抗流感药物靶点及其抑制剂

抗流感药物靶点及其抑制剂流感病毒是一种负螺旋单链RNA病毒，属于正黏病毒科。根据病毒核蛋白（nucleoproteins，NP）及基质蛋白（matrixproteins，M1）的抗原决定簇不同，流感病毒被分为三类：甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）。流感病毒颗粒结构大致相似（如图1），自内而外可分成核心、基质蛋白以及包膜三部分。病毒子通常呈圆形，长丝状。甲型和乙型流感病毒核酸有八个RNA节段，负责编码十种蛋白，包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、酸性蛋白（PA）、碱性蛋白1（PB1）、PB2、核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、离子通道蛋白（M2）、非结构蛋白（NS1）、核输出蛋白（NEP或NS2）。此外，大多数甲型流感病毒还有线粒体靶向的寡聚PB1-F2蛋白[1]，报道其与细胞凋亡以及病毒毒力有关。这些病毒RNA片段同NP结合并缠绕形成病毒核糖核蛋白体（vRNP），vRNP再与三聚的RNA聚合酶（PA、PB1、PB2）结合形成核糖核苷酸，负责RNA的复制和转录，这种结合模式确保了病毒RNA对于核酸酶保持敏感。丙型流感病毒只有七个RNA节段。基因组分节段的特点为流感病毒高频率基因重配提供了条件。病毒核心被外部的脂蛋白膜包围，在脂膜上有基质蛋白M1，其是病毒颗粒的主要蛋白，并通过化学键结合到vRNP。M2蛋白为具有离子通道活性的跨膜蛋白。乙型流感病毒缺乏M2蛋白，但是一种叫做BM2的蛋白可以起到类似M2蛋白作用。病毒最外层的包膜是包裹基质蛋白的磷脂双分子层，该膜来源于宿主细胞的细胞膜。膜表面具有两类非常重要的“刺突”，即两种糖蛋白，HA和NA。乙型流感病毒表面抗原相对简单，仅有一种HA和一种NA。对于甲型流感，根据病毒表面抗原HA及NA的不同，其可进一步细分为16个HA亚型（H1～H16）、9个NA亚型(N1～N9)[2]。图1甲型流感病毒结构模式图[3]三种类型流感病毒的宿主范围也是有区别的：甲型流感病毒能够感染哺乳类动物（人、猪、马等）和禽类，乙型流感病毒主要在人类和猪间传播，丙型流感病毒只在人类传播。另外，三种病毒的变异性及危害性从大到小依次是甲型、乙型、丙型，因此，对人类危害性最大的是甲型流感病毒。流感病毒感染及增殖过程图2流感病毒感染及增殖机制[4]如图2所示，流感病毒感染及增殖过程可大致分为黏附→内吞→融合→去包膜→入核→vRNA合成→蛋白合成→出核→组装→出芽→释放等阶段。首先，流感病毒包膜表面抗原HA识别并粘附到宿主细胞膜表面糖脂或糖蛋白上的唾液酸（sialicacid，SA）受体上，在粘附阶段，神经氨酸酶的唾液酸酶活性阻止HA与气管上皮细胞粘液层唾液酸的结合，从而强化病毒感染。接着，在受体介导的细胞内吞作用下，结合于宿主细胞表面的病毒进入宿主细胞并形成胞内体（endosome）。胞内体内的低pH条件启动HA“融合域”构象转化，导致病毒包膜与胞内体膜发生融合。与此同时，非糖基化基质蛋白M2离子通道被激活，形成进入细胞内膜的内向质子流，引发基质蛋白M1与vRNP的解离。然后，vRNP被转运进入细胞核，启动病毒遗传信息的复制和转录。RdRP以及NP对流感病毒的转录和复制具有重要意义。新合成的NP以及RNA聚合酶也被转入细胞核，与新和成的vRNA结合形成子代vRNP。在非结构性的核输出蛋白NEP/NS2及基质蛋白M1介导下，核内形成的子代vRNP被转运出宿主细胞核进入细胞浆，经装配形成成熟病毒颗粒。出芽后的新病毒颗粒仍然通过HA-SA键吸附于宿主细胞表面，经NA水解SA释放子代病毒，造成病毒的扩散与传播[5]。图5NP及HA的抑制剂（3）M2金刚烷胺、金刚乙胺为两个最具代表性的M2离子通道抑制剂，仅对甲型流感有效。这两个药物在临床上使用多年，耐药性问题突出。但是，这类药物能够促进外呼吸道扩张从而增加摄氧量，使得其在抗流感中仍然具有重要价值。耐药毒株氨基酸突变区结构的进一步阐明，为该类药物解决耐药问题提供了机遇[30,31]。同时，针对A/M2及BM2蛋白进化高度保守区HXXXW开发抑制剂，有望得到对甲型、乙型流感均有效的药物[32]。（4）HA流感病毒进入靶细胞的过程需要酸性环境的诱导：在胞内体低pH条件下，HA构象改变，前体蛋白HA0经蛋白酶剪切形成HA1和HA2，暴露出隐藏在蛋白中的融合域，即HA2的疏水N端。HA2的N端插入胞内体膜，每三分子的HA2即形成六螺旋束形“融合孔”，使得病毒膜与胞内体膜融合，病毒基因组通过融合孔进入细胞质。而HAl负责与宿主细胞膜表面的唾液酸受体结合，介导病毒通过胞饮方式进入细胞形成胞内体。靶向HA的抗流感化合物，根据机制不同可分为两类：一类是阻止HAl与宿主细胞膜表面SA受体结合的黏附抑制剂，这类以fludase（DAS181）为代表，其是一种新型唾液酸酶融合蛋白，目前处于Ⅱb期临床（美国）；另一类是阻断HA2介导的膜融合过程的融合抑制剂（抑制低pH诱导的HA构象转化），这是人们研究较早的一类抑制剂，包括1997年报道的以BMY-27709为代表的水杨酰胺类、1998年报道的以stachyflin为代表的司他弗林类化合物。该类化合物结构如图5所示。