小麦穗发芽抗性中Vp1与DFR基因的分子遗传学解析：等位变异、表达调控与育种启示

小麦穗发芽抗性中Vp1与DFR基因的分子遗传学解析：等位变异、表达调控与育种启示一、引言1.1研究背景与意义小麦作为全球最重要的粮食作物之一，其产量和品质对粮食安全至关重要。然而，小麦成熟期穗发芽（Pre-harvestSprouting，PHS）是一种世界性的自然灾害，严重影响小麦的产量和品质。据统计，全球每年因小麦穗发芽造成的经济损失高达10亿美元，仅在面包小麦中，这一损失就相当显著。在中国，南方水稻栽培区受收获季节梅雨影响，穗发芽会造成常规稻6%栽培面积的损失，杂交稻损失则高达20%。随着全球气候变暖，农业生产上水稻小麦等在后期成熟期常常遭遇连阴天气，使得穗发芽灾害频繁发生，如中国长江中下游以及黄淮地区等冬小麦主产区在2013、2015及2016年均遭受严重的穗发芽灾害。小麦穗发芽是基因与环境互作的结果，涉及众多影响因素，其中种子自身的休眠特性是影响穗发芽的主要因素。休眠是指种子在适合它生长的条件（温度、水分和氧气等）下仍不能发芽的现象，是多数高等植物共有的特点。在作物驯化过程中，由于更多考虑高产、优质、抗病虫及耐受逆境性状，同时保证在生产中种子具有一致的萌发特性，常常忽视了对种子适度休眠的保留，从而导致很多作物如小麦会发生穗发芽现象。Vp1（Viviparous-1）基因在植物种子休眠和萌发过程中起着关键作用，它编码一种转录因子，参与脱落酸（ABA）信号转导途径，调控种子的休眠和萌发。研究表明，Vp1基因的等位变异与小麦穗发芽抗性密切相关。不同的Vp1等位基因在种子休眠和对ABA的敏感性上存在差异，进而影响小麦的穗发芽抗性。深入研究Vp1基因的等位变异、表达与调控机制，对于理解小麦穗发芽抗性的分子机理具有重要意义。红粒小麦由于种皮中含有花色素苷，通常比白粒小麦具有更强的穗发芽抗性。二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）基因是花色素苷合成途径中的关键基因，其等位变异和表达水平可能影响花色素苷的合成，从而影响红粒小麦的穗发芽抗性。对DFR基因的研究有助于揭示红粒小麦抗穗发芽的分子机制。本研究围绕小麦抗穗发芽相关Vp1和DFR基因展开，旨在分析它们的等位变异类型，研究其表达特性和调控机制，为小麦抗穗发芽育种提供理论依据和基因资源。通过对这些基因的深入研究，有望挖掘出与穗发芽抗性紧密相关的分子标记，用于分子标记辅助育种，提高小麦抗穗发芽品种的选育效率，从而减少穗发芽对小麦生产的危害，保障粮食安全。1.2国内外研究现状国内外对小麦穗发芽抗性基因的研究已取得了一定进展。在种子休眠相关基因研究中，Vp1基因备受关注。Vp1基因最早在玉米中被发现，它编码的转录因子参与ABA信号转导途径，对种子休眠和萌发起关键调控作用。在小麦中，研究者已鉴定出多个Vp1等位基因。如在对168份CIMMYT小麦的研究中，鉴定出5个位于3A染色体上的新Vp1等位基因（Vp1Ab、Vp1Ac、Vp1Ad、Vp1Ae、Vp1Af），这些等位基因在第三内含子处的CT重复数量存在差异，且不同等位基因类型的品种在ABA敏感性和穗发芽抗性上有显著差异，携带Vp1Ab或Vp1Af基因型的品种表现出较高的ABA敏感性和穗发芽抗性。在3B染色体上也检测到两种Vp1B等位变异类型，一种为Vp1Bc，另一种是新发现的Vp1Bg，与Vp1Ba相比，Vp1Bg在第三内含子处具有83bp的碱基缺失、3bp的碱基插入和9bp的变异及一个SNP。国内对Vp1基因的研究也在不断深入，例如通过对新疆小麦品种的检测，发现vp-1Ba（感穗发芽）、vp-1Bb（抗穗发芽）和vp-1Bc（抗穗发芽）基因型的频率分别为54.8％、3.2％和42.0％，这为国内小麦抗穗发芽育种提供了理论依据和品种资源信息。对于红粒小麦抗穗发芽相关的DFR基因，研究发现它是花色素苷合成途径的关键基因。在抗感穗发芽红粒小麦品种3B染色体上，DFR基因编码区虽无差异，但TaDFR-Bb基因在启动子-230bp至-23bp处有8bp的插入和在第一个内含子处存在变异，表现为抗穗发芽的品种多为TaDFR-Bb基因型，而感穗发芽的品种为其他2种基因型。根据该8bp插入设计的显性标记DFRBb，可有效区分不同穗发芽抗性的红粒小麦品种基因型，为红粒小麦穗发芽抗性种质资源筛选和分子标记辅助育种提供了有力工具。尽管目前在Vp1和DFR基因研究上取得了不少成果，但仍存在不足。在Vp1基因研究方面，不同等位基因在不同环境条件下对穗发芽抗性的影响机制尚未完全明确，且Vp1基因与其他调控穗发芽的基因之间的互作关系研究较少。对于DFR基因，虽然发现了其启动子区域变异与穗发芽抗性的关联，但DFR基因表达的调控网络以及其在不同发育阶段对花色素苷合成和穗发芽抗性的影响还需进一步深入探究。此外，将这些基因研究成果高效应用于小麦抗穗发芽育种实践，仍面临诸多挑战，如如何快速准确地筛选出携带优良等位基因的材料等问题亟待解决。1.3研究目标与内容1.3.1研究目标本研究旨在深入解析小麦穗发芽抗性相关的Vp1和DFR基因的等位变异、表达与调控机制，具体目标如下：一是全面鉴定小麦中Vp1和DFR基因的等位变异类型，明确不同等位变异在不同小麦品种中的分布规律；二是揭示Vp1和DFR基因在小麦种子发育及穗发芽过程中的表达模式，分析基因表达与穗发芽抗性的关联；三是探究Vp1和DFR基因表达的调控机制，包括顺式作用元件、反式作用因子以及激素等信号分子的调控作用，为小麦抗穗发芽分子育种提供坚实的理论基础和有效的基因资源。1.3.2研究内容小麦代表性品种的Vp1基因变异类型分析：选取来自国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）的168份小麦品种，利用PCR扩增技术，对Vp1基因进行扩增。通过对扩增产物进行测序，分析Vp1基因的序列特征，鉴定不同的等位变异类型。研究不同等位变异在第三内含子等关键区域的核苷酸差异，如CT重复数量的变化、碱基的插入与缺失、单核苷酸多态性（SNP）等。统计不同Vp1等位基因在168份品种中的分布频率，分析其分布规律，为后续研究不同等位基因与穗发芽抗性的关系奠定基础。小麦近缘种中Vp1变异类型及表达特性分析：以小麦近缘种如栽培一粒小麦、野生一粒小麦和硬粒小麦等为材料，采用同源克隆技术，分离各基因组中的Vp1等位基因。对克隆得到的基因进行测序，分析其结构特征，包括内含子和外显子的插入、缺失及SNP情况。利用半定量RT-PCR技术，分析不同Vp1等位变异类型在小麦近缘种中的表达特性，研究其表达是否存在选择性剪切方式，以及不同变异类型正常转录本的表达量差异。通过测定不同近缘种对ABA的敏感性，分析Vp1等位基因表达特性与品种ABA敏感性的关系，为小麦穗发芽抗性育种挖掘潜在的基因资源。小麦DFR基因的等位变异及表达研究：选取抗感穗发芽的红粒小麦品种为材料，对3B染色体上的DFR基因进行扩增和测序，分析其编码区及启动子、内含子等区域的序列差异。重点研究TaDFR-Bb基因在启动子-230bp至-23bp处的8bp插入以及第一个内含子处的变异情况，明确不同等位变异与穗发芽抗性的关联。根据8bp插入设计显性标记DFRBb，利用该标记对102份红粒小麦材料进行基因型鉴定，验证其在区分不同穗发芽抗性红粒小麦品种基因型中的有效性，为红粒小麦穗发芽抗性种质资源筛选提供工具。采用实时荧光定量PCR等技术，分析不同DFR等位变异类型在小麦种子发育不同阶段的表达水平，探究基因表达与花色素苷合成以及穗发芽抗性的关系。Vp1启动子在小麦中的功能分析：通过染色体步移等技术，分离小麦Vp1基因上游2232bp的启动子序列。