CN117338017B 一种微胶囊壁材、基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊及其制备方法 （渤海大学）

(19)国家知识产权局(12)发明专利地址121013辽宁省锦州市古塔区松山新区科技路19号(72)发明人宋虹李然刘贺杨立娜王鹏王胜男孟超合伙)21115A23P10/30(2016.01)A23L33/19(2016.01)A23L33/125(2016.01)A23L33/135(2016.01)第二十届年会摘要集.2023,238-239.的玻璃化益生菌微胶囊及其制备方法应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊及其制备方种皮多糖进行美拉德反应第一设定天数后得到21.一种基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊的制备方法，采用微胶囊壁材，微胶囊壁材的制备方法具体包括以下步骤：将乳清分离蛋白和大豆种皮多糖溶于水中；在第一设定温度条件下恒温搅拌第一设定时间；在第二设定温度静置第二设定时间，得调节所述混合溶液的pH至第一设定pH值；对调节pH值后的混合溶液进行冷冻干燥处理，得到冻干粉末；将所述冻干粉末研磨后放置于干燥器中，所述干燥器底部放置饱和盐溶液，将所述干燥器置于干燥箱中，将干燥箱的温度设定为第三设定温度，将干燥箱的相对湿度设定为第一设定湿度，乳清分离蛋白与大豆种皮多糖进行美拉德反应第一设定天数后得到的接枝微胶囊壁材为乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物得到的接枝物；基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：将益生菌在MRS肉汤培养基中活化M次，在第五设定温度下培养第三设定时间后，在第六设定温度下离心第四设定时间后，用生理盐水洗涤N次，得到益生菌悬浮液；将所述的微胶囊壁材溶于水中，得到微胶囊壁材溶液；将微胶囊壁材溶液与益生菌悬将所述混合物置于摇床培养箱中培养第五设定时间后，在第七设定温度下冷冻第六设定时间；在冷冻干燥机中冻干，得到冻干的玻璃化益生菌微胶囊。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，第五设定温度为25~37℃;第三设定时间为24~48h;第六设定温度为4℃;离心时的参数设置为8000rpm;第四设定时间为5~15min;N=1-3;设定比例为2:1~6:1;摇床培养箱的参数设置为37℃、170r/min;第五设定时间为1~3h;第七设定温度为-80℃;第六设定时间为2-4h。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：对所述玻璃化益生菌微胶囊的包埋率进行分析：对所述玻璃化益生菌微胶囊的冻干后存活率进行分析；对所述玻璃化益生菌微胶囊的热稳定性进行分析；对所述玻璃化益生菌微胶囊的胃肠道耐受性进行分析；对所述玻璃化益生菌微胶囊的贮藏稳定性进行分析。3采用标准平板计数法测定包埋后益生菌活力；取冻干前的玻璃化益生菌微胶囊在浓度测定冻干后益生菌的活力；将冻干后的玻璃化益生菌微胶囊溶解于1mL的浓度为0.2模拟胃液的制备：取1g胃蛋白酶溶于50mL蒸馏水中，定容至100mL,用浓度模拟肠溶液通过将溶液A和溶液B以2:1的比例混合并调节pH至8.0来制备得于50mL蒸馏水中，定容至100mL,调节pH至8;其中，溶液B的制备具体包括：称取0.9g胆汁盐放于100mL烧杯中，加入50mL蒸馏水溶解，再加水定容至100m称取0.05g包埋后的玻璃化益生菌微胶囊，加入至装有500μL模拟胃液的离心管5.一种采用权利要求1基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊制备方法所制4一种微胶囊壁材、基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及微胶囊技术领域，尤其涉及一种微胶囊壁材、基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊及其制备方法。背景技术[0002]玻璃态对产品在冷冻、干燥、贮存过程中的生物活性和稳定性至关重要。往往需要添加高玻璃化转变温度(Tg)的溶质以提高基质的Tg,从而可以实现在更高的温度下进行干燥，并获得高T的最终干燥产品以提高样品在储藏期间的稳定性。