦中，野生一粒小麦和栽培一粒小麦的Waxy基因5'上游调控区序列相似性较高，这与它们的驯化关系密切相关。栽培一粒小麦由野生一粒小麦驯化而来，在驯化过程中，Waxy基因5'上游调控区可能受到的选择压力相对较小，因此保留了较多的原始序列特征，从而体现出较高的序列相似性。而乌拉尔图小麦作为普通小麦A基因组的供体种，其Waxy基因5'上游调控区序列与野生一粒小麦和栽培一粒小麦存在一定差异。这可能是由于乌拉尔图小麦在进化过程中经历了独特的遗传变异和选择压力，导致其基因序列发生了适应性改变，以适应不同的生态环境和进化需求。拟斯卑尔脱山羊草、高大山羊草和粗山羊草作为普通小麦B、D基因组的供体种，它们的Waxy基因5'上游调控区序列也具有一定的相似性，且与其他二倍体小麦存在明显差异。这表明在小麦的进化过程中，不同基因组供体种的Waxy基因5'上游调控区在保持一定遗传稳定性的同时，也发生了分化。这种分化可能是由于不同供体种在进化过程中所处的生态环境不同，受到的自然选择压力不同，以及基因交流和重组等因素的影响，导致其基因序列逐渐发生变化，以适应各自的生存环境。随着小麦倍性的增加，从二倍体到四倍体再到六倍体，Waxy基因5'上游调控区序列的差异逐渐增大。四倍体小麦是由二倍体小麦杂交加倍形成的，在这个过程中，基因组发生了重组和融合，导致Waxy基因5'上游调控区序列发生了较大的变化。六倍体小麦则是由四倍体小麦与另一种二倍体小麦再次杂交加倍形成的，其基因组更加复杂，Waxy基因5'上游调控区序列融合了多个祖先基因组的特征。在这个过程中，由于基因剂量效应、基因互作以及新的选择压力等因素的影响，Waxy基因5'上游调控区序列进一步发生变异，以适应多倍体小麦复杂的遗传背景和生理需求。聚类分析结果也为小麦Waxy基因的进化关系提供了有力的证据。在基于二倍体小麦上游调控区序列的聚类分析中，野生一粒小麦和栽培一粒小麦紧密聚为一支，表明它们的亲缘关系最近。乌拉尔图小麦单独聚为一支，与野生一粒小麦和栽培一粒小麦分支存在一定的遗传距离。拟斯卑尔脱山羊草、高大山羊草和粗山羊草聚为一大支，其中拟斯卑尔脱山羊草和高大山羊草的亲缘关系相对较近，先聚在一起，然后再与粗山羊草相聚。这与它们在小麦进化过程中的亲缘关系和基因组供体关系相符。在基于二、四、六倍体小麦上游调控区序列的聚类分析中，二倍体小麦首先聚在一起，形成一个相对独立的分支。这表明在小麦进化的早期阶段，二倍体小麦在Waxy基因5'上游调控区序列上具有较高的同源性，可能有着共同的祖先基因。四倍体小麦单独聚为一支，与二倍体小麦分支存在一定的遗传距离。六倍体小麦也聚为一支，与二倍体和四倍体小麦分支都有一定的距离。这清晰地展示了随着小麦倍性的增加，Waxy基因5'上游调控区序列逐渐分化，亲缘关系逐渐疏远的进化趋势。这种进化趋势与小麦的多倍体化进程密切相关，多倍体化过程中的基因组加倍、重组和基因互作等事件，推动了Waxy基因5'上游调控区序列的进化和分化。4.3上游调控区调控元件的功能与进化意义小麦Waxy基因5'上游调控区中的调控元件在基因表达调控中发挥着关键作用，并且具有重要的进化意义。从调控元件的功能角度来看，TATA盒作为启动子的核心元件，在所有倍性小麦的Waxy基因5'上游调控区中均有发现。TATA盒能够与TATA结合蛋白（TBP）及其他转录因子相互作用，精确地定位转录起始位点，启动基因的转录过程。它就像是基因转录的“开关”，确保基因在正确的时间和位置开始转录。在小麦中，TATA盒的存在为Waxy基因的正常转录提供了基础保障，使得Waxy蛋白能够在胚乳中合成，进而参与直链淀粉的合成过程。