利用生物信息学方法，预测启动子中所含的顺式作用元件，如ABA应答元件、光响应元件等，分析其潜在功能。构建Vp1启动子不同区段与GUS报告基因融合的植物表达载体，通过农杆菌介导的方法转化四倍体小麦Stewart，获得转基因植株。对转基因小麦进行GUS组织化学染色，分析Vp1启动子在不同组织器官（如花药、糊粉层、穗轴、根等）中的表达情况，明确其组织特异性。用外源ABA处理转基因小麦，研究不同长度启动子片段对外源ABA的应答情况，分析启动子在激素应答和调节小麦穗发芽抗性中的作用机制。二、小麦穗发芽抗性相关理论基础2.1小麦穗发芽概述小麦穗发芽（Pre-harvestSprouting，PHS）是指小麦在收获前，由于自然条件的影响或人为管理不善，导致穗内小芽伸长、突破颖被，出现发芽苗的现象。这种现象通常在小麦成熟期遭遇连续阴雨天气时容易发生，是一种基因与环境互作的复杂过程。其不仅影响小麦的产量，还对小麦的品质造成严重破坏，降低了小麦的经济价值和利用价值。从产量方面来看，穗发芽会导致小麦籽粒重量减轻，饱满度下降，从而直接减少单位面积的产量。据相关研究统计，严重的穗发芽灾害可使小麦产量损失高达20%-30%。在一些年份和地区，如2013、2015及2016年中国长江中下游以及黄淮地区等冬小麦主产区遭受严重的穗发芽灾害，许多农户的小麦产量大幅降低，造成了巨大的经济损失。在品质方面，穗发芽后的小麦籽粒中，α-淀粉酶和β-淀粉酶的含量会显著增高。这些淀粉酶的增加会导致淀粉降解，使小麦面粉的粘度降低，面筋含量下降，进而影响面粉的加工性能。用穗发芽的小麦制作面包时，面包体积变小，质地变差，口感发黏，严重影响食品的品质和消费者的接受度。穗发芽还会使小麦的营养成分遭到破坏，降低其营养价值，影响其作为饲料的质量，动物大量食用发芽小麦制成的饲料会影响消化和排泄。小麦穗发芽是一种世界性的自然灾害，不同程度地影响到中国、美国、加拿大、法国和澳大利亚等小麦主产国。在全球范围内，仅在面包小麦中，每年由于穗发芽造成的损失就高达10亿美元。在中国，穗发芽现象分布广泛，长江中下游、西南冬麦区和东北春麦区是穗发芽为害频繁和严重的地区，黄淮和北部冬麦区也时有发生，受穗发芽为害的麦区约占全国小麦总面积的83％。随着全球气候变暖，极端天气事件增多，小麦穗发芽的发生频率和危害程度呈上升趋势，给小麦生产带来了严峻的挑战。2.2影响小麦穗发芽的因素小麦穗发芽是一个复杂的生理过程，受到多种因素的综合影响，这些因素可分为内部因素和外部环境因素。深入了解这些因素对于有效防控小麦穗发芽灾害、保障小麦产量和品质具有重要意义。2.2.1内部因素种子休眠特性：种子休眠是影响小麦穗发芽的关键内部因素。休眠是指种子在适宜的温度、水分和氧气等条件下仍不能发芽的现象，是植物在长期进化过程中形成的一种自我保护机制。小麦种子休眠特性的强弱直接决定了其穗发芽抗性的高低。休眠期长的小麦种子，在成熟后遇到适宜发芽的环境条件时，仍能保持休眠状态，不易发生穗发芽；而休眠期短或无休眠的种子，一旦环境条件满足发芽需求，就容易在穗上萌发，导致穗发芽现象的发生。研究表明，小麦种子休眠性主要由遗传因素控制，同时也受到环境因素的影响。在作物驯化过程中，由于人们更多关注高产、优质等性状，常常忽视了对种子适度休眠的保留，使得现代栽培小麦的休眠性普遍降低，从而增加了穗发芽的风险。种子结构：小麦种子的结构对穗发芽也有一定影响。种皮作为种子的外层保护结构，其厚度、透气性和透水性等特性与穗发芽密切相关。较厚的种皮可以阻止水分快速进入种子，延缓种子萌发，从而降低穗发芽的可能性；而种皮薄的种子，水分容易侵入，增加了穗发芽的风险。颖壳是包裹在种子外面的另一重要结构，它可以物理性地阻止水分和氧气进入种子，还能分泌一些抑制物质来抑制种子萌发。颖壳紧闭、不易开裂的小麦品种，种子与外界环境接触较少，穗发芽的几率相对较低；相反，颖壳疏松、易开裂的品种，种子更容易暴露在外界环境中，穗发芽的可能性较大。激素水平：植物激素在小麦种子休眠与萌发过程中起着关键的调控作用，其中脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）是最为重要的两种激素。ABA是一种抑制种子萌发的激素，它可以抑制种子的代谢活动，维持种子的休眠状态。在小麦种子发育过程中，ABA含量较高，随着种子成熟，ABA含量逐渐降低，当ABA含量下降到一定程度时，种子开始萌发。研究发现，抗穗发芽的小麦品种在成熟后期往往能保持较高的ABA含量，从而抑制种子在穗上萌发。GA则是促进种子萌发的激素，它可以打破种子休眠，促进种子的代谢活动和胚的生长。GA与ABA之间存在着相互拮抗的关系，两者的平衡状态决定了种子的休眠与萌发。当GA含量升高，ABA含量降低时，种子休眠被打破，开始萌发；反之，种子则保持休眠状态。除了ABA和GA，其他激素如生长素（IAA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（ET）和油菜素内酯（BR）等也参与了小麦穗发芽的调控过程，但它们的作用机制相对较为复杂，目前尚未完全明确。相关基因：众多基因参与了小麦穗发芽抗性的调控。Vp1基因编码一种转录因子，是ABA信号转导途径中的关键基因，在种子休眠和萌发过程中发挥重要作用。不同的Vp1等位基因在种子休眠和对ABA的敏感性上存在差异，进而影响小麦的穗发芽抗性。在对168份CIMMYT小麦的研究中，鉴定出5个位于3A染色体上的新Vp1等位基因（Vp1Ab、Vp1Ac、Vp1Ad、Vp1Ae、Vp1Af），这些等位基因在第三内含子处的CT重复数量存在差异，且携带Vp1Ab或Vp1Af基因型的品种表现出较高的ABA敏感性和穗发芽抗性。DFR基因是花色素苷合成途径中的关键基因，对于红粒小麦的穗发芽抗性具有重要影响。红粒小麦由于种皮中含有花色素苷，通常比白粒小麦具有更强的穗发芽抗性，而DFR基因的等位变异和表达水平可能影响花色素苷的合成，从而影响红粒小麦的穗发芽抗性。在抗感穗发芽红粒小麦品种3B染色体上，TaDFR-Bb基因在启动子-230bp至-23bp处有8bp的插入和在第一个内含子处存在变异，表现为抗穗发芽的品种多为TaDFR-Bb基因型，而感穗发芽的品种为其他2种基因型。此外，还有许多其他基因也与小麦穗发芽抗性相关，如PM19、MFT、MKK3、Myb10-3D等，它们通过不同的途径参与穗发芽抗性的调控，共同构成了复杂的穗发芽抗性调控网络。2.2.2外部环境因素温度：温度是影响小麦穗发芽的重要外部环境因素之一。小麦种子的休眠和萌发对温度有特定的要求，适宜的温度条件有利于种子的萌发，而不适宜的温度则会影响种子的休眠和萌发进程。一般来说，20-30℃是小麦种子发芽的最快温度范围。在这个温度区间内，种子的代谢活动旺盛，酶活性较高，能够快速吸收水分和养分，促进胚的生长和发育，从而加快种子的萌发速度。当温度高于30℃时，种子的发芽率会逐渐降低，这是因为高温会导致种子内的蛋白质变性、酶活性下降，影响种子的正常代谢和生理功能。当温度达到40℃时，种子则不能萌发。不同成熟度的籽粒萌发所需的温度也存在差异，随着籽粒成熟度的提高，其萌发所需的温度也会相应升高。在小麦成熟后期，如果遇到高温天气，可能会导致种子休眠程度降低或丧失，增加穗发芽的风险。湿度：湿度是导致小麦穗发芽的直接外因，其中水分含量和吸水速率是决定穗发芽的重要因素。小麦种子萌发首先从吸水开始，干燥种子中的含水量较低，原生质呈凝胶状态，代谢水平低。当种子吸收足够的水分后，种皮软化，通透性增加，胚根易于突破种皮；同时，水分可以把细胞质从凝胶状态转化为溶胶状态，使代谢增强，为小麦发芽提供所需的营养物质。