一些二糖和低聚糖常常因为其具有较高的Tg且容易形成玻璃态而作为冷冻干燥添加剂。然而，糖醇类物质则容易以结晶的形式从冷冻溶液中分离出来，导致其在冷冻干燥后失去稳定性。[0003]微胶囊壁材本身的物理化学特性直接影响微胶囊的稳定性、核心材料的保留效率和保质期。壁材必须在高浓度下具有合适的流变性能，并能够乳化活性材料、稳定生产的乳液，并在加工或储存过程中将芯材保持在其结构内免受破坏。乳清分离蛋白(WPI)在食品工业中常作壁材应用于益生菌、生物活性物质的包埋。然而WPI在食品加工过程中易受高温、高酸和盐等加工方式的影响而导致产品性质不稳定，在一定程度上限制了WPI的应用。然而利用美拉德反应制备蛋白质-多糖接枝产物，可以有效改善蛋白质在较宽的pH值范围内的素、大豆可溶性多糖等的接枝产物虽然对生物活性物质或益生菌获得了较好的保护，但未见分析WPI-多糖接枝产物作为微胶囊壁材的玻璃态转变与芯材在加工或储存过程中稳定性之间的相互联系。因此，需要对微胶囊的壁材的材料玻璃态进行优化，从而满足使用需[0004]大豆种皮多糖(Soyhullpolysaccharide,SHP)是一种非线性果胶类多糖，具有良好的稳定性、凝胶性，同时具有较高的Tg。通过与SHP的共价接枝可降低WPI的环境敏感性，赋予WPI接枝物良好的环境稳定性。此外，大豆种皮多糖相较于二糖和低聚糖具有更大的分子量，WPI-SHP共价接枝物具有更高的T。因此基于WPI-SHP美拉德反应产物的微胶囊壁材在加工或储存过程中将对益生菌具有更强的保护作用。通过对微胶囊壁材的玻璃化转变研究分析副干酪乳杆菌微胶囊的在加工和贮藏稳定性，以期为副干酪乳杆菌的利用提供理论基础从而加强对副干酪乳杆菌的产业发展和综合利用。发明内容[0005]本发明的目的是提供微胶囊壁材、基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊及其制备方法，以解决现有技术中的单一材料的壁材稳定性较差、包埋能力较弱，高温、高湿的加工或贮藏条件下不稳定而引起的微胶囊的结晶、团聚和塌陷，造成外界对益生菌损害的问题。[0006]为了实现上述目的，根据本发明的第一方面，提供了一种微胶囊壁材的制备方法，5制备方法具体包括以下步骤：将乳清分离蛋白和大豆种皮多糖溶于水中；在第一设定温度条件下恒温搅拌第一设定时间；在第二设定温度静置第二设定时间，得到混合溶液；调节混合溶液的pH至第一设定pH值；对调节pH值后的混合溶液进行冷冻干燥处理，得到冻干粉末；将冻干粉末研磨后放置于干燥器中，干燥器底部放置饱和盐溶液，将干燥器置于干燥箱中，将干燥箱的温度设定为第三设定温度，将干燥箱的相对湿度设定为第一设定湿度，乳清分离蛋白与大豆种皮多糖进行美拉德反应第一设定天数后得到的接枝物，作为微胶囊壁材。[0007]本发明将乳清分离蛋白和大豆种皮多糖组合使用，并考虑到简单组合得到的混合物对环境较为敏感，本发明还通过美拉德反应利用大豆种皮多糖对乳清分离蛋白进行了共价修饰，得到乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物，即乳清分离蛋白-大豆种皮多糖接枝物，得到的接枝物可以作为微胶囊壁材，对益生菌进行包埋，乳清分离蛋白与益生菌之间具有很强的结合力，可以有效提高包埋率，与此同时，多糖分子可以附着在蛋白质核的表面，有助于提升载体，即微胶囊壁材的稳定性，并且经过共价修饰后受pH、离子强度和温度等环境因素的影响较小，对环境敏感性降低，具有较好的乳化性和较高的玻璃化转变温度，从而提高益生菌在高温、胃肠道环境和贮藏过程中的存活率。[0008]乳清分离蛋白(whyproteinisolate,WPI)是一种优质蛋白，具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分等特点，在食品工业中作壁材应用于益生菌、生物活性物质的包埋具有较好的效果。大豆种皮多糖(Soyhullpolysaccharide,SHP)是一种非线性果胶的影响而导致产品性质不稳定，在一定程度上限制了WPI的应用。为了拓宽WPI的应用范围，本发明对WPI进行共价修饰。本发明共价修饰法利用美拉德反应制备蛋白质-多糖接枝产物，改善后的蛋白质在较宽的pH值范围内的乳化性、热稳定性、抗氧化性、抗菌性和水溶性价接枝可降低WPI的环境敏感性，赋予WPI接枝物良好的环境稳定性。[0009]本发明在众多蛋白质和多糖中选择了乳清分离蛋白和大豆种皮多糖进行美拉德反应，得到的接枝物经过实验验证，在作为微胶囊壁材时具有较好的性能，进一步地，可将该微胶囊壁材应用于对益生菌的包埋。[0010]当然，本发明提供的微胶囊壁材也可以应用于对其他物质的包埋。