代谢组学生物样本采集、前处理与数据标准化管理标准

代谢组学生物样本采集、前处理与数据标准化管理标准一、生物样本采集规范（一）样本类型与采集原则代谢组学研究涉及的生物样本类型多样，常见的包括血液、尿液、组织、粪便、唾液等。不同样本类型的代谢物组成和稳定性差异显著，因此采集时需遵循以下核心原则：代表性原则：确保样本能真实反映研究对象的生理或病理状态，例如血液样本需避免溶血，尿液样本需采集中段尿以减少污染。稳定性原则：代谢物易受温度、pH、酶活性等因素影响，采集后需立即处理（如低温保存、添加抑制剂），避免代谢物降解或转化。一致性原则：统一采集时间、周期和条件（如空腹状态、采样姿势），减少个体内变异对结果的干扰。（二）常见样本采集流程1.血液样本血液是代谢组学研究中最常用的样本之一，主要分为血清、血浆和全血。血清采集：使用无抗凝剂的真空采血管，采集后室温静置30分钟（促凝血），随后以3000×g离心10分钟分离血清，分装后立即置于-80℃保存。血浆采集：根据研究需求选择抗凝剂（如EDTA、肝素、柠檬酸钠），采集后轻轻颠倒混匀，3000×g离心10分钟分离血浆，分装后-80℃保存。需注意：EDTA可能影响某些质谱分析，肝素则可能干扰核磁共振（NMR）检测。注意事项：避免剧烈摇晃导致溶血，溶血会释放红细胞内的代谢物（如乳酸脱氢酶、腺苷），严重干扰检测结果。2.尿液样本尿液代谢物浓度受饮食、饮水等因素影响较大，采集时需严格控制条件：采集时间：优先选择晨尿（浓缩度高，代谢物丰富）或24小时尿液（需添加防腐剂如甲苯、叠氮钠）。处理流程：采集后立即以4000×g离心10分钟去除沉淀，分装后-80℃保存。若无法立即处理，可暂时置于4℃冷藏（不超过24小时）。3.组织样本组织样本的采集需快速、低温，以最大限度保留代谢物的原始状态：采集步骤：手术或活检获取组织后，立即用预冷的生理盐水冲洗表面血液，用滤纸吸干水分，迅速切成约50-100mg的小块，放入液氮中速冻（避免冰晶形成破坏细胞结构），随后转移至-80℃保存。注意事项：避免样本在室温下暴露超过30秒，防止代谢物因酶解或氧化发生变化。4.粪便样本粪便样本富含肠道微生物代谢物，采集时需注意：采集方法：使用无菌采样管收集新鲜粪便（约5g），立即密封，置于-80℃保存。若需长期保存，可添加RNA保护剂或冻干处理。避免污染：采样过程中避免接触尿液、水或其他杂质，防止微生物群落改变。二、样本前处理技术细节样本前处理是代谢组学研究的关键环节，直接影响检测结果的准确性和重复性。核心目标是提取代谢物、去除杂质（如蛋白质、脂质）、浓缩样本。（一）提取方法选择根据样本类型和检测技术（如LC-MS、GC-MS、NMR），选择合适的提取溶剂和方法：液-液萃取（LLE）：利用代谢物在不同溶剂中的溶解度差异分离，常用于非极性代谢物（如脂质）的提取。例如，使用甲醇-氯仿混合溶剂（体积比2:1）提取组织中的脂质，离心后取有机相进行分析。固相萃取（SPE）：通过固相吸附剂富集目标代谢物，去除基质干扰，适用于复杂样本（如血液、尿液）。例如，使用C18柱吸附极性代谢物，用甲醇洗脱后进行LC-MS检测。蛋白沉淀法：快速去除蛋白质的常用方法，适用于血液、组织等样本。常用溶剂包括甲醇、乙腈、丙酮，比例通常为样本体积的3-5倍。例如，100μL血清加入400μL甲醇，涡旋混匀后4℃静置10分钟，12000×g离心15分钟，取上清液进行后续分析。（二）衍生化处理（针对GC-MS）GC-MS检测需代谢物具有挥发性，因此非挥发性代谢物（如糖类、氨基酸）需进行衍生化：硅烷化衍生：使用BSTFA（双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺）或MSTFA（N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺）作为衍生剂，在70℃下反应30分钟，将羟基、氨基等极性基团转化为硅醚键，提高挥发性。注意事项：衍生化需在无水条件下进行，避免衍生剂水解失效；衍生后样本需立即检测，防止衍生物分解。（三）分馏技术（针对复杂样本）对于代谢物种类繁多的样本（如组织、粪便），可通过分馏技术分离不同类型的代谢物：固相微萃取（SPME）：适用于挥发性代谢物（如挥发性脂肪酸）的提取，无需溶剂，通过纤维头吸附样本中的挥发性成分，直接进样GC-MS分析。凝胶过滤色谱（GFC）：利用分子大小差异分离代谢物，例如使用SephadexG-10柱去除样本中的大分子蛋白质，收集小分子代谢物组分。三、数据标准化流程代谢组学数据具有高维度、高噪声的特点，标准化处理是消除系统误差、确保数据可比性的核心步骤。