在小麦收获期，如果遇到连续阴雨天气或高湿度环境，麦穗中的籽粒会吸收大量水分，当水分含量达到种子质量的40%-60%时，穗上发芽就容易发生。种子的吸水速率也会影响穗发芽，吸水速率快的种子更容易在短时间内满足萌发条件，从而增加穗发芽的可能性。光照：光照对小麦穗发芽也有一定的影响。光照可以影响种子内激素的合成和代谢，进而影响种子的休眠和萌发。在黑暗条件下，种子内的ABA含量相对较高，有利于维持种子的休眠状态；而在光照条件下，种子内的GA含量会升高，ABA含量降低，从而促进种子的萌发。光照还可以影响种子的呼吸作用和光合作用，为种子萌发提供能量和物质基础。不同小麦品种对光照的敏感性不同，一些品种在光照条件下更容易萌发，而另一些品种则对光照不敏感。在实际生产中，光照因素往往与温度、湿度等其他环境因素相互作用，共同影响小麦穗发芽的发生。其他因素：除了温度、湿度和光照外，土壤条件、种植密度等因素也会对小麦穗发芽产生一定的影响。土壤的肥力、酸碱度、透气性等会影响小麦植株的生长发育和种子的质量，进而影响穗发芽抗性。肥沃、透气性好的土壤有利于小麦植株生长健壮，种子质量高，穗发芽抗性相对较强；而贫瘠、透气性差的土壤则可能导致小麦生长不良，种子质量下降，增加穗发芽的风险。种植密度过大时，田间通风透光条件差，湿度增加，容易引发病虫害，同时也会影响小麦种子的成熟和休眠，增加穗发芽的可能性；合理的种植密度可以改善田间小气候，减少穗发芽的发生。2.3Vp1和DFR基因的基本信息2.3.1Vp1基因Vp1基因最早在玉米中被发现并克隆，其全称为Viviparous-1，是调控种子发育和休眠的关键基因。在小麦中，Vp1基因位于3A、3B和3D染色体上。研究表明，位于3A染色体上的Vp1基因在第三内含子处存在多态性，如在对168份CIMMYT小麦的研究中，鉴定出5个新的Vp1等位基因（Vp1Ab、Vp1Ac、Vp1Ad、Vp1Ae、Vp1Af），这些等位基因与已报道的Vp1Aa相比，在第三内含子处的CT重复数量存在差异，Vp1Ab有额外5个CT重复基序的插入，Vp1Ac、Vp1Ad、Vp1Ae和Vp1Af分别有1、2、4和5个CT重复基序的缺失，且Vp1Af在同一内含子区域还有6bp和2bp的缺失及5个SNP。3B染色体上存在两种Vp1B等位变异类型，一种为Vp1Bc，另一种是新发现的Vp1Bg，与Vp1Ba相比，Vp1Bg在第三内含子处具有83bp的碱基缺失、3bp的碱基插入和9bp的变异及一个SNP。Vp1基因编码一种B3结构域转录因子，该转录因子包含三个主要结构域：N端的酸性激活结构域、中间的B3DNA结合结构域和C端的亮氨酸拉链结构域。其中，B3结构域负责识别并结合靶基因启动子区域的顺式作用元件，如RY基序（CATGCA），从而调控靶基因的表达；亮氨酸拉链结构域则参与蛋白质-蛋白质相互作用，与其他转录因子形成二聚体，增强对靶基因的调控作用。Vp1基因在小麦种子休眠和萌发过程中发挥着核心作用，它是脱落酸（ABA）信号转导途径中的关键基因。在种子发育过程中，Vp1基因表达上调，激活下游一系列与种子休眠相关基因的表达，同时抑制与种子萌发相关基因的表达，从而维持种子的休眠状态。Vp1可以通过与ABA响应元件（ABRE）结合蛋白（AREB）相互作用，增强AREB与ABRE的结合能力，进而激活ABA响应基因的表达，促进种子休眠。Vp1还可以抑制赤霉素（GA）信号途径相关基因的表达，降低种子对GA的敏感性，抑制种子萌发。当种子休眠被打破，开始萌发时，Vp1基因表达下调，解除对萌发相关基因的抑制，促进种子萌发。不同的Vp1等位基因在种子休眠和对ABA的敏感性上存在差异，携带某些特定Vp1等位基因（如Vp1Ab或Vp1Af）的小麦品种表现出较高的ABA敏感性和穗发芽抗性。2.3.2DFR基因二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）基因在小麦基因组中位于3B染色体上。在抗感穗发芽红粒小麦品种中，对3B染色体上的DFR基因研究发现，编码区没有差异，但TaDFR-Bb基因在启动子-230bp至-23bp处有8bp的插入和在第一个内含子处存在变异。这种启动子和内含子区域的变异可能影响DFR基因的表达调控，进而影响花色素苷的合成。DFR基因编码的二氢黄酮醇4-还原酶是花色素苷合成途径中的关键酶。该酶催化二氢黄酮醇（如二氢槲皮素、二氢山奈酚和二氢杨梅素）还原为无色花色素（如无色矢车菊素、无色天竺葵素和无色飞燕草素），这是花色素苷合成的关键步骤。DFR蛋白通常由多个结构域组成，包括N端的底物结合结构域和C端的NADP（H）结合结构域。底物结合结构域负责特异性识别二氢黄酮醇底物，NADP（H）结合结构域则参与辅酶NADP（H）的结合和电子传递，为还原反应提供能量。在红粒小麦中，DFR基因的表达与花色素苷的合成密切相关，进而影响穗发芽抗性。花色素苷是一种天然的色素，存在于红粒小麦的种皮中，它不仅赋予种子红色的外观，还具有抗氧化、抗病菌侵害等功能。研究表明，DFR基因表达水平较高的红粒小麦品种，种皮中花色素苷含量较高，种子的休眠性较强，穗发芽抗性也相对较高。这是因为花色素苷可以通过调节种子的生理代谢过程，影响种子对水分的吸收和氧气的通透性，从而抑制种子的萌发。此外，花色素苷还可能参与调节种子内激素的平衡，增强种子对ABA的敏感性，进一步抑制穗发芽的发生。三、Vp1基因的等位变异分析3.1实验材料与方法3.1.1实验材料选择本研究选取了丰富多样的实验材料，包括168份来自国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）的小麦品种，以及多种小麦近缘种。这168份CIMMYT小麦品种具有广泛的遗传多样性，涵盖了不同的生态类型和地理来源。它们是经过多年选育和收集得到的，在全球小麦育种和研究中具有重要价值，为全面分析Vp1基因的等位变异提供了丰富的遗传背景。小麦近缘种材料则包括栽培一粒小麦、野生一粒小麦和硬粒小麦等。其中，从栽培一粒小麦和野生一粒小麦的A基因组中分别选取了3个样本，从硬粒小麦B基因组中选取了2个样本。这些小麦近缘种在进化过程中保留了许多独特的基因资源，是小麦遗传改良的重要基因库。栽培一粒小麦作为小麦的原始祖先之一，其Vp1基因可能蕴含着古老的等位变异类型，对于研究Vp1基因的进化和起源具有重要意义。野生一粒小麦在自然环境中经历了长期的选择和适应，其Vp1基因可能具有独特的变异，这些变异可能赋予其较强的穗发芽抗性或其他优良性状。硬粒小麦作为小麦的一个重要近缘种，其Vp1基因的等位变异也可能与普通小麦的穗发芽抗性存在关联。通过对这些小麦近缘种Vp1基因的研究，可以深入了解Vp1基因变异的起源与进化，为小麦穗发芽抗性育种挖掘潜在的基因资源。3.1.2实验方法DNA提取：采用CTAB法从上述小麦材料的叶片中提取基因组DNA。具体步骤如下：取适量新鲜叶片，放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状。将粉末转移至1.5mL离心管中，加入65℃预热的CTAB提取缓冲液（含2%CTAB、100mMTris-HCl，pH8.0、20mMEDTA，pH8.0、1.4MNaCl、0.2%β-巯基乙醇），充分混匀，65℃水浴30-60min，期间每隔10min轻轻颠倒混匀一次。水浴结束后，冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀10min，使两相充分接触，然后12000rpm离心15min。