[0012]可选地，第一设定温度为室温，即20℃~27℃。温度过低会对蛋白质的结构和功能产生影响；而在较高的温度下，蛋白质由于解离时间增加而使其结构发生破坏，蛋白质活性和生物功能随之下降。经实验验证，当第一设定温度在上述数值范围内时，蛋白质的活性和生物功能较好、不会改变蛋白质的结构。[0013]优选地，第一设定温度为25℃。当第一设定温度为上述数值时，蛋白质的活性、结[0014]可选地，第一设定时间大于或等于8h。搅拌时间过少会导致蛋白-多糖混合不均[0015]优选地，第一设定时间为8h。8h可以在节约时间的同时让蛋白-多糖搅拌混合均6[0017]可选地，第二设定温度为2～6℃。由于需要在该温度下过夜存放，存放温度过高会导致蛋白-多糖变质，过低会使其结构功能受到影响。经实验验证，当第二设定温度在上述数值范围内时，在保证蛋白-多糖混合物不变质的情况下，结构功能不受影响。[0018]优选地，第二设定温度为4℃。经实验验证，在4℃条件下可以更好的保持蛋白-多糖的结构和功能特性。[0019]可选地，第二设定时间大于或等于12h。如果时间较短，不能确保溶液充分水化。经实验验证，第二设定时间大于或等于12h时，能够确保溶液充分水化。[0020]优选地，第二设定时间为12h。12h可以在节约时间的同时确保蛋白-多糖混合均匀并充分水化。[0021]可选地，第一设定pH值为6～8.pH对美拉德反应的进行具有一定的影响。当pH<6[0022]优选地，第一设定pH值为7;pH=7是美拉德反应最适宜的pH,美拉德反应通常在中[0023]可选地，第三设定温度为55-65℃;第一设定湿度为75-85%。在美拉德反应过程中，需要在干燥箱底部放置饱和盐溶液来保持湿度，不同的饱和盐溶液在不同的温度会有不同的湿度，此外，第三设定温度也会影响美拉德反应的进行。[0025]优选地，盐溶液为溴化钾溶液(KBr);第三设定温度为60℃;第一设定湿度为79%。美拉德反应需要用饱和溴化钾溶液来保持他的湿度，而饱和溴化钾溶液在60℃条件下可以达到79%的相对湿度。经实验验证，在上述温度和湿度数值时，美拉德反应得到的接枝物更符合本发明的要求。[0026]可选地，第一设定天数为1～6天，得到六种接枝物，分别为WPI-SHP₁a、WPI-SHP₂d材。[0027]优选地，第一设定天数为4天。经实验验证，在接枝时间为4天时，得到的接枝物WPI-SHP₄有最好的乳化性和最高的玻璃化转变温度。[0028]可选地，将所得接枝物放置在第四设定温度下进行储存；第四设定温度为-20℃。当第四设定温度为上述数值时，能够避免接枝物变质，具有较好的存储效果。[0029]优选地，将第四天的接枝物WPI-SHP₄作为微胶囊壁材；将所得接枝物放置在-20℃的冰箱中储存。经实验验证，当参数为上述数值时，得到的接枝物的性能最优，接枝物的储存效果最优。[0030]经实验验证，当各参数在上述数值范围内时，得到的接枝物的性能较好，接枝物的储存效果较好。[0031]其中，调节混合溶液的pH的具体方法可以采用现有调节pH的方法实现。[0032]可选地，为了验证本发明提供的微胶囊壁材的性能，制备方法还包括以下步骤：取反应过程中的WPI-SHP混合物和WPI-SHP接枝物作为样品；计算样品的接枝度；计算样品的pH值；对样品的乳化性质进行分析；对样品的玻璃化转变温度进行分析；对样品的蛋白分子量进行分析；对样品进行表征。这样，本发明的制备方法还对接枝物的性能进行了分析，并7[0033]可选地，取反应过程中0天的WPI-SHP混合物以及1-6天的WPI-SHP接枝物WPI-[0037]可选地，对接枝物的乳化性质进行分析的方法具体包括：将样品溶于浓度为液，用0.1%的十二烷基硫酸钠溶液稀释序设置为：以10℃/min从室温加热至180℃,在180℃下平衡5min,以同样速率冷却至10℃,并在10℃下平衡5min,然后再以10℃/min加热至220℃;采用差示热量扫描仪的分析软件分8[0045]需要说明的是，利用软件分析得到玻璃化转变温度范围采用现有技术实现，在此不再赘述。[0046]可选地，对样品的蛋白分子量进行分析的方法具体包括：采用高效排阻色谱法分析反应前后蛋白分子量变化；仪器为LC-10A高效液相色谱仪HPLC;流动相：浓度为0.2mol/L温：40℃;检测器：示差检测器RID-10A;分析时间：60min;样品浓度和进样体积分别为2mg/mL和25μm。