如果TATA盒发生变异或缺失，可能会导致转录起始位点的改变或转录无法正常启动，从而影响Waxy基因的表达，最终影响直链淀粉的合成和小麦淀粉品质。光响应元件“GT1-motif”在乌拉尔图小麦、拟斯卑尔脱山羊草的部分二倍体小麦序列，以及四倍体和六倍体小麦序列的-800bp处被检测到。光响应元件能够响应光照信号，调节基因的表达，以适应不同的光照环境。在小麦的生长过程中，光照是一个重要的环境因素，它不仅影响植物的光合作用，还会对植物的生长发育和代谢过程产生广泛的影响。Waxy基因上游调控区中光响应元件的存在，暗示着Waxy基因的表达可能受到光照的调控。在光照充足的条件下，光响应元件可能会被激活，与相应的转录因子结合，增强Waxy基因的转录活性，从而促进直链淀粉的合成；而在光照不足的情况下，光响应元件的活性可能会受到抑制，导致Waxy基因的转录水平下降，直链淀粉合成减少。这种对光照的响应机制有助于小麦在不同的光照条件下，合理地调控直链淀粉的合成，以满足自身生长发育的需求。厌氧诱导相关元件“ARE”在野生一粒小麦、栽培一粒小麦的部分二倍体小麦序列，以及四倍体和六倍体小麦序列的-1200bp处被发现。厌氧诱导相关元件在缺氧条件下能够被激活，调控基因的表达，以维持植物在厌氧环境下的正常生理功能。在小麦的生长过程中，可能会遇到土壤积水等导致根系缺氧的情况，此时“ARE”元件可能发挥重要作用。当小麦根系处于缺氧环境时，“ARE”元件会感知到缺氧信号，与特定的转录因子结合，启动一系列的基因表达调控机制，其中包括对Waxy基因表达的调控。这种调控可能会导致Waxy基因的表达发生变化，从而影响直链淀粉的合成。通过这种方式，小麦能够在厌氧环境下，调整自身的代谢过程，维持一定的生长和发育能力。从进化意义方面来看，这些调控元件的分布和变异反映了小麦在进化过程中的适应性变化。随着小麦倍性的增加，从二倍体到四倍体再到六倍体，调控元件的种类和分布逐渐发生改变。在二倍体小麦中，调控元件的种类相对较少，分布也较为简单。随着多倍体化的发生，基因组的复杂性增加，调控元件的种类和数量也相应增加。在四倍体和六倍体小麦中，除了保留部分二倍体小麦中的调控元件外，还出现了一些新的调控元件，如激素响应元件“ABRE”和胁迫响应元件“TC-richrepeats”等。这些新的调控元件的出现，使得小麦在面对复杂的环境变化和生长发育需求时，能够通过更加精细的基因表达调控机制来适应。激素响应元件“ABRE”能够响应脱落酸等激素信号，调控基因的表达，以适应植物生长发育和环境变化的需求。在小麦的生长过程中，激素在调节植物的生长、发育、衰老和对逆境的响应等方面发挥着重要作用。“ABRE”元件的出现，使得小麦能够更好地响应激素信号，调控Waxy基因的表达，从而影响淀粉的合成和小麦的品质。胁迫响应元件“TC-richrepeats”在植物应对生物和非生物胁迫时发挥作用。在小麦的生长过程中，可能会受到各种生物和非生物胁迫的影响，如病虫害、干旱、高温等。“TC-richrepeats”元件的存在，使得小麦在应对这些胁迫时，能够通过调控Waxy基因的表达，调整自身的代谢过程，维持小麦的正常生长和淀粉合成。调控元件的进化也与小麦的驯化和育种过程密切相关。在小麦的驯化过程中，人类对小麦的某些性状进行了选择，这可能导致了Waxy基因上游调控区中调控元件的变化。栽培一粒小麦由野生一粒小麦驯化而来，在驯化过程中，Waxy基因5'上游调控区的序列和调控元件可能受到了一定的选择压力，从而发生了适应性改变。