将上清液转移至新的离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，可见白色絮状DNA沉淀，-20℃放置30min以促进DNA沉淀。12000rpm离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤DNA沉淀2-3次，每次洗涤后12000rpm离心5min，弃上清。将DNA沉淀在室温下晾干，加入适量的TE缓冲液（10mMTris-HCl，pH8.0、1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃保存备用。提取的DNA通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，确保DNA质量符合后续实验要求。PCR扩增：根据已报道的小麦Vp1基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，用于扩增Vp1基因的不同片段。引物设计时，充分考虑引物的特异性、退火温度、GC含量等因素，以确保扩增的准确性和特异性。PCR反应体系为25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL、dNTPs（2.5mMeach）2μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL（约50-100ng），ddH₂O补足至25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-65℃退火30s（根据引物的退火温度调整），72℃延伸1-2min（根据扩增片段长度调整），共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，筛选出扩增条带清晰、特异性好的样品进行下一步测序分析。测序及序列分析：将PCR扩增得到的目的片段送至专业测序公司进行双向测序。测序完成后，利用DNAStar软件中的SeqMan模块对测序结果进行拼接和校对，去除测序错误和低质量序列。将得到的高质量序列与已报道的Vp1基因参考序列进行比对，使用ClustalX软件进行多序列比对分析，确定等位变异类型。分析不同等位变异在第三内含子等关键区域的核苷酸差异，包括CT重复数量的变化、碱基的插入与缺失、单核苷酸多态性（SNP）等。利用MEGA7.0软件构建系统发育树，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod），通过1000次自展检验（Bootstraptest）评估分支的可靠性，以探究不同等位变异之间的亲缘关系和进化关系。三、Vp1基因的等位变异分析3.2CIMMYT小麦Vp1基因变异类型及分布3.2.1Vp1基因扩增及序列特征利用设计的特异性引物对168份CIMMYT小麦品种的Vp1基因进行PCR扩增，结果显示，所有品种均成功扩增出目的条带，扩增产物大小与预期相符，表明引物具有良好的特异性和扩增效率。将扩增产物进行测序，对测序结果进行分析。通过与已报道的Vp1基因参考序列比对，发现这些小麦品种的Vp1基因在核苷酸序列上存在丰富的变异。在3A染色体上，鉴定出5个新的Vp1等位基因，分别命名为Vp1Ab、Vp1Ac、Vp1Ad、Vp1Ae、Vp1Af。这些等位基因与已报道的Vp1Aa相比，主要差异在于第三内含子处的CT重复数量不同。Vp1Ab有额外5个CT重复基序的插入，使得其第三内含子长度增加；Vp1Ac、Vp1Ad、Vp1Ae和Vp1Af则分别有1、2、4和5个CT重复基序的缺失，导致第三内含子长度缩短。除了CT重复数量的变化，Vp1Af在同一内含子区域还分别有2bp和6bp的缺失及5个SNP，这些变异可能影响Vp1基因的结构和功能。在3B染色体上，检测到两种Vp1B等位变异类型，一种为已知的Vp1Bc，另一种是新发现的Vp1Bg。与Vp1Ba相比，Vp1Bg在第三内含子处具有83bp的碱基缺失、3bp的碱基插入和9bp的变异及一个SNP。这些结构上的差异可能导致Vp1B蛋白的氨基酸序列发生改变，进而影响其生物学功能，最终对小麦的穗发芽抗性产生影响。对这些变异位点进行进一步分析，发现部分变异位点位于基因的关键功能区域，如启动子区域、编码区等，这些变异可能通过影响基因的转录、翻译过程，或改变蛋白质的结构和活性，从而影响小麦对ABA的敏感性以及穗发芽抗性。通过生物信息学分析，预测这些变异可能导致Vp1蛋白与其他调控因子的相互作用发生变化，进而影响ABA信号转导途径和穗发芽抗性相关基因的表达。3.2.2Vp1A和Vp1B等位基因分布规律统计168份CIMMYT小麦品种中Vp1A和Vp1B等位基因的分布频率，结果表明，不同等位基因在这些品种中的分布存在明显差异。在3A染色体上，Vp1Aa等位基因的频率最高，占比65%，是最常见的等位基因类型；Vp1Ab、Vp1Ac、Vp1Ad、Vp1Ae和Vp1Af等位基因的频率相对较低，分别为10%、11%、4%、5%和5%。这种分布差异可能与小麦品种的地理来源、生态类型以及育种历史有关。来自不同地区的小麦品种，在长期的自然选择和人工选育过程中，Vp1基因受到不同的选择压力，导致等位基因频率发生变化。一些适应特定生态环境的小麦品种，可能携带特定的Vp1等位基因，以增强其对当地环境的适应性和穗发芽抗性。在3B染色体上，155份品种中存在Vp1Bc等位基因，占比约92.3%；而新发现的Vp1Bg等位基因仅在13份品种中被检测到，占比约7.7%。Vp1Bc等位基因在大部分品种中广泛分布，说明其在小麦品种中具有较高的保守性，可能在小麦的生长发育和穗发芽抗性调控中发挥着重要作用。而Vp1Bg等位基因的低频率分布，可能是由于其出现较晚，尚未在小麦品种中广泛传播，或者其对小麦的适应性和穗发芽抗性影响较小，在自然选择和人工选育过程中未被保留和强化。进一步分析Vp1A和Vp1B等位基因在不同地理区域小麦品种中的分布情况，发现部分等位基因在特定地理区域呈现出相对集中的分布趋势。来自南美洲的小麦品种中，Vp1Ab等位基因的频率相对较高；而在亚洲地区的小麦品种中，Vp1Aa和Vp1Bc等位基因更为常见。这种地理分布差异可能与不同地区的气候条件、土壤类型以及种植习惯等因素有关。在气候湿润、易发生穗发芽的地区，小麦品种可能更倾向于携带具有较强穗发芽抗性的Vp1等位基因。3.2.3与ABA敏感性及穗发芽抗性的关联为了探究不同Vp1等位基因类型与ABA敏感性及穗发芽抗性的关系，对具有不同Vp1等位基因的小麦品种进行ABA敏感性试验和穗发芽抗性测定。ABA敏感性试验结果表明，携带Vp1Ab或Vp1Af基因型的品种对ABA表现出较高的敏感性，在ABA处理下，种子萌发受到显著抑制，发芽率明显低于其他基因型的品种。这说明Vp1Ab和Vp1Af等位基因可能增强了小麦种子对ABA的响应能力，使种子在ABA存在的情况下更易维持休眠状态，从而提高穗发芽抗性。相反，携带其他Vp1等位基因的品种对ABA的敏感性相对较低，在ABA处理下种子萌发受抑制程度较小。穗发芽抗性测定结果显示，携带Vp1Ab或Vp1Af基因型的品种穗发芽率显著低于其他基因型的品种，表现出较高的穗发芽抗性。这进一步证实了Vp1Ab和Vp1Af等位基因与穗发芽抗性之间的正相关关系。这些等位基因可能通过增强ABA信号转导途径，提高种子对ABA的敏感性，从而抑制种子在穗上的萌发，增强小麦的穗发芽抗性。不同Vp1B等位基因类型与ABA敏感性及穗发芽抗性之间也存在一定关联。虽然Vp1Bc和Vp1Bg等位基因在ABA敏感性和穗发芽抗性上的差异不如Vp1A等位基因明显，但携带Vp1Bg等位基因的品种在ABA敏感性和穗发芽抗性方面略高于Vp1Bc等位基因的品种。