这样，利用本发明提供的方法能够得到样品的高效排阻色谱洗脱曲线，即HPSEC洗脱曲线，从而可以对接枝物的蛋白分子量进行分析，蛋白分子量越大的化合物洗脱时间[0047]可选地，对样品进行表征的方法具体包括：采用傅里叶红外光谱对美拉德反应产物进行表征；将冻干样品与烘干的溴化钾1:100混合于玛瑙研钵并充分研磨，压制样品溴化钾薄片，使用傅里叶变换红外光谱仪在波数400-4000cm⁻¹范围内采集图谱，分辨率为4cm⁻¹,总扫描次数为32次。这样，利用本发明提供的方法能够得到接枝物的光谱，验证乳清分离蛋白与大豆种皮多糖之间是否发生了共价接枝反应。[0048]根据本发明的第二方面，提供了一种微胶囊壁材，微胶囊壁材由上述的制备方法制备得到，微胶囊壁材为乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物得到的接枝物。本发和贮藏稳定性的性能较好。[0049]根据本发明的第三方面，提供了一种基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微定温度下培养第三设定时间后，在第六设定温度下离心第四设定时间后，用生理盐水洗涤N次，得到益生菌悬浮液；将上述的微胶囊壁材溶于水中，得到微胶囊壁材溶液；将微胶囊壁材溶液与益生菌悬浮液按照设定比例混合，得到混合物；将混合物置于摇床培养箱中培养第五设定时间后，在第七设定温度下冷冻第六设定时间；在冷冻干燥机中冻干，得到冻干的玻璃化益生菌微胶囊。[0050]这样，利用本发明提供的基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊的制备方法得到的玻璃化益生菌微胶囊，具有较好的包埋率、冻干后存活率、热稳定性、胃肠道耐受性和贮藏稳定性。[0052]可选地，除副干酪乳杆菌外，本申请提供的微胶囊壁材也可以对其他益生菌进行[0053]可选地，M=3-5;第五设定温度为25～37℃;第三设定时间为24～48h;第六设定温度为4℃;离心时的参数设置为8000rpm;第四设定时间为5～15min;N=1-3;设定比例为2:1~6:1;摇床培养箱的参数设置为37℃、170r/min;第五设定时间为1～3h;第七设定温度为-80℃;第六设定时间为2-4h。经实验验证，当参数在上述数值范围内时，得到的接枝物的性[0054]优选地，M=3;第五设定温度为37℃;第三设定时间为48h;第六设定温度为4℃;离心参数设置为8000rpm;第四设定时间为10min;N=2;设定比例为4:1;摇床培养箱的参数设置为37℃、170r/min;第五设定时间为2h;第六设定温度为-80℃;第六设定时间为2h。经实9度为0.85%的无菌生理盐水中连续稀释10倍，然后铺在MRS琼脂上；37℃孵育48h;计数以化益生菌微胶囊溶解于1mL浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲液中，60℃下处理30min,80℃下处方法可以对玻璃化益生菌微胶囊的热稳定性进行分析，评估益加入等体积的模拟肠液，得到混合液，继续培养3h,并分别在1、2、3h时进行活以LogCFU单位表示。这样，利用本发明提供的方法可以对益生菌微胶囊的胃肠道耐受性进行分析，从而对益生菌微胶囊的性能进行评价。[0064]可选地，对玻璃化益生菌微胶囊的贮藏稳定性进行分析具体包括：将玻璃化益生益生菌微胶囊粉末于1mL无菌磷酸盐缓冲溶液中，37℃培养30min,采用平板计数法测定活菌数；计数以LogCFU单位表示。这样，利用本发明提供的方法可以对玻璃化益生菌微胶囊的贮藏稳定性进行分析，从而对玻璃化益生菌微胶囊的性能进行评价。[0065]可选地，为了进一步验证本发明提供的玻璃化益生菌微胶囊的性能较优，进行对比实验。经试验数据表明，本发明提供的第四天的接枝物具有最高的乳化性质和玻璃化转变温度，因此，优选第四天的接枝物作为微胶囊壁材对益生菌进行包埋。在对益生菌微胶囊进行性能分析时，也选用第四天的接枝物制备得到的益生菌微胶囊与采用乳清分离蛋白WPI、大豆种皮多糖SHP、乳清分离蛋白-大豆种皮多糖的混合物WPI-SHP制备得到的益生菌微胶囊、以及处于游离状态的益生菌进行对比，从而验证本发明提供的利用乳清分离蛋白-大豆种皮多糖第4天的接枝物WPI-SHP₄制备得到的玻璃化益生菌微胶囊的性能是否更优。[0066]在进行对比实验时，分别将溶液比例为3.5%的乳清分离蛋白WPI、大豆种皮多糖SHP、乳清分离蛋白-大豆种皮多糖的混合物WPI-SHP、乳清分离蛋白-大豆种皮多糖第4天的接枝物WPI-SHPa溶液与副干酪乳杆菌悬浮液按4:1的比例混合，得到四种混合物；将四种混合物置于37℃,170r/min的摇床培养箱中培养2h,并在-80℃的冰箱中冷冻2h;在冷冻干燥机中冻干，得到四种冻干的玻璃化益生菌微胶囊。