（一）原始数据预处理峰检测与对齐：使用专业软件（如XCMS、MarkerLynx、ProgenesisQI）对LC-MS/GC-MS原始数据进行峰提取、峰对齐和峰匹配，校正保留时间漂移和质量偏差。例如，XCMS通过“m/z窗口”和“保留时间窗口”识别相同代谢物的峰，确保不同样本间的峰对应一致。基线校正与噪声去除：通过平滑算法（如Savitzky-Golay）去除基线漂移，使用阈值法（如3倍信噪比）过滤噪声峰，减少假阳性结果。（二）数据归一化归一化的目的是消除样本间的体积差异、浓度差异和仪器响应差异，常用方法包括：质量归一化：以样本干重或湿重为基准，适用于组织样本。例如，100mg组织提取的代谢物浓度归一化为“每mg组织的代谢物含量”。内标归一化：添加已知浓度的内标物（如肌醇、2-氯苯丙氨酸），通过内标物的响应值校正样本的提取效率和仪器波动。内标物需满足：不天然存在于样本中、提取和检测行为与目标代谢物相似。总峰面积归一化：将每个代谢物的峰面积除以样本总峰面积，适用于无合适内标的情况，但可能受高丰度代谢物的干扰。中位数归一化：假设样本中大多数代谢物的表达水平无差异，将每个样本的代谢物峰面积除以样本中位数，校正整体偏移。（三）数据转换与缩放对数转换：将数据转换为对数形式（如log2、log10），减少数据的偏态分布，使结果更符合统计分析的正态性假设。自动缩放（Auto-scaling）：对每个代谢物进行标准化（均值为0，标准差为1），适用于不同代谢物浓度差异较大的情况，可突出低丰度代谢物的变化。**Pareto缩放**：介于原始数据和自动缩放之间，对每个代谢物除以其标准差的平方根，既保留了数据的动态范围，又减少了高丰度代谢物的权重。四、数据标准化管理标准（一）实验记录标准化完整、规范的实验记录是数据可重复和可追溯的基础，需包含以下核心信息：样本信息：编号、类型、采集时间、采集人、保存条件。前处理信息：提取溶剂、衍生化试剂、仪器型号、操作步骤（如离心转速、时间）。检测信息：仪器参数（如LC-MS的流动相组成、梯度洗脱程序；GC-MS的柱温箱程序）、检测日期、操作员。数据文件：原始数据文件名、存储路径、预处理软件及参数。（二）数据存储与共享标准存储格式：推荐使用开放格式存储数据，如mzML（LC-MS/GC-MS）、nmrML（NMR），避免使用proprietary格式（如仪器自带的.raw格式）导致数据无法读取。元数据管理：元数据是描述数据的数据，需包含样本的临床信息（如年龄、性别、疾病状态）、实验设计（如对照组、处理组）、统计方法等。推荐使用ISA-Tab（InvestigationStudyAssayTabular）格式管理元数据，确保数据的可理解性和可共享性。共享平台：将数据上传至公共数据库，如MetaboLights（欧洲生物信息研究所）、MetabolomicsWorkbench（美国国立卫生研究院），促进数据的开放获取和二次利用。（三）质量控制（QC）标准QC样本是评估实验重复性和稳定性的关键，需贯穿整个实验流程：QC样本制备：将所有研究样本的提取物按等体积混合，制备成**pooledQC样本**，与研究样本一同进行检测。QC指标：保留时间稳定性：同一代谢物在不同QC样本中的保留时间偏差需<0.1分钟（LC-MS）或<0.5分钟（GC-MS）。峰面积RSD：QC样本中代谢物峰面积的相对标准偏差（RSD）需<30%（一般标准）或<20%（严格标准），RSD过高表明实验重复性差，需重新优化前处理或检测方法。主成分分析（PCA）：QC样本在PCA得分图中应聚集在一起，表明实验系统稳定；若QC样本分散，则需排查仪器漂移、样本处理差异等问题。（四）数据验证标准方法学验证：对检测方法进行线性范围、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率和精密度（日内、日间）的验证，确保方法的可靠性。例如，LC-MS方法的回收率需在80%-120%之间，日内精密度RSD<15%，日间精密度RSD<20%。生物重复验证：每个实验组至少包含6个生物重复（推荐10个以上），减少个体差异对结果的影响。统计分析需使用多重检验校正（如FDR、Bonferroni），避免假阳性结果。五、常见问题与解决方案问题类型表现形式解决方案样本溶血血清/血浆呈红色，代谢物峰异常升高采集时避免剧烈摇晃，若溶血严重则弃用样本代谢物降解目标代谢物峰面积降低采集后立即低温处理，添加酶抑制剂（如磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂）仪器漂移保留时间偏移，峰面积RSD升高定期校准仪器，使用QC样本监控，必要时重新优化色谱条件数据批次效应不同批次样本聚类分离采用批次校正方法