（正式版）DB54∕T 0562-2026 《牦牛片形吸虫病防控技术规程》

ICS65.020.30CCSB4354IDB54/T0562—2026 2规范性引用文件 3术语和定义 4诊断 5实验室诊断 2 2 3附录A（资料性）片形吸虫虫卵形态及感染牦牛肝脏 4附录B（规范性）实验室检测方法 5DB54/T0562—2026本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所、佛山大学。本文件主要起草人：唐文强、黄福强、赵霞玲、石斌、马弘财、韩海玉、何小国、任晓丽。1本文件规定了牦牛片形吸虫病的临床诊断、实验室诊断、防控和治仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。《中华人民共和国兽药典》(2020版)NY/T1950-2010片形GB19489-2008实验室生物安全通用要求急性期损害，以及成虫寄生于胆管内所致的以胆管上皮增生、4诊断2取新鲜粪便进行聚合酶链式反应，扩增出特异性目的片段，只出现约250虫，只出现约500bp的特异性条带为大片吸虫，同时出现约250bp和500bp条带为“中间型”片形吸虫，DB54/T0562—20263每年春、冬两季定期驱虫，牛群发病可随时驱虫。6.1.2驱虫药物选择驱虫药多使用高效、低毒且能驱杀各发育阶段虫体的药物，推荐使用三氯苯达唑。6.1.3驱虫方法预防片形吸虫病要有季节性，针对童虫和成虫分别驱虫。在春季驱虫，以驱除杀灭机体内残存的成虫；在进入夏季牧场前给药，以防止囊蚴感染机体；在秋季节进行一次驱虫，以驱除感染的虫体，防止在体内发育。防控中间宿主结合草原或农田基本建设、兴修水利和填补与改造低洼沼泽地带等措施，控制椎实螺生存的环境。具备条件的，可用饲养的水禽、鸭、鹅等生物方法灭螺。粪便无害化处理实施驱虫的牛，远离中间宿主区域，圈留5d～7d，对病牛所排粪便及时清理，严格进行生物热发酵、焚烧，杀死虫卵。加强饲养卫生管理选择在干燥处放牧，最好饮用自来水、井水或流动的河水，并保持水源清洁，以防感染。利用人工草场，不食用流行区的牧草。采用放牧与补饲相结合的饲养方式，合理补充精料和添加剂，增强牦牛体质。7治疗药物应符合《中华人民共和国兽药典》要求，选择高效、低毒、安全方便、易于推广的驱虫药，首选对童虫和成虫有效的三氯苯哒唑和碘醚柳胺等药物；粪便虫卵检查发现有虫卵，则选用硝氯酚、丙硫咪唑和吡喹酮等对成虫效果较好且价格相对低廉的药物。根据剂型含量不同，具体用量以药品说明书为依据，并严格遵守药物规定的用法、用量和休药期。严禁使用未经农业农村部批准或已淘汰的兽药。4(资料性)DB54/T0562—20265（规范性）实验室检测方法B.1粪便虫卵检查（水洗沉淀法）B.1.1材料200mL玻璃杯，60目网筛，玻璃棒，镊子，胶帽吸管，载玻片和盖玻片，天平，显微镜。B.1.2方法取新鲜粪便10g放入玻璃杯中，先加10mL水搅成糊状，然后再继续加水20倍。经充分混合后，用60目网筛滤入另一玻璃杯中，把滤过的粪便混悬液静置沉淀30分钟后，倒掉上清液，再继续加水混合，静置沉淀。静置的时间可逐渐缩短，但至少要10分钟。这样反复进行，直到上清液透明为止。最后吸取沉淀物放在载玻片上，加盖玻片在显微镜下作定性检查。若作定量检查，须将所有沉淀物全部镜检（不加盖玻片，用低倍显微镜检查），统计全部虫卵数。B.1.3结果判定肝片吸虫和大片吸虫虫卵前端均较窄，有一个不明显的卵盖，后端较钝。卵壳较薄而透明，卵内充满卵黄细胞和一个胚细胞（见附录A的图A.1）。肝片形吸虫(F.hepatica)虫卵呈长卵圆形，大小为116μm～132μm×66μm～82μm，大片形吸虫(F.gigantica)虫卵的形态与肝片形吸虫虫卵相似，大小为150μm～190μm×75μm～90μm。由于西藏地区存在中间型片形吸虫，因此无法通过虫卵形态区别出所检测的片形吸虫虫卵为大片吸虫卵还是肝片吸虫卵，如要进一步区分，可通过PCR方法（按B.3进行）进行鉴别。同时，由于同盘属吸虫（genusParamphistomum）虫卵与片形吸虫虫卵形态和大小相似，还应区别片形吸虫虫卵与同盘吸虫虫卵，两者的鉴别要点为：同盘吸虫虫卵呈灰白色，有透明感，卵黄细胞松散地分布在内，可见到许多空隙。其次，通过微分干涉相差显微镜可以看到片形吸虫的胚细胞在虫卵前端，而同盘吸虫的胚细胞在虫卵中部偏后。B.2肝脏虫体检查B.2.1材料解剖刀，组织剪，挑虫针，无齿镊，搪瓷盆，搪瓷盘，搪瓷缸，大平皿，载玻片。B.2.2虫体采集a）按一般剖检术式摘出肝脏，再剪断胆管与十二指肠连接部位，要注意观察断端有无虫体流出。b）将肝脏放搪瓷盘中。首先分离胆囊，单放在大平皿中，剪开囊壁，将胆汁用清水稀释，等自然沉淀后，检查沉淀物中有无虫体。检查肝脏时，先看肝表面有无病变结节，发现后用组织剪剪取，放在两块载玻片中间做压片检查。