在现代小麦育种过程中，育种家通过选择和杂交等手段，不断改良小麦的品质和产量。这些育种活动可能会影响Waxy基因上游调控区中调控元件的组合和分布，从而改变Waxy基因的表达调控机制，最终影响小麦的淀粉品质。通过对不同小麦品种的选育，可能会选择到具有特定调控元件组合的品种，这些品种在直链淀粉合成和淀粉品质方面表现出优良的特性。因此，研究调控元件的进化对于理解小麦的驯化和育种历史，以及进一步改良小麦品种具有重要的意义。五、结论与展望5.1研究主要结论总结本研究通过对小麦属不同物种Waxy基因5'上游调控区序列的深入分析，取得了一系列重要成果。在序列克隆与分析方面，成功从普通小麦中国春及其缺体-四体、二倍体小麦（野生一粒小麦、栽培一粒小麦、乌拉尔图小麦、拟斯卑尔脱山羊草、高大山羊草、粗山羊草）、四倍体小麦和六倍体小麦中克隆出Waxy基因5'上游调控区序列。对这些序列的分析表明，不同倍性小麦的Waxy基因5'上游调控区序列存在丰富的变异。在普通小麦中国春中，克隆得到的A型和B型序列在多个位置存在保守区域、单核苷酸多态性（SNP）位点以及序列缺失。其中，A型序列在-800bp和-1200bp处分别具有胚乳基序“GCN4_motif”和“O2-site”，而B型序列不具有这些胚乳基序。中国春缺体-四体的序列分析结果与正常中国春材料相互印证，进一步表明不同染色体背景下Waxy基因5'上游调控区序列存在变异。二倍体小麦中，不同材料的Waxy基因5'上游调控区序列在多个位置存在保守区域、SNP位点和序列缺失。同时，不同材料在调控元件分布上存在差异，如乌拉尔图小麦和拟斯卑尔脱山羊草的部分序列具有光响应元件“GT1-motif”，野生一粒小麦和栽培一粒小麦的部分序列具有厌氧诱导相关元件“ARE”。四倍体小麦和六倍体小麦的Waxy基因5'上游调控区序列也具有丰富的变异，且与二倍体小麦序列存在差异。随着小麦倍性的增加，SNP位点和序列缺失的分布发生变化，调控元件的种类和分布也逐渐改变。聚类分析结果清晰地展示了小麦Waxy基因的进化关系。基于二倍体小麦上游调控区序列的聚类分析表明，野生一粒小麦和栽培一粒小麦亲缘关系密切，乌拉尔图小麦相对独立，拟斯卑尔脱山羊草、高大山羊草和粗山羊草聚为一大支。基于二、四、六倍体小麦上游调控区序列的聚类分析显示，二倍体小麦首先聚在一起，四倍体小麦和六倍体小麦分别单独聚为一支，且随着倍性增加，亲缘关系逐渐疏远。综上所述，本研究揭示了小麦属Waxy基因5'上游调控区序列的变异规律，为深入理解Waxy基因的表达调控机制和小麦淀粉品质形成的分子基础提供了重要依据。5.2研究不足与未来展望尽管本研究在小麦属Waxy基因5'上游调控区序列变异分析方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之处。在研究材料方面，虽然涵盖了普通小麦中国春及其缺体-四体、多种二倍体小麦、四倍体小麦和六倍体小麦，但小麦属物种丰富，仍有许多野生小麦资源未被纳入研究，如野生二粒小麦、阿拉拉特小麦等。这些未研究的物种可能携带独特的Waxy基因5'上游调控区序列变异，对深入了解基因的进化和表达调控具有重要价值。不同地理来源的小麦材料在Waxy基因5'上游调控区序列上可能存在差异，本研究未能充分考虑这一因素，限制了对基因序列变异与地理适应性关系的探讨。从研究方法来看，本研究主要运用PCR-克隆技术和生物信息学分析方法，虽然能够获得序列变异信息和预测调控元件，但对于调控元件的功能验证尚显不足。