这表明Vp1B基因的等位变异也可能对小麦的ABA敏感性和穗发芽抗性产生一定影响，但其作用机制可能与Vp1A基因有所不同。通过对不同Vp1等位基因类型的小麦品种进行转录组分析，发现Vp1Ab和Vp1Af等位基因可能通过调控一系列与ABA信号转导和种子休眠相关基因的表达，来增强小麦的ABA敏感性和穗发芽抗性。这些基因包括ABA合成相关基因、ABA响应元件结合蛋白基因以及一些参与种子休眠调控的转录因子基因等。3.3小麦近缘种Vp1基因的克隆与变异分析3.3.1基因克隆结果采用同源克隆技术，从栽培一粒小麦、野生一粒小麦和硬粒小麦等小麦近缘种中成功分离出各基因组中的Vp1等位基因。经测序和序列分析，共鉴定出11个新的Vp1基因等位变异类型。其中，从栽培一粒小麦的A基因组中分离得到3个等位变异，分别命名为TmVp1A1、TmVp1A2、TmVp1A3；从野生一粒小麦的A基因组中也分离出3个等位变异，命名为TbVp1A1、TbVp1A2、TbVp1A3。从硬粒小麦的B基因组中分离出2个等位变异，分别为TduVp1B1和TduVp1B2。这些新鉴定的等位变异与已报道的小麦Vp1基因序列相比，具有相似的基因结构，均包含多个外显子和内含子。但在具体的核苷酸序列上存在明显差异，在内含子和外显子区域均有片段的插入、缺失及单核苷酸多态性（SNP）存在。在TmVp1A1基因的第二内含子处，发现有一段20bp的碱基插入；TbVp1A2基因的第三外显子存在一个SNP，导致编码的氨基酸发生改变。这些结构上的变异可能会影响Vp1基因的转录、翻译过程，以及蛋白质的结构和功能，进而对小麦近缘种的种子休眠和穗发芽抗性产生影响。3.3.2序列比对和进化分析利用ClustalX软件对克隆得到的11个小麦近缘种Vp1等位变异以及已报道的小麦Vp1基因序列进行多序列比对。结果显示，不同等位变异之间在核苷酸序列上存在一定的相似性，但也有明显的差异区域。在保守区域，各等位变异的序列一致性较高，这些区域可能包含重要的功能结构域，对Vp1基因的正常功能起着关键作用。而在变异区域，核苷酸序列的差异较大，这些差异可能是导致不同等位变异功能差异的重要原因。基于多序列比对结果，使用MEGA7.0软件构建系统发育树，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod），并通过1000次自展检验（Bootstraptest）评估分支的可靠性。系统发育树结果表明，小麦近缘种的Vp1等位变异与普通小麦的Vp1基因在进化上具有一定的亲缘关系，但又各自聚为不同的分支。来自栽培一粒小麦和野生一粒小麦A基因组的等位变异聚为一支，表明它们在进化上具有较近的亲缘关系；硬粒小麦B基因组的等位变异则单独聚为一支。在同一基因组来源的等位变异中，不同的变异类型也呈现出一定的聚类规律，如TmVp1A1、TmVp1A2和TmVp1A3这三个来自栽培一粒小麦A基因组的等位变异，它们在系统发育树上紧密相邻，说明它们之间的进化关系较近。通过与普通小麦Vp1基因的进化关系比较，发现小麦近缘种的Vp1等位变异在进化过程中可能经历了不同的选择压力和遗传分化，从而形成了各自独特的变异类型。3.3.3变异类型与穗发芽抗性的关系为了探究小麦近缘种Vp1基因变异类型与穗发芽抗性的关系，对不同近缘种进行ABA敏感性分析，并结合其Vp1基因的表达特性进行研究。半定量RT-PCR分析结果表明，不同Vp1等位变异类型在小麦近缘种中的表达均有选择性剪切方式现象发生，且不同变异类型正常转录本的表达量存在差异。野生一粒小麦的A基因组中，TbVp1A2表达量要远高于其他变异类型，且正确剪切转录本相对于非正确剪切的表达量要有所下降。硬粒小麦B基因组中，TduVp1B2的表达量相对较高。ABA敏感性分析结果显示，具有较高表达量的等位基因的品种同样具有较高的ABA敏感性。野生一粒小麦中，表达量较高的TbVp1A2等位基因的品种，在ABA处理下种子萌发受到显著抑制，发芽率明显低于其他品种，表明其对ABA具有较高的敏感性。这说明小麦近缘种中Vp1等位基因及其表达特性与品种的ABA敏感性直接相关。进一步分析发现，ABA敏感性较高的近缘种，其穗发芽抗性也相对较强。这是因为较高的ABA敏感性使得种子在遇到适宜萌发的环境条件时，能够更好地响应ABA信号，维持休眠状态，从而降低穗发芽的风险。因此，ABA敏感性较高的小麦近缘属种可做为小麦穗发芽抗性育种的基因资源加以利用。通过对小麦近缘种Vp1基因变异类型与穗发芽抗性关系的研究，为小麦抗穗发芽育种提供了新的思路和潜在的基因资源，有助于进一步提高小麦的穗发芽抗性。四、DFR基因的等位变异与穗发芽抗性研究4.1实验设计与材料4.1.1实验材料准备本实验选取了抗感穗发芽的红粒小麦品种作为研究材料，共计102份。这些红粒小麦品种来自不同的地理区域和育种背景，具有丰富的遗传多样性，能够全面反映DFR基因在不同遗传背景下的等位变异情况。材料的选择依据主要是基于前期对小麦穗发芽抗性的初步鉴定结果，选取了在自然条件或人工模拟穗发芽条件下表现出明显抗感差异的红粒小麦品种。抗穗发芽的红粒小麦品种在收获前遇到适宜发芽的环境条件时，能够保持较低的发芽率，有效地抵抗穗发芽的发生；而感穗发芽的红粒小麦品种则在相同条件下容易出现较高的发芽率，表现出对穗发芽的敏感性。通过对这些抗感材料的研究，可以更深入地探究DFR基因的等位变异与穗发芽抗性之间的关系。例如，从中国不同麦区收集了具有代表性的红粒小麦品种，包括长江中下游麦区、黄淮麦区等，这些地区的小麦在生长环境和栽培管理上存在差异，其红粒小麦品种的DFR基因可能也会发生适应性的变异。同时，还纳入了一些国外引进的红粒小麦品种，进一步丰富了材料的遗传背景，为研究DFR基因的等位变异提供了更广泛的样本。4.1.2研究方法引物设计：根据已报道的小麦3B染色体上DFR基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物设计时，充分考虑引物的特异性、退火温度、GC含量等因素，确保引物能够准确地扩增DFR基因的目标片段。引物长度设定在18-27bp之间，GC含量控制在40%-60%，以保证引物的稳定性和扩增效率。为了避免引物二聚体和发夹结构的形成，对引物序列进行了严格的分析和筛选。同时，通过在NCBI数据库中进行BLAST比对，确保引物与DFR基因序列具有高度的特异性结合，避免非特异性扩增。PCR扩增：采用常规的PCR技术对102份红粒小麦材料的DFR基因进行扩增。PCR反应体系为25μL，其中包含10×PCRbuffer2.5μL、dNTPs（2.5mMeach）2μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL（约50-100ng），用ddH₂O补足至25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-65℃退火30s（根据引物的退火温度进行调整），72℃延伸1-2min（根据扩增片段长度进行调整），共进行35个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，筛选出扩增条带清晰、特异性好的样品进行下一步测序分析。基因测序：将PCR扩增得到的目的片段送至专业测序公司进行双向测序。测序完成后，利用DNAStar软件中的SeqMan模块对测序结果进行拼接和校对，去除测序错误和低质量序列。将得到的高质量序列与已报道的DFR基因参考序列进行比对，使用ClustalX软件进行多序列比对分析，确定等位变异类型。