其中，将3.5g第4天的接枝物WPI-SHP₄a溶于100mL水中，得到溶液比例为3.5%的接枝物WPI-SHPa溶液。[0067]根据本发明的第四方面，还提供了一种基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊，玻璃化益生菌微胶囊根据上述或下述的制备方法制备得到。[0068]应用本发明的技术方案，将乳清分离蛋白和大豆种皮多糖组合使用，并考虑到简单组合得到的混合物对环境较为敏感，本发明通过美拉德反应利用大豆种皮多糖对乳清分离蛋白进行了共价修饰，得到乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物，即乳清分离蛋白-大豆种皮多糖接枝物，得到的接枝物可以作为微胶囊壁材，对益生菌进行包埋，乳清分离蛋白与益生菌之间具有很强的结合力，可以有效提高包埋率，与此同时，多糖分子可以附着在蛋白质核的表面，有助于提升载体，即微胶囊壁材的稳定性，并且经过共价修饰后受pH、离子强度和温度等环境因素的影响较小，对环境敏感性降低，从而提高益生菌在高温、胃肠道环境和贮藏过程中的存活率。[0069]本申请在上述各方面提供的实现方式的基础上，还可以进行进一步组合以提供更多实现方式。附图说明[0070]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。11[0071]图1示出了WPI-SHP混合物及WPI-SHP接枝物的pH变化及接枝度；[0072]图2示出了WPI、WPI-SHP混合物和WPI-SHP接枝物的EAI;[0073]图3示出了WPI、WPI-SHP混合物和WPI-SHP接枝物的ESI;[0074]图4示出了WPI、WPI-SHP混合物和WPI-SHP接枝物的HPSEC洗脱曲线；[0076]图6示出了益生菌微胶囊的包埋率；[0077]图7示出了益生菌冻干后的存活率；[0078]图8示出了游离和不同壁材包埋副干酪乳杆菌模拟巴氏灭菌条件的生存能力；[0079]图9示出了游离和不同壁材包埋副干酪乳杆菌在模拟胃肠消化过程中的生存能[0080]图10示出了在4℃条件下游离和不同壁材包埋副干酪乳杆菌在贮藏过程中的生存能力；[0081]图11示出了在25℃条件下游离和不同壁材包埋副干酪乳杆菌在贮藏过程中的生存能力。具体实施方式[0082]为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范[0083]本申请属于微胶囊技术领域，具体涉及乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物作为微胶囊壁材对益生菌进行包埋及提高益生菌在冷冻、巴氏杀菌、模拟胃肠消化及贮藏中的存活能力的应用。[0084]目前，大多采用单一的蛋白质或者单一的多糖作为微胶囊的壁材，但单一的壁材存在较多缺点。蛋白质在等电点pH附近或高离子强度下易聚集沉淀，且多存在热稳定性的不足；而多糖大分子通常对芯材的包埋能力较弱。因此，需要对微胶囊的壁材的材料进行优化，从而满足使用需求。[0085]玻璃态对产品在冷冻、干燥、贮存过程中的生物活性和稳定性至关重要。往往需要添加高玻璃化转变温度(Tg)的溶质以提高基质的Tg,从而可以实现在更高的温度下进行干燥，并获得高T的最终干燥产品以提高样品在储藏期间的稳定性。一些二糖和低聚糖常常因为其具有较高的Tg且容易形成玻璃态而作为冷冻干燥添加剂。然而，糖醇类物质则容易以结晶的形式从冷冻溶液中分离出来，导致其在冷冻干燥后失去稳定性。大豆种皮多糖是一种非线性果胶类多糖，具有良好的稳定性、凝胶性。大豆种皮多糖相较于二糖和低聚糖具有更大的分子量，具有更高的T。因此大豆种皮多糖作为微胶囊壁材在加工或储存过程中将对益生菌将具有更强的保护作用。目前没有将大豆种皮多糖应用在微胶囊壁材制备的技术方案。[0086]蛋白质和多糖组合使用，可以提升递送载体的功能性质，改善包埋传递效果。在蛋白质-多糖复合载体中，蛋白质与芯材物质具有很强的结合力，可以有效提高包埋率，与此同时，多糖分子可以附着在蛋白质核的表面，有助于提升载体的稳定性。而蛋白质-多糖生物大分子载体形成所涉及的主要作用力大部分会受pH、离子强度和温度等环境因素的影响，从而造成该体系对环境的敏感性。美拉德反应产物是由美拉德反应制备的一类复杂的混合物，是羰基化合物(还原糖等)与氨基化合物(肽、氨基酸、蛋白质等)发生羰氨反应的产物。美拉德反应产物具有良好的溶解性、乳化性、抗氧化性和潜在的益生特性，并能够在广泛的pH值、温度和离子强度范围内保持稳定，被认为是生物活性物质良好的递送载体。