（5）NA1967年，一种神经氨酸酶类似物（DANA）被Meindl等合成，然而，其对NA的抑制活性并不显著，未能应用于抗流感治疗。1993年，伴随着神经氨酸酶晶体结构的解析[33]，vonItzstein[34]等对DANA进行了结构改造，除了环上取代基手性的调整，将DANA母核的4位羟基用碱性的胍基替代，得到了第一个临床使用的NAI——扎那米韦（zanamivir），其对NA的亲和力较DANA高100倍。但是，其口服生物利用度低，目前临床主要使用其吸入剂型。1997年，Kim等[35]用环己烯环替换扎那米韦的吡喃环，保证环上取代基空间伸展方向不变情况下，用疏水的3-戊氧基替代扎那米韦母环6位上连接的甘油基，将强碱性胍基用氨基替代，得到了奥司他韦（Oseltamivir）。该化合物于1999年被FDA批准用于临床。其能有效抑制流感病毒，同时，相对于扎那米韦，其口服生物利用度大大提升，固体口服给药途经增加了患者的依从性，是目前使用最广的NAI[35],这也导致了其耐药性积累速度最快。目前临床使用较少的NAI还有在日本应用的帕拉米韦（Peramivir）以及拉尼那米韦（Laninamivir），其中拉尼那米韦属于目前唯一长效NAI。对于奥司他韦耐受，又不能喷雾吸入扎那米韦的患者，可以考虑静脉注射帕拉米韦；现有研究表明对于奥司他韦耐药的毒株，拉尼那米韦依然有效，同时拉尼那米韦一天只需服用一次，使得患者依从性更好[36]。目前，从人、猪、禽类中分离的NAI耐药病毒株，包括了除N4亚型之外所有甲型流感病毒亚型以及乙型流感病毒。在流行的高致病性N1亚型（如H1N1、H5N1等）中，奥司他韦耐受问题最普遍，H274Y突变是导致其耐受的主要原因[37]。常见的N2亚型（主要为H3N2）耐药突变为E119V、R292K突变，但是H274Y突变并不能导致N2亚型对奥司他韦的耐药[37,38]。乙型流感病毒对扎那米韦的耐药与R152K突变有关[39]，对奥司他韦的耐药与R317K突变相关[40]。图6列出了奥司他韦与NA催化区（以N8为例）结合模式，我们将结合区分为4个亚位点。2002年，Hanessian[41]将奥司他韦母环5位氨基用乙烯基取代，成功得到了化合物H（Ki=45nM，本节所有讨论的NAI结构见图8），探讨了NA催化区2号亚位点发生疏水相互作用而非电荷相互作用的可能性。2012年，Bhatt[42]继续对该位点改造，通过羟基、甲氧基、乙氧基、烯丙基取代的对比，发现还是羟基取代（化合物I）的活性最高(IC50=0.32µM)。通过Hanessian和Bhatt的工作，我们发现NA催化区2号亚位点的氢键相互作用对于NAI的活性非常重要。图6奥司他韦与N8催化区结合模式图在系统分类中，甲型流感病毒NA可分为两大类，Ⅰ类（Group1）包括N1、N4、N5、N8四种亚型，Ⅱ类（Group2）包括N2、N3、N6、N7、N9五种亚型。2006年，随着Russell[43]等对N1、N4、N8的结构解析，人们发现：Ⅰ类NA催化区2号亚位点附近连接着开放的“150腔”；然而，Ⅱ类NA中“150-LOOP”处于封闭构象，使得Ⅱ类NA活性结合区旁边不存在该“150腔”，如图7所示。“150腔”的发现为设计选择性的Ⅰ类NA抑制剂、解决病毒耐药问题提供了新思路。Pinto课题组[44]以奥司他韦为先导化合物，用带羟基侧链的三氮唑替换奥司他韦骨架5位上的氨基，得到了以化合物J为代表的Ⅰ类选择性的NAI（Ki=1.5ⅹ10-9～4.6ⅹ10-10M）。2013年，Kerry[45]通过化合物的共晶体结构，验证了化合物J同时占据NA催化区和“150腔”，是一种双位点抑制剂。2014年，在对奥司他韦母环5位氨基进行异硫脲取代时，Pinto课题组意外得到了螺环化合物K（如图8），其对HK1流感病毒的有效浓度为10-6～10-7M。N8与化合物K的共结晶结构表明，化合物上螺环在催化区偏向150-LOOP，有利于“150腔”的形成，这为开发双位点抑制剂提供了一种思路[46]。图7[44]A.奥司他韦与N1结合模式；B.奥司他韦与N9结合模式为了克服不利的药动学性质引发的耐药问题，Schade[47]也对奥司他韦母环5位氨基的取代进行了探讨。利用生物电子等排体和前药的设计原理，成功得到了药动学性质和口服生物利用度比较理想，同时对奥司他韦耐药的H1N1突变株有效的化合物L，其活化代谢物抗H1N1的IC50=14.5nM。除了对奥司他韦母环5位氨基的结构改造，Cheng[48]用磷酸基和磷酸酯将母环1位上羧基替换，成功得到了化合物M，其能够在纳摩水平甚至皮摩水平抑制多种流感病毒复制，包括H274Y耐药毒株。开发抗流感病毒不可逆抑制剂也是解决当前耐药问题的一种思路。2013年，Kim[49]通过对神经氨酸酶催化过渡态的研究，设计合成了以化合物N为代表的一系列α，β-二氟取代的化合物。这些化合物能够与神经氨酸酶催化区Tyr406形成短暂的共价中间体，广谱强效抑制流感病毒，包括扎那米韦和奥司他韦耐药毒株。在动物实验中，药效与上市药物相当或者优于上市药物。图8上市及最新报道的NAI总的来说，对于NAI日益严重的耐药问题，人们将大量关注集中于奥司他韦母核5位上的氨基的改构，母核1位羧基改构及不可逆抑制剂设计也有零星的探讨；NA催化区2号亚位点旁边“150腔”的发现与结构解析，也为人们解决NAI的耐药问题提供了新思路。