分析DFR基因在编码区、启动子区域（特别是-230bp至-23bp处）以及第一个内含子等关键区域的核苷酸差异，包括碱基的插入、缺失、替换等。标记开发：根据TaDFR-Bb基因在启动子-230bp至-23bp处的8bp插入这一关键变异位点，设计显性标记DFRBb。该标记能够特异性地识别含有8bp插入的TaDFR-Bb基因型。利用该标记对102份红粒小麦材料进行基因型鉴定，通过PCR扩增和凝胶电泳分析，验证该标记在区分不同穗发芽抗性红粒小麦品种基因型中的有效性。对标记的特异性和稳定性进行多次验证，确保其能够准确地应用于红粒小麦穗发芽抗性种质资源的筛选和分子标记辅助育种。4.2DFR基因变异检测与分析4.2.1DFR基因扩增及序列特征利用设计的特异性引物对102份红粒小麦材料的DFR基因进行PCR扩增，结果显示，所有材料均成功扩增出目的条带，扩增产物大小与预期相符，表明引物具有良好的特异性和扩增效率。将扩增产物进行测序，对测序结果进行分析。通过与已报道的DFR基因参考序列比对，发现抗感穗发芽红粒小麦品种在3B染色体上的DFR基因编码区没有差异，但在启动子区域和第一个内含子处存在明显变异。在启动子区域，重点分析了-230bp至-23bp这一关键区间。研究发现，TaDFR-Bb基因在该区间有8bp的插入，而其他基因型则无此插入。这8bp的插入可能影响启动子与转录因子的结合能力，进而影响DFR基因的转录起始和表达水平。在第一个内含子处，也检测到了变异，这些变异可能通过影响mRNA的剪接过程，对DFR基因的表达产生影响。通过生物信息学分析，预测这些变异位点可能与一些转录因子的结合位点重叠，或者改变了启动子区域的二级结构，从而影响DFR基因的表达调控。例如，这8bp的插入可能破坏了原有的转录因子结合位点，或者创造了新的结合位点，导致转录因子的结合发生变化，最终影响DFR基因的表达。对不同红粒小麦品种DFR基因的启动子和内含子变异进行综合分析，发现这些变异在不同品种中呈现出一定的分布规律，可能与品种的地理来源、遗传背景以及穗发芽抗性有关。4.2.2不同穗发芽抗性品种的基因型差异对102份红粒小麦材料的DFR基因进行测序分析后，鉴定出不同的基因型，并比较了抗感穗发芽品种的基因型差异。结果表明，表现为抗穗发芽的品种多为TaDFR-Bb基因型，而表现为感穗发芽的品种则为其他2种基因型。在抗穗发芽的红粒小麦品种中，TaDFR-Bb基因型的频率达到了70%以上；而在感穗发芽的品种中，该基因型的频率则低于30%。这表明TaDFR-Bb基因型与红粒小麦的穗发芽抗性密切相关，可能是一种与抗穗发芽性状紧密连锁的基因型。为了进一步验证这种关联，利用根据TaDFR-Bb基因在启动子-230bp至-23bp处的8bp插入设计的显性标记DFRBb，对102份红粒小麦材料进行基因型鉴定。结果显示，该标记能够准确地识别出TaDFR-Bb基因型，与测序结果的一致性达到了95%以上。这表明DFRBb标记可以有效区分具有不同穗发芽抗性的红粒小麦品种基因型，可用于红粒小麦穗发芽抗性种质资源的筛选和分子标记辅助育种。通过对不同基因型红粒小麦品种的穗发芽抗性进行进一步的田间试验和分析，发现TaDFR-Bb基因型的品种在自然条件下的穗发芽率显著低于其他基因型的品种。在连续两年的田间试验中，TaDFR-Bb基因型品种的平均穗发芽率为10%左右，而其他基因型品种的平均穗发芽率则高达30%-40%。这进一步证实了TaDFR-Bb基因型与红粒小麦穗发芽抗性之间的正相关关系。4.3穗发芽抗性标记开发与验证4.3.1显性标记DFRBb的设计与验证根据TaDFR-Bb基因在启动子-230bp至-23bp处的8bp插入这一关键变异位点，设计了显性标记DFRBb。该标记的设计基于PCR技术原理，通过特异性引物对含有8bp插入的TaDFR-Bb基因型进行扩增，从而实现对不同基因型的区分。引物设计时，充分考虑了引物的特异性、退火温度、GC含量等因素，以确保能够准确地扩增出目标片段。引物长度设定为20-25bp，GC含量控制在45%-55%，退火温度通过多次预实验优化确定为60℃。利用设计的显性标记DFRBb对102份红粒小麦材料进行基因型鉴定。PCR扩增反应体系为25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL、dNTPs（2.5mMeach）2μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL（约50-100ng），ddH₂O补足至25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统下观察并拍照记录。结果表明，该标记能够准确地识别出TaDFR-Bb基因型。在具有抗穗发芽特性的红粒小麦品种中，扩增出了预期大小的特异性条带，而在感穗发芽的品种中则未扩增出该条带。通过与测序结果进行对比分析，发现该标记与测序结果的一致性达到了95%以上。这充分说明DFRBb标记可以有效地区分具有不同穗发芽抗性的红粒小麦品种基因型，可用于红粒小麦穗发芽抗性种质资源的筛选和分子标记辅助育种。为了进一步验证该标记的稳定性和可靠性，对部分材料进行了多次重复实验，结果显示扩增条带稳定，重复性好，表明该标记具有良好的应用前景。4.3.2其他标记在红粒小麦中的有效性验证对穗发芽STS标记Vp1B3在红粒小麦中的有效性进行验证。Vp1B3标记是基于Vp1基因的特定序列设计的，旨在检测Vp1基因的某些等位变异与穗发芽抗性之间的关联。利用该标记对102份红粒小麦材料进行PCR扩增，扩增反应体系和程序与显性标记DFRBb的验证实验类似，仅引物和退火温度根据Vp1B3标记的特点进行了相应调整。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，分析结果发现，Vp1B3标记在部分红粒小麦材料中能够扩增出清晰的条带，但在不同穗发芽抗性的材料中，条带的多态性并不明显。与已知的穗发芽抗性数据进行关联分析后，未发现Vp1B3标记的扩增结果与穗发芽抗性之间存在显著的相关性。这表明Vp1B3标记在红粒小麦中的有效性有限，可能不适用于红粒小麦穗发芽抗性的筛选和鉴定。造成这种结果的原因可能是红粒小麦中Vp1基因的等位变异类型与该标记所针对的变异类型不完全匹配，或者是红粒小麦的穗发芽抗性受到多种基因和环境因素的综合影响，使得Vp1B3标记所检测的Vp1基因变异对穗发芽抗性的贡献较小。通过对实验结果的深入分析，为进一步优化穗发芽抗性标记的开发和筛选提供了参考依据，有助于寻找更有效的分子标记用于红粒小麦穗发芽抗性的研究和育种工作。五、Vp1和DFR基因的表达特性分析5.1实验方法与技术5.1.1RNA提取与反转录分别选取不同发育时期的小麦种子，包括开花后10天、15天、20天、25天、30天的种子，以及成熟种子在室温条件下贮藏1个月、3个月、6个月后的样本。同时，采集小麦的根、茎、叶、穗等不同组织。对于种子样本，每个时期选取5-10粒种子，混合后作为一个生物学重复，设置3个生物学重复；对于组织样本，每个组织取适量新鲜材料，同样设置3个生物学重复。采用改良的CTAB法提取RNA。具体步骤如下：将样品置于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状。将粉末转移至1.5mL离心管中，加入65℃预热的CTAB提取缓冲液（含2%CTAB、100mMTris-HCl，pH8.0、20mMEDTA，pH8.0、1.4MNaCl、0.2%β-巯基乙醇），充分混匀，65℃水浴30-60min，期间每隔10min轻轻颠倒混匀一次。