c）沿肝脏的大胆管及其分支剪开，如发现虫体取出放在盛有清水的平皿中。再沿着与胆管垂直的方向将肝组织切成数大块，注意断面有无虫体或病灶。用手压挤，看是否有虫体被压出。d）将肝块浸入盛有多量水的搪瓷盆中，用手撕成小块，再挤每个小肝块，洗净后取出。向搪瓷盆内再加些水进行反复水洗沉淀，检查沉淀物，用无齿镊挑出虫体。e）挑出的虫体用生理盐水洗净，再放在常温自来水中使虫体松弛。有些虫体的肠管内含有大量食物，可在生理盐水中放置过夜，待其食物消化或排出。DB54/T0562—20266B.2.3虫体固定将松弛了的虫体放在吸水纸上吸干水分，再放在清洁的载玻片上，载玻片两端铺上单层滤纸，盖上另一载玻片，稍加压力将虫体压薄后，用橡皮筋或线绳扎紧，投入70%酒精内固定。注意投入时，应以一端慢慢浸入，便于将两载玻片之间的空气赶出，固定时间应达24h以上。B.2.4虫体染色标本制作步骤（硼砂卡红染色）a）虫体染色原保存于70％酒精内的标本，可直接取出投入硼砂卡红（4％硼砂（Na2B4O7)溶液100mL，加入卡红染粉1g，加热使其溶解，再加入70％酒精100mL，放冷，过滤，滤液即为硼砂卡红染液）染色液中染色。保存于福尔马林液内的虫体标本，应先取出水洗1～2h，尔后循序通过305070％的酒精各0.5～1h，再投入染液中，在染液中过夜，使虫体染成深红色。b）虫体脱色自染液中取出虫体，放入1%酸酒精中褪色（1%酸酒精是以70％酒精99mL加浓盐酸1mL，根据情况也可以使用2%或3%的酸酒精），使颜色深浅分明，即虫体外层呈淡红色，内部构造呈深红色。c）虫体脱水将脱色好的虫体移入80%，95％和100%酒精（2次）中各0.5～1h。（如果脱水不充分制作出的标本会有一层雾状膜，原因就是浸泡时间不够或最后一步就酒精使用过程中已不是无水酒精，建议更换新的无水酒精）d）虫体透明将虫体先经1:1的100%酒精和二甲苯混合液中透明30min，再取出放入纯二甲苯中，待虫体下沉后即可取出封片。用二甲苯透明时，时间不宜过长，否则虫体变硬而脆，不便封片。最好随时透明，随时封片。e）虫体封片已透明的虫体，移至载玻片上，加适量滴加拿大树胶，加盖玻片封固，封固时切忌留有气泡在内，待干后放入标本盒内。B.2.5结果判定肝片吸虫和大片形吸虫的形态相似。成虫背腹扁平，呈叶片状，红褐色，雌雄同体，被覆皮棘。虫体前端有一突出的圆锥状头锥，头锥后方变宽，或形成肩部。口吸盘位于头锥前端的亚腹面，腹吸盘位于头锥基部稍后方。在口、腹吸盘之间有生殖孔。消化系统由咽、食道和两肠支组成，两侧的肠支一直延伸至虫体后端，并向内外两侧发出分支。生殖系统中，睾丸两个，呈高度分支，前后排列于虫体的中部。卵巢一个，较小，呈鹿角状，位于腹吸盘右后方，前睾丸的前方。子宫较短，盘曲在卵巢与腹吸盘之间，其内充满虫卵，开口于生殖孔。卵黄腺分布在虫体两侧，自头锥基部直达虫体后端。“中间型”片形吸虫成虫形态兼具两种片形吸虫的形态特点。肝片形吸虫与大片形吸虫的成虫形态主要鉴别要点见表B.1。表B.1肝片形吸虫与大片形吸虫成虫的形态鉴别B.3PCR检测DB54/T0562—20267B.3.1试剂粪便基因组DNA提取试剂盒，TaqPCRMix预混液（2X,含蓝染料），1.5%琼脂糖凝胶，50×TAE电泳缓冲液，DL2,000DNAMarker，核酸染料，片形吸虫阳性对照：中间型片形吸虫基因组DNA（10ng/μL片形吸虫阴性对照：非片形吸虫基因组DNA，空白对照：ddH2O，3条引物序列及配置的母液浓度见表B.2。表B.2引物序列及浓度5’-GATTGCACCGTTAGGTTAGC-3’5’-AAAGTTTCTATCCCGAACGAAG-3’5’-CGAAAATTATGGCATCAATGGG-3’B.3.2耗材离心管（15mL、50mL、1.5mL），药匙，称量纸，0.2mL薄壁PCR管，500mL量筒，500mL锥形瓶，枪），B.3.3仪器设备分析天平，PCR扩增仪，台式低温高速离心机，水平电泳仪，紫外凝胶成像系统，可调移液器（2），B.3.4实验步骤B.3.4.1牦牛粪便样品采集和处理a)采集待检测牦牛200mg左右的粪便，放入一个1.5mL离心管中，供PCR检查用，每头牦牛采的粪便样品不少于2管；b)采集的样品宜当天处理和检测，若不能当天检测，应暂时放于冰箱冷冻室-20℃保存，若需长期保存，应放置于-80℃超低温冰箱；c)使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便样品中的全基因组；d)提取好的全基因组置于4℃保存，若不能当天检测，应放于冰箱冷冻室-20℃保存。B.3.4.2PCR扩增反应体系：30μL，体系组成见表B.3。设置至少两个平行样品，设立阴性、阳性及空白提取对照。表B.3PCR扩增反应体系TaqPCRMix预混液（2X,3332PCR扩增条件：95℃预变性90s；95℃变性30s