参考文献[1]ChanturiyaA.N.,BasanezG.,SchubertU.,etal.PB1-F2,aninfluenzaAvirus-encodedproapoptoticmitochondrialprotein,createsvariablysizedporesinplanarlipidmembranes[J].JVirol,2004,78(12):6304-6312.[2]FouchierR.A.,MunsterV.,WallenstenA.,etal.CharacterizationofanovelinfluenzaAvirushemagglutininsubtype(H16)obtainedfromblack-headedgulls[J].JVirol,2005,79(5):2814-2822.[3]NelsonM.I.andHolmesE.C.Theevolutionofepidemicinfluenza[J].NatRevGenet,2007,8(3):196-205.[4]vonItzsteinM.Thewaragainstinfluenza:discoveryanddevelopmentofsialidaseinhibitors[J].NatRevDrugDiscov,2007,6(12):967-974.[5]GongJ.,FangH.,LiM.,etal.Potentialtargetsandtheirrelevantinhibitorsinanti-influenzafields[J].Currentmedicinalchemistry,2009,16(28):3716-3739.[6]Stieneke-GroberA.,VeyM.,AnglikerH.,etal.Influenzavirushemagglutininwithmultibasiccleavagesiteisactivatedbyfurin,asubtilisin-likeendoprotease[J].Emboj,1992,11(7):2407-2414.[7]HorimotoT.,NakayamaK.,SmeekensS.P.,etal.Proprotein-processingendoproteasesPC6andfurinbothactivatehemagglutininofvirulentavianinfluenzaviruses[J].JVirol,1994,68(9):6074-6078.[8]HattaM.andKawaokaY.ThecontinuedpandemicthreatposedbyavianinfluenzavirusesinHongKong[J].TrendsMicrobiol,2002,10(7):340-344.[9]HorimotoT.andKawaokaY.PandemicthreatposedbyavianinfluenzaAviruses[J].ClinMicrobiolRev,2001,14(1):129-149.[10]OlsonA.C.,RosenblumE.andKuchtaR.D.RegulationofinfluenzaRNApolymeraseactivityandtheswitchbetweenreplicationandtranscriptionbytheconcentrationsofthevRNA5'end,thecapsource,andthepolymerase[J].Biochemistry,2010,49(47):10208-10215.[11]SuC.Y.,ChengT.J.,LinM.I.,etal.High-throughputidentificationofcompoundstargetinginfluenzaRNA-dependentRNApolymeraseactivity[J].ProcNatlAcadSciUSA,2010,107(45):19151-19156.[12]GuilligayD.,TarendeauF.,Resa-InfanteP.,etal.ThestructuralbasisforcapbindingbyinfluenzaviruspolymerasesubunitPB2[J].NatStructMolBiol,2008,15(5):500-506.[13]TarendeauF.,BoudetJ.,GuilligayD.,etal.StructureandnuclearimportfunctionoftheC-terminaldomainofinfluenzaviruspolymerasePB2subunit[J].NatStructMolBiol,2007,14(3):229-233.[14]Bradel-TrethewayB.G.,KelleyZ.,Chakraborty-SettS.,etal.ThehumanH5N1influenzaAviruspolymerasecomplexisactiveinvitrooverabroadrangeoftemperatures,incontrasttotheWSNcomplex,andthispropertycanbeattributedtothePB2subunit[J].JGenVirol,2008,89(Pt12):2923-2932.