因此，本发明利用大豆种皮多糖通过美拉德反应对乳清分离蛋白进行共价修饰，形成具有较高T的乳清分离蛋白-大豆种皮多糖接枝物，利用该接枝物对益生菌进行包埋，从而提高益生菌在高温、胃肠道环境和贮藏过程中的存活率。[0087]本发明采用的共价修饰法为利用美拉德反应制备乳清分离蛋白质-大豆种皮多糖接枝产物，改善后的乳清分离蛋白质在较宽的pH值范围内的乳化性、热稳定性、抗氧化性、抗菌性、水溶性和玻璃态转变温度都得到了极大改善。本发明将大豆种皮多糖应用于美拉德反应以改善WPI的功能特性，通过与SHP的共价接枝可降低WPI的环境敏感性，赋予WPI接枝物良好的环境稳定性。鉴于此本发明提供了一种乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物制备方法并将其应用于益生菌微胶囊。[0088]针对微胶囊壁材及制备方法，本发明提供了实施例一；针对基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊及制备方法，本发明提供了实施例二。下面对实施例一和实施例二进行详细阐述。[0089]实施例一[0090]本发明提供了一种乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物及其制备方法。[0091]本发明所使用的乳清分离蛋白是乳清分离蛋白WPI-90;大豆种皮多糖为实验室提[0092]首先，对乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物进行制备：[0093]将乳清分离蛋白与大豆种皮多糖按照1:1(m/m)的比例溶于超纯水中，调节比例至1%,其中，1%的含义是指乳清分离蛋白和大豆种皮多糖的浓度占纯水的1%,在恒温磁力搅拌器中，以室温25℃的温度充分搅拌8h,4℃过夜，其中，过夜为大于12h,以确保其充分水化，调节溶液pH为7.0最好，充分混合后冷冻干燥，将冻干后的粉末充分研磨后放置于干燥器中(容器底部放置饱和盐溶液，饱和盐溶液为KBr溶液),将干燥器置于鼓风干燥箱中并调节温度60℃从而保持干燥器内相对湿度为79%,反应1-6天即得到接枝物WPI-SHP¹、WPI-[0094]其次，对乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物的接枝度和pH值进行分析。[0095]称取40mg的邻苯二甲醛(OPA)溶解于1ml的甲醇中，分别加入20%十二烷基硫酸钠应过程中0天的WPI-SHP混合物以及1-6天的接枝物作为样品。以200μL超纯水代替样品作为著(p<0.05)。增加至25.29%,表明干热反应中接枝物不断形成，随后几天接枝度增加缓慢，这是因为在为美拉德反应其实是羰氨缩合反应，氨基酸的碱性基团-氨基不断与还原糖的羧基结合从[0102]将样品溶于0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.0)中制备蛋白质浓度为2.0mg/mL活性指数(emulsifyingactivityindex,EAI)和乳化稳定性指数(emulsionstabilityindex,ESI)分别根据公式(2)和公式(3)计算：WPI-SHP₄的乳化性能最优。这是因为SHP与WPI共价结合后可通过空间稳定作用以及在油滴周围形成大分子稳定层来改善其乳化性能。此外，接枝物更好的溶解性也会对其乳化性能产生积极影响。然而，接枝物的乳化性在反应时间超过5d后开始降低。这是因为长时间热处理后接枝物的溶解度和表面疏水性降低所致。因此，蛋白质-多糖截止物疏水性和亲水性之间合适的平衡，是其具有优良乳化性能的关键。[0108]之后，再对乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物玻璃化转变温度进行分析。[0109]采用差示热量扫描仪测定样品的玻璃化转变温度，分别称取5-7mg样品放在铝坩埚中密封，以空坩埚作参照。扫描程序设置为：以10℃/min从室温加热至180℃,在180℃下平衡5min,以同样速率冷却至10℃,并在10℃下平衡5min,然后再以10℃/min加热至220℃。采用仪器自带软件分析得到玻璃化转变温度范围内的中间点，并以此作为T。结果见表1。[0113]在益生菌微胶囊的冷冻干燥和储存过程中，Tg对微囊化的益生菌的存活率起着重要作用。一般来说，较高的Tg壁材可以抑制预冻过程中液体中较大冰晶的形成，加速升华过程，从而减少对益生菌的损害。