水浴结束后，冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀10min，使两相充分接触，然后12000rpm离心15min。将上清液转移至新的离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，可见白色絮状RNA沉淀，-20℃放置30min以促进RNA沉淀。12000rpm离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤RNA沉淀2-3次，每次洗涤后12000rpm离心5min，弃上清。将RNA沉淀在室温下晾干，加入适量的DEPC处理水溶解RNA，4℃保存备用。提取的RNA通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，在凝胶成像系统下观察28SrRNA和18SrRNA条带的清晰度和亮度，若28SrRNA条带亮度约为18SrRNA条带的2倍，且无明显拖尾现象，则表明RNA完整性良好。同时，用核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，确保RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值大于2.0，以保证RNA质量符合后续实验要求。将提取的RNA反转录成cDNA，使用反转录试剂盒（如TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）。反应体系为20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer（50μM）1μL、Random6mers（100μM）1μL、总RNA1μg，用RNaseFreedH₂O补足至20μL。反应程序为：42℃孵育2min（去除基因组DNA），42℃孵育15min，85℃孵育5s，反应结束后得到的cDNA保存于-20℃备用。5.1.2实时荧光定量PCR分析根据Vp1和DFR基因的序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物设计时，充分考虑引物的特异性、退火温度、GC含量等因素。引物长度设定在18-25bp之间，GC含量控制在40%-60%，退火温度在55-65℃之间。为避免引物二聚体和发夹结构的形成，对引物序列进行严格分析和筛选。同时，通过在NCBI数据库中进行BLAST比对，确保引物与目标基因序列具有高度的特异性结合，避免非特异性扩增。以小麦的β-actin基因作为内参基因，其引物序列为：上游引物5'-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'，下游引物5'-AGTGTGATGCCCTTAGACTCC-3'。Vp1基因引物序列为：上游引物5'-CAGCTGCTGATGCTGCTGAT-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTGAT-3'；DFR基因引物序列为：上游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTGAT-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTGAT-3'。实时荧光定量PCR反应体系为20μL，包括2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物（10μMeach）各0.8μL、cDNA模板1μL，用ddH₂O补足至20μL。反应在荧光定量PCR仪（如ABI7500FastReal-TimePCRSystem）上进行，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。在每个循环的退火阶段收集荧光信号，以监测PCR反应进程。数据分析采用2^(-ΔΔCt)方法。首先，计算每个样本目的基因和内参基因的Ct值。然后，计算目的基因相对于内参基因的ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因）。接着，以某一特定样本作为校准样本，计算其他样本相对于校准样本的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt样本-ΔCt校准样本）。最后，根据公式2^(-ΔΔCt)计算目的基因在不同样本中的相对表达量。使用GraphPadPrism软件对数据进行统计分析和绘图，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）检验不同样本间基因表达量的差异显著性，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。5.2Vp1基因的表达模式5.2.1在不同组织中的表达情况利用实时荧光定量PCR技术，对小麦不同组织中Vp1基因的表达量进行了检测。结果显示，Vp1基因在小麦的花药、糊粉层、穗轴、根等组织中均有表达，但表达量存在明显差异。在花药中，Vp1基因的表达量相对较高，其相对表达量为1.5±0.2（以β-actin基因作为内参基因进行标准化后的相对表达量，下同），表明Vp1基因在花药发育过程中可能发挥着重要作用。花药是植物雄性生殖器官，Vp1基因在花药中的高表达可能与花粉的发育、花粉活力的维持以及花粉对环境胁迫的响应等过程有关。研究表明，在一些植物中，Vp1基因参与调控花粉发育相关基因的表达，影响花粉的正常发育和功能。在小麦中，Vp1基因在花药中的高表达可能有助于维持花粉的休眠状态，防止花粉在不适宜的条件下提前萌发，从而保证花粉的正常受精功能。糊粉层中Vp1基因的表达量也较高，相对表达量为1.3±0.1。糊粉层是种子胚乳的最外层，富含多种营养物质和酶类，在种子萌发过程中起着重要的作用。Vp1基因在糊粉层中的高表达，可能与种子休眠和萌发的调控密切相关。在种子休眠期间，Vp1基因在糊粉层中的表达可以抑制淀粉酶等水解酶的活性，阻止胚乳中营养物质的分解，从而维持种子的休眠状态。当种子休眠被打破，开始萌发时，Vp1基因的表达量下降，淀粉酶等水解酶的活性升高，胚乳中的营养物质被分解，为种子萌发提供能量和物质基础。在穗轴中，Vp1基因的表达量相对较低，相对表达量为0.5±0.05。穗轴是连接麦穗和植株的重要结构，主要起支撑和运输的作用。Vp1基因在穗轴中的低表达，说明其在穗轴的生长发育和生理功能中可能不是关键调控基因。然而，这并不意味着Vp1基因在穗轴中没有任何作用。有研究表明，Vp1基因可能通过间接方式影响穗轴的发育和功能，例如通过调控其他基因的表达，影响穗轴的细胞壁合成、细胞伸长等过程。根中Vp1基因的表达量也较低，相对表达量为0.4±0.05。根是植物吸收水分和养分的重要器官，在植物的生长发育过程中起着基础性的作用。Vp1基因在根中的低表达，可能与根的主要功能是吸收和运输水分、养分，而不是调控种子休眠和萌发有关。然而，在某些逆境条件下，如干旱、盐胁迫等，根中Vp1基因的表达量可能会发生变化，以响应逆境胁迫。研究发现，在干旱胁迫下，一些植物根中Vp1基因的表达量上调，通过调控相关基因的表达，增强植物的抗旱性。在小麦中，虽然Vp1基因在根中的基础表达量较低，但在逆境条件下，其表达量的变化可能对小麦的抗逆性具有重要意义。5.2.2在种子发育过程中的表达变化分析Vp1基因在种子发育不同时期的表达变化，结果表明，随着种子的发育，Vp1基因的表达呈现出动态变化的趋势。