[15]KuzuharaT.,KiseD.,YoshidaH.,etal.StructuralbasisoftheinfluenzaAvirusRNApolymerasePB2RNA-bindingdomaincontainingthepathogenicity-determinantlysine627residue[J].JBiolChem,2009,284(11):6855-6860.[16]PautusS.,SehrP.,LewisJ.,etal.New7-MethylguanineDerivativesTargetingtheInfluenzaPolymerasePB2Cap-BindingDomain[J].JMedChem,2013,56(21):8915-8930.[17]YuanP.,BartlamM.,LouZ.,etal.CrystalstructureofanavianinfluenzapolymerasePA(N)revealsanendonucleaseactivesite[J].Nature,2009,458(7240):909-913.[18]DiasA.,BouvierD.,CrepinT.,etal.Thecap-snatchingendonucleaseofinfluenzaviruspolymeraseresidesinthePAsubunit[J].Nature,2009,458(7240):914-918.[19]GuuT.S.,DongL.,Wittung-StafshedeP.,etal.MappingthedomainstructureoftheinfluenzaAviruspolymeraseacidicprotein(PA)anditsinteractionwiththebasicprotein1(PB1)subunit[J].Virology,2008,379(1):135-142.[20]MaierH.J.,KashiwagiT.,HaraK.,etal.DifferentialroleoftheinfluenzaAviruspolymerasePAsubunitforvRNAandcRNApromoterbinding[J].Virology,2008,370(1):194-204.[21]LiuY.,LouZ.,BartlamM.,etal.Structure-functionstudiesoftheinfluenzavirusRNApolymerasePAsubunit[J].SciChinaCLifeSci,2009,52(5):450-458.[22]HeX.,ZhouJ.,BartlamM.,etal.CrystalstructureofthepolymerasePA(C)-PB1(N)complexfromanavianinfluenzaH5N1virus[J].Nature,2008,454(7208):1123-1126.[23]MuratoreG.,GoracciL.,MercorelliB.,etal.SmallmoleculeinhibitorsofinfluenzaAandBvirusesthatactbydisruptingsubunitinteractionsoftheviralpolymerase[J].ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(16):6247-6252.[24]MassariS.,NannettiG.,GoracciL.,etal.StructuralInvestigationofCycloheptathiophene-3-carboxamideDerivativesTargetingInfluenzaVirusPolymeraseAssembly[J].JMedChem,2013,56(24):10118-10131.[25]PaganoM.,CastagnoloD.,BernardiniM.,etal.TheFightagainsttheInfluenzaAVirusH1N1:Synthesis,MolecularModeling,andBiologicalEvaluationofBenzofurazanDerivativesasViralRNAPolymeraseInhibitors[J].ChemMedChem,2014,9(1):129-150.[26]BoltzD.A.,AldridgeJrJ.R.,WebsterR.G.,etal.Drugsindevelopmentforinfluenza[J].Drugs,2010,70(11):1349-1362.[27]YeQ.,KrugR.M.andTaoY.J.ThemechanismbywhichinfluenzaAvirusnucleoproteinformsoligomersandbindsRNA[J].Nature,2006,444(7122):1078-1082.[28]KaoR.Y.,YangD.,LauL.S.,etal.IdentificationofinfluenzaAnucleoproteinasanantiviraltarget[J].NatBiotechnol,2010,28(6):600-605.[29]ChengH.,WanJ.,LinM.