在玻璃态下，除了通过限制分子的流动性外，较高的Tg壁材可以减缓微胶囊在储存过程中从玻璃态向橡胶态的转变。因此，减少了由水分和空气等外部因素引起的微胶囊的结晶、团聚和塌陷，从而减少外界对益生菌的损害。根据表1可以看出，乳清分离蛋白和大豆种皮多糖T分别为65.92和120.08℃。接枝物的Tg均高于乳清分离蛋白和大豆种皮多糖，其中干热接枝反应4天的接枝物具有最高的T为140.51℃。长期美拉德反应产生的接枝物具有较高的Tg,对接枝产物作为包埋壁材有较好的影响，SHP具有良好的相容性。美拉德反应是一个复杂的过程，随着干热反应时间的延长，形成了较大分子量的接枝物，这是Tg升高的原因，这有利于对副干酪乳杆菌微胶囊的制备和储存。态、粘流态。随着分子运动的热量增加，物质逐渐由玻璃态向橡胶态转变，当热量增加到使物质出现可以流动且具有粘性的状态时，其状态成为粘流态。研究发现，物质从玻璃态向橡胶态发生转变的过程被认为对食品基质的稳定性具有重要意义，也就是玻璃化转变(glasstransition),发生这种转变时对应的环境温度称为玻璃化转变温度(glasstransitiontemperature,Tg)。研究表明，玻璃态对产品在冷冻至关重要。如往往需要添加高T的溶质以提高基质的T,从而可以实现在更高的温度下进行干燥，并获得高T的最终干燥产品以提高样品在储藏期间的稳定性。一些二糖和低聚糖常常因为其具有较高的Tg且容易形成玻璃态而作为冷冻干燥添加剂。然而，糖醇类物质则容易以结晶的形式从冷冻溶液中分离出来，导致其在冷冻干燥后失去稳定性。[0115]有鉴于此，本发明提出一种乳清分离蛋白和大豆种皮多糖美拉德反应产物的制备方法，此方法制备的美拉德反应产物具有较好的乳化性和较高的玻璃化转变温度，并将该产物作为益生菌的包埋壁材，保护其在高温、胃[0116]之后，对乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物进行表征。[0117]采用高效排阻色谱(HPSEC)和傅里叶红外光谱(FT-IR)对乳清分离蛋白-大豆种皮多糖美拉德反应产物表征。[0118]采用高效排阻色谱法分析反应前后蛋白分子量变化。仪器为LC-10A高效液相色谱BRT105-103-101串联凝胶柱(8×300mm);流速：0.8ml/min;柱温：40℃;检测器：示差检测器看出，WPI洗脱曲线中只有一个主峰出现在大的化合物洗脱时间越短。因此，表明有高分子量的WPI-SHP接枝物的形成且含量随反应时间的延长而增加。但是，后面WPI的洗脱峰并未完全消失，意味着并非所有WPI都与SHP共价接枝。[0120]采用傅里叶红外光谱对美拉德反应产物进行表征。将冻干样品与烘干的溴化钾1:100混合于玛瑙研钵并充分研磨，压制样品溴化钾薄片，使用傅里叶变换红外光谱仪在波数400-4000cm⁻¹范围内采集图谱，分辨率为4cm⁻¹,总扫描次数为32次。看出，乳清分离蛋白在酰胺I带的吸收峰位于1649cm⁻¹,为C=0伸缩振动；酰胺I带位于1531cm⁻¹,为N-H弯曲振动，1246cm⁻¹波数的吸收峰代表酰胺III带，为C-N伸缩振动和N-H变与大豆种皮多糖发生美拉德反应，多糖消耗了部分羰基和氨基，并产生Amadori化合物(C-0)、席夫碱(C-N)和吡嗪(CN),导致峰值强度和位置变化。乳清分离蛋白在1649cm¹处的波数随美拉德反应的进行移动到1652cm⁻¹,这代表具有C-N结构的席夫碱的形成。糖基化后，乳清分离蛋白在1531cm⁻¹处的吸收峰移动到1537cm⁻¹,表明美拉德反应过程中氨基酸残基耗尽。以上结果均证明了乳清分离蛋白与大豆种皮多糖共价接枝反应的发生。[0122]通过接枝度、高效排阻色谱、傅里叶红外光谱证明了美拉德反应的发生，乳清分离蛋白-大豆种皮多糖4天的接枝物具有最高的乳化性质和玻璃化转变温度，基于此，优选乳[0124]实施例二对基于美拉德反应产物制备的玻璃化益生菌微胶囊及其制备方法进行[0126]副干酪乳杆菌在MRS肉汤培养基中活化2次，37℃培养48h后，4℃8000rpm离心合物(WPI-SHP)、乳清分离蛋白-大豆种皮多糖4天接枝物(WPI-SHP⁴)溶液(3.5%,[0134]图6示出了益生菌微胶囊的包埋率，图6中，小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。根据图6可以看出美拉德反应4d产物中益生菌的高包埋率为94.01%±2.66%。相比[0136]测定冻干前后副干酪乳杆菌的活力。所得微胶囊溶解于1mL磷酸缓冲液(0.2mo[0137]图7示出了益生菌冻干后的存活率。