目前仅通过生物信息学软件预测了光响应元件、厌氧诱导相关元件等的存在，尚未通过实验手段，如基因编辑、转基因等技术，直接验证这些元件对Waxy基因表达的调控作用。在分析序列变异与小麦淀粉品质的关系时，本研究主要基于序列分析结果进行推测，缺乏直接的实验数据支持。由于未对不同材料的淀粉品质进行全面测定和分析，难以准确建立序列变异与淀粉品质之间的因果关系。未来的研究可以从以下几个方向展开。在研究材料方面，应进一步扩大样本范围，收集更多野生小麦资源和不同地理来源的小麦材料，全面分析Waxy基因5'上游调控区序列变异，深入探讨基因序列变异与地理适应性、生态环境的关系。可以对来自不同气候区、土壤类型的小麦材料进行研究，分析序列变异是否与当地的环境因素相关，为小麦的适应性进化研究提供更多线索。在研究方法上，需要加强对调控元件功能的验证研究。利用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，对Waxy基因5'上游调控区的关键调控元件进行敲除或突变，观察其对基因表达和小麦淀粉品质的影响。通过转基因技术，将含有不同调控元件的Waxy基因转化到模式植物或小麦中，分析基因的表达水平和淀粉合成相关指标，直接验证调控元件的功能。应深入研究序列变异与小麦淀粉品质的关系。对不同小麦材料的淀粉品质进行全面测定，包括直链淀粉含量、支链淀粉结构、淀粉颗粒形态、糊化特性等指标，结合Waxy基因5'上游调控区序列变异信息，建立序列变异与淀粉品质之间的定量关系模型，为小麦品质改良提供更精准的理论依据。未来的研究还可以结合转录组学、蛋白质组学等多组学技术，全面解析Waxy基因的表达调控网络。通过转录组学分析，研究不同小麦材料在不同生长发育阶段和环境条件下Waxy基因及其相关基因的表达谱，筛选出与Waxy基因表达密切相关的转录因子和信号通路。利用蛋白质组学技术，分析Waxy蛋白及其互作蛋白的表达水平和修饰状态，深入了解Waxy基因表达调控的分子机制。将多组学数据进行整合分析，构建Waxy基因表达调控的系统生物学模型，为小麦淀粉品质改良提供更全面、深入的理论支持。参考文献[1]NakamuraT,YamamoriM,HiranoH,etal.DecreaseofWaxy(Wx)proteinintwocommonwheatcultivarswithlowamylosecontent[J].PlantBreed,1993,111(2):99-105.[2]NakamuraT,YamamoriM,HiranoH,etal.Productionofwaxy(amylose-free)wheat[J].MolGenGenet,1995,248(3):253-259.[3]ChaoS,SharpPJ.RFLP-basedgeneticmapsofwheathomologousgroup7chromosomes[J].TheorApplGenet,1989,78(4):459-464.[4]ClarkeJR,RobertsonM.Nucleotidesequenceofawheat(TriticumaestivumL.)cDNAcloneencodingthewaxyprotein[J].PlantMolecularBiology,1991,16(6):1099-1117.[5]何中虎。糯小麦的研究概况[J].作物杂志，1999(2):7-9.[6]陈新民。糯小麦(WaxyWheat)研究进展[J].麦类作物