-I.,etal.Design,Synthesis,andinVitroBiologicalEvaluationof1H-1,2,3-Triazole-4-carboxamideDerivativesasNewAnti-influenzaAAgentsTargetingVirusNucleoprotein[J].JournalofMedicinalChemistry,2012,55(5):2144-2153.[30]DuQ.S.,HuangR.B.,WangS.Q.,etal.DesigninginhibitorsofM2protonchannelagainstH1N1swineinfluenzavirus[J].PLoSOne,2010,5(2):e9388.[31]HongM.andDeGradoW.F.StructuralbasisforprotonconductionandinhibitionbytheinfluenzaM2protein[J].ProteinSci,2012,21(11):1620-1633.[32]ZhaoX.,JieY.,RosenbergM.R.,etal.Designandsynthesisofpinanaminederivativesasanti-influenzaAM2ionchannelinhibitors[J].AntiviralRes,2012,96(2):91-99.[33]VargheseJ.N.,LaverW.G.andColmanP.M.Structureoftheinfluenzavirusglycoproteinantigenneuraminidaseat2.9Aresolution[J].Nature,1983,303(5912):35-40.[34]vonItzsteinM.,WuW.Y.,KokG.B.,etal.Rationaldesignofpotentsialidase-basedinhibitorsofinfluenzavirusreplication[J].Nature,1993,363(6428):418-423.[35]KimC.U.,LewW.,WilliamsM.A.,etal.Influenzaneuraminidaseinhibitorspossessinganovelhydrophobicinteractionintheenzymeactivesite:design,synthesis,andstructuralanalysisofcarbocyclicsialicacidanalogueswithpotentanti-influenzaactivity[J].JAmChemSoc,1997,119(4):681-690.[36]IkematsuH.andKawaiN.Laninamiviroctanoate:anewlong-actingneuraminidaseinhibitorforthetreatmentofinfluenza[J].ExpertRevAntiInfectTher,2011,9(10):851-857.[37]NguyenH.T.,FryA.M.andGubarevaL.V.Neuraminidaseinhibitorresistanceininfluenzavirusesandlaboratorytestingmethods[J].AntivirTher,2012,17(1PtB):159-173.[38]AbedY.,BazM.andBoivinG.ImpactofneuraminidasemutationsconferringinfluenzaresistancetoneuraminidaseinhibitorsintheN1andN2geneticbackgrounds[J].AntivirTher,2006,11(8):971-976.[39]GubarevaL.V.,MatrosovichM.N.,BrennerM.K.,etal.EvidenceforzanamivirresistanceinanimmunocompromisedchildinfectedwithinfluenzaBvirus[J].JInfectDis,1998,178(5):1257-1262.[40]SheuT.G.,DeydeV.M.,Okomo-AdhiamboM.,etal.SurveillanceforneuraminidaseinhibitorresistanceamonghumaninfluenzaAandBvirusescirculatingworldwidefrom2004to2008[J].AntimicrobAgentsChemother,2008,52(9):3284-3292.[41]HanessianS.,WangJ.,MontgomeryD.,etal.Design,synthesis,andneuraminidaseinhibitoryactivityofGS-4071analoguesthatutilizeanovelhydrophobicparadigm[J].BioorgMedChemLett,2002,12(23):3425-3429.[42]BhattB.,BöhmR.,KerryP.S.,etal.ExploringtheInteractionsofUnsaturatedGlucuronideswithInfluenzaVirusSialidase[J].JournalofMe