图7中，小写字母不同表示差异显著(p<53.99%±0.19%、63.88%±0.34%、76.48%±1.01%和87.35%±1.73%。游离副干酪乳杆菌(naked)的存活率仅为24.95%±0.55%。与单壁反应产物包埋副干酪乳杆菌4d的包埋率和冷冻干燥后的存活率更高。这是由于乳清分离蛋菌提供了更好的保护。此外，美拉反应产物作为益生菌因子，可以嵌入副干酪乳杆菌中，起到保护作用，也可以为其生长繁殖提供营养。[0139]冷冻干燥后的微胶囊溶解于1mL磷酸缓冲液(0.2mol/L)中，60℃下处理30min,80℃下处理5min。然后，将样品置于冰水浴中冷却10分钟，以评估游离和包埋后的副干酪乳杆菌对不同温度条件的耐受性。计算热处理后游离和包封后副干酪乳杆菌的活菌数。计数以[0140]图8示出了游离和不同壁材包埋副干酪乳杆菌模拟巴氏灭菌条件的生存能力。图8中，小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。根据图8可以看出经60℃热处理30min后，游离的副干酪乳杆菌由初始的10.94logCFU/mL减少到9.13logCFU/mL。4种微胶囊对副干酪乳杆菌也有不同的保护作用，其中WPI-SHP在整个热处理过程中对副干酪乳杆菌的保护效果最好。活菌数量仅减少0.18logCFU/mL。80℃热处理5min后，游离的副干酪乳杆菌减少酪乳杆菌活菌数维持在6.19logCFU/mL。[0141]之后，对益生菌微胶囊的胃肠道耐受性进行分析：[0142]模拟胃液的制备：取1g胃蛋白酶溶于50mL蒸馏水中，定容至100mL,用1mol/L盐酸调节pH至2。模拟肠溶液通过将溶液A和溶液B以2:1(v/v)混合并调节pH至8.0来制备得到。溶液A的制备：0.1g胰蛋白酶、1.1g碳酸氢钠和0.2g100mL,调节pH至8.溶液B的制备：称取0.9g胆汁盐放于100mL烧杯中，加入50mL蒸馏水至装有500μL模拟胃液的离心管中，涡旋振荡混匀，快速置于摇床培养箱中进行培养，培养囊在模拟胃液中的活菌数量进行计数。在模拟胃液培养2h后，加入等体积的模拟肠液，得到[0144]图9示出了游离和不同壁材包埋副干酪乳杆菌在模拟胃肠消化过程中的生存能[0145]根据图9可以看出模拟胃液0h时游离副干酪乳杆菌为9.91logCFU/mL,1h和2h时分别降至9.66和8.391ogCFU/mL。副干酪乳杆菌进入模拟肠液后3小时内，活菌数由8.391ogCFU/mL下降到6.74logCFU/mL。此外，不同壁材包埋的副干酪乳杆菌经胃肠道消化后，不同样品间的活菌数量差异不大。在整个消化过程中，游离益生菌减少了3.17logCFU/mL,不同壁材包埋后的益生菌存活率均大于71ogCFU/mL。体外消化结果表明，微胶囊化可以提高益生菌对胃肠道疾病的抵抗力，使足够的益生菌进入人体，并在肠道内缓慢释放。微胶囊化提高了益生菌在酸性条件下的存活率，是因为微胶囊的壁材阻碍了酸向微胶囊内部扩散，使得微胶囊的内部pH值高于外部pH生菌对胃液的耐受性。微胶囊的存在减缓了胆盐的扩散，从而减缓了胆汁盐对益生菌细胞[0147]将冻干后的微胶囊分别在4℃和25℃贮存，在第0、1、2、3、4周测定微胶囊的活菌数。称取10mg微胶囊粉末于1mL无菌磷酸盐缓冲溶液中，37℃培养30min,采用平板计数法测[0148]图10示出了在4℃条件下游离和不同壁材包埋副干酪乳杆菌在贮藏过程中的生存[0149]根据图10可以看出随着贮存时间的延长，副干酪乳杆菌的活力逐渐降低。在4℃条件下贮存4周后，游离的益生菌由10.41logCFU/mL下降到8.10logCFU/mL,并且与单一壁材和混合物相比，其美拉德反应产物对益生菌的保护效果更强，在贮存4周后其活菌数仍>10logCFU/mL,符合益生菌产品在活菌数量和健康益处方面的要求。[0150]图11示出了在25℃条件下游离和不同壁材包埋副干酪乳杆菌在贮藏过程中的生存能力。[0151]根据图11可以看出在25℃条件下贮存4周后，游离的副干酪乳杆菌降低到4.21ogCFU/mL,包埋后的益生菌比游离的益生菌表现出更高的存活率，其活菌数量均>6logCFU/mL。而壁材的T对益生菌的保护起着至关重要的作用，反应生成的美拉德反应产物具有更大分子量和更高的Tg,微胶囊壁材的分子迁移率降低，分子运动受到限制，微胶囊的玻璃态状态更稳定，为副干酪乳杆菌提供了更有效的保护。[0152]综上所述，利用美拉德反应4天的产物制备的益生菌微胶囊，可实现对益生菌的高包埋率，增强益生菌对高温、胃肠道环境的的抵抗力，确保足够数量的益生菌到达靶向部[0153]本发明通过乳清分离蛋白-大豆种皮