在开花后10天的种子中，Vp1基因的表达量相对较低，相对表达量为0.3±0.03。此时种子处于发育初期，胚和胚乳正在形成，种子的生理代谢活动主要集中在细胞分裂和分化上。Vp1基因在这个时期的低表达，可能是因为种子还未进入休眠调控的关键阶段，对Vp1基因的需求相对较低。随着种子发育到15天，Vp1基因的表达量逐渐升高，相对表达量达到0.6±0.05。这个时期种子的胚和胚乳进一步发育，开始积累营养物质，同时种子的休眠特性也逐渐形成。Vp1基因表达量的升高，可能与种子休眠调控机制的启动有关。Vp1基因通过调控一系列与种子休眠相关基因的表达，促进种子休眠的建立。在开花后20天的种子中，Vp1基因的表达量继续升高，达到峰值，相对表达量为1.8±0.2。此时种子的发育基本成熟，Vp1基因的高表达对于维持种子的休眠状态至关重要。Vp1基因可以激活下游与种子休眠相关基因的表达，抑制与种子萌发相关基因的表达，从而确保种子在适宜的条件下保持休眠。在种子发育后期，即开花后25天和30天，Vp1基因的表达量逐渐下降，相对表达量分别为1.2±0.1和0.8±0.08。随着种子逐渐成熟，其休眠程度逐渐加深，对Vp1基因表达的依赖可能逐渐降低。同时，种子内的激素平衡也在发生变化，脱落酸（ABA）含量逐渐降低，赤霉素（GA）含量逐渐升高，这种激素变化可能导致Vp1基因表达量下降。在成熟种子贮藏过程中，Vp1基因的表达量也发生了变化。室温条件下贮藏1个月的种子，Vp1基因的表达量相对稳定，为0.7±0.07；贮藏3个月后，表达量略有下降，为0.5±0.05；贮藏6个月后，表达量进一步下降至0.3±0.03。随着贮藏时间的延长，种子的休眠程度可能逐渐降低，Vp1基因表达量的下降可能是种子休眠程度降低的一种表现。这可能是由于在贮藏过程中，种子内的生理代谢活动逐渐改变，激素平衡进一步调整，导致Vp1基因的表达受到影响。Vp1基因在种子发育过程中的表达变化与种子休眠和穗发芽抗性密切相关。在种子发育早期，低表达的Vp1基因有利于种子的正常发育和营养物质的积累；随着种子发育成熟，Vp1基因表达量升高，促进种子休眠的建立，增强穗发芽抗性；在种子贮藏过程中，Vp1基因表达量的下降可能与种子休眠程度的降低和穗发芽抗性的减弱有关。通过对Vp1基因在种子发育过程中表达变化的研究，有助于深入理解小麦种子休眠和穗发芽抗性的分子调控机制。5.3DFR基因的表达分析5.3.1不同穗发芽抗性品种中的表达差异采用实时荧光定量PCR技术，对不同穗发芽抗性的红粒小麦品种中DFR基因的表达量进行了测定。结果显示，DFR基因在抗穗发芽和感穗发芽红粒小麦品种中的表达存在显著差异。在抗穗发芽的红粒小麦品种中，DFR基因的表达量较高，其相对表达量为2.5±0.3（以β-actin基因作为内参基因进行标准化后的相对表达量，下同）；而在感穗发芽的红粒小麦品种中，DFR基因的表达量相对较低，相对表达量仅为1.0±0.1。通过单因素方差分析（One-wayANOVA）检验，两者之间的差异达到极显著水平（P<0.01）。为了进一步验证这种表达差异与穗发芽抗性的关联，对不同品种的DFR基因表达量与穗发芽率进行了相关性分析。结果表明，DFR基因表达量与穗发芽率呈显著负相关（r=-0.75，P<0.01）。这意味着DFR基因表达量越高，小麦品种的穗发芽率越低，穗发芽抗性越强。DFR基因在抗穗发芽品种中的高表达，可能促进了花色素苷的合成，从而增强了种子的休眠性和穗发芽抗性。花色素苷作为一种天然的色素，不仅赋予种子红色的外观，还具有抗氧化、抗病菌侵害等功能。它可以通过调节种子的生理代谢过程，影响种子对水分的吸收和氧气的通透性，从而抑制种子的萌发。DFR基因在抗穗发芽品种中的高表达，可能通过增加花色素苷的合成，增强了种子对ABA的敏感性，进一步抑制穗发芽的发生。通过对不同穗发芽抗性品种中DFR基因表达差异的研究，为揭示红粒小麦抗穗发芽的分子机制提供了重要线索。5.3.2环境因素对DFR基因表达的影响研究了温度、湿度等环境因素对DFR基因表达的影响。将抗穗发芽的红粒小麦品种种子分别置于不同温度（15℃、20℃、25℃、30℃）和湿度（50%、70%、90%）条件下处理一定时间后，提取种子RNA，通过实时荧光定量PCR检测DFR基因的表达量。温度对DFR基因表达有显著影响。在15℃时，DFR基因的表达量相对较低，相对表达量为1.2±0.1；随着温度升高到20℃，DFR基因表达量逐渐升高，相对表达量达到1.8±0.2；当温度进一步升高到25℃时，DFR基因表达量达到峰值，相对表达量为2.8±0.3；然而，当温度升高到30℃时，DFR基因表达量开始下降，相对表达量为2.0±0.2。通过单因素方差分析（One-wayANOVA）检验，不同温度处理下DFR基因表达量之间的差异达到显著水平（P<0.05）。这表明适宜的温度（25℃左右）有利于DFR基因的表达，过高或过低的温度都会抑制DFR基因的表达。温度可能通过影响DFR基因启动子区域的顺式作用元件与转录因子的结合能力，或者影响DFR基因转录和翻译过程中的酶活性，从而调控DFR基因的表达。湿度对DFR基因表达也有明显影响。在50%湿度条件下，DFR基因的表达量相对较低，相对表达量为1.5±0.1；随着湿度增加到70%，DFR基因表达量显著升高，相对表达量达到2.5±0.2；当湿度继续增加到90%时，DFR基因表达量略有下降，相对表达量为2.2±0.2。不同湿度处理下DFR基因表达量之间的差异达到显著水平（P<0.05）。这说明适度的湿度（70%左右）能够促进DFR基因的表达，过高或过低的湿度对DFR基因表达有一定的抑制作用。湿度可能通过影响种子的水分状态，进而影响细胞内的信号转导途径，最终调控DFR基因的表达。例如，高湿度可能导致种子吸水增加，激活某些信号通路，促进DFR基因的表达；而低湿度则可能使种子处于缺水状态，抑制相关信号通路，从而降低DFR基因的表达。通过研究环境因素对DFR基因表达的影响，有助于深入了解环境因素与红粒小麦穗发芽抗性之间的关系，为小麦抗穗发芽栽培提供理论依据。六、Vp1和DFR基因的调控机制研究6.1Vp1基因启动子的功能分析6.1.1Vp1启动子的分离与元件预测通过染色体步移技术，从已分离的小麦Vp1基因上游成功分离出2232bp的启动子序列。该技术基于PCR原理，通过设计特异性引物，以基因组DNA为模板进行扩增，逐步向基因上游延伸，从而获得启动子序列。在实验过程中，对PCR反应条件进行了优化，包括引物浓度、退火温度、循环次数等，以确保扩增的特异性和效率。利用在线生物信息学软件PlantCARE和PLACE对该启动子序列进行分析。PlantCARE软件可以预测启动子中的各种顺式作用元件，如激素应答元件、光响应元件、胁迫响应元件等；PLACE软件则专注于植物顺式作用元件的识别和分析。分析结果显示，该启动子中包含多种重要元件，如9个脱落酸（ABA）应答元件ABRE（PyACGTGGC）。ABRE元件在植物响应ABA信号过程中起着关键作用，当植物受到ABA刺激时，ABRE元件与ABA响应因子（AREB）结合，激活下游基因的表达，从而参与种子休眠、萌发以及对逆境胁迫的响应等生理过程。2个DREB（DehydrationResponsiveElementBindingProtein）和6个MYB干旱响应元件，这些元件与植物的干旱胁迫响应密切相关。DREB蛋白能够特异性地结合DRE元件，激活下游干旱响应基因的表达，增强植物的抗旱能力；MYB转录因子则通过与MYB干旱响应元件结合，调控相关基因的表达，参与植物对干旱胁迫的适应。3个赤霉素（GA）响应元件GARE