生化药物分析及进展

生化药物分析及新进展杨化新标准化研究中心中国药品生物制品检定所

内容提纲一、生化药品概述二、生化药物分析与质控特点三、各类生化药物分析概况四、生化药物分析研究热点一、生化药品概述《中华人民共和国药品管理法》（1984年9月20日第五届全国人大常委会第7次会议通过。2001年2月28日第九届全国人大常委会第20次会议修订，2001年12月1日起施行。）第十章第一百零二条药品，是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应症或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药材、中药饮片、中成药。化学原料药及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。辅料，是指生产药品和调配处方时所用的赋性剂和附加剂。第二章第十条

药品必须按照国家药品标准和国务院药品监督管理部门批准的生产工艺进行生产，生产记录必须完整准确。第二章第十一条生产药品所用的原料、辅料，必须符合药用要求。第二章第十二条药品生产企业必须对其生产的药品进行质量检验；不符合国家药品标准的，不得出厂。生化药品的定义与分类

一般系指从动、植物及微生物中提取、分离、纯化，或用生物化学半合成或用现代技术制得的具有生物化学活性的一类用于临床治疗的药物。氨基酸及其衍生物、肽与蛋白及其激素、酶与辅酶、核酸与核苷酸及其衍生物、多糖、脂类；

利用动物的脏器或其他组织、器官，经过粗加工，未完全分离精制，其有效成分尚未完全搞清楚，这一类混合的多组分生化药物在临床上作为辅助治疗药物，确有疗效，因毒副作用低，易为人体吸收等特点。尤其对心脑血管病、风湿病、肿瘤及病毒疾患等有其独特的治疗效果，长期被医生和患者所接受。《药品注册管理办法》(修订)

（国家食品药品监督管理局令第28号，于2007年7月10日正式公布，并将于2007年10月1日起施行。）第二章第二十九条申请人获得药品批准文号后，应当按照国家食品药品监督管理局批准的生产工艺生产。药品监督管理部门根据批准的生产工艺和质量标准对申请人的生产情况进行监督检查。第十一章第一节第一百三十六条国家药品标准，是指国家食品药品监督管理局颁布的《中华人民共和国药典》、药品注册标准和其他药品标准，其内容包括质量指标、检验方法以及生产工艺等技术要求。药品注册标准，是指国家食品药品监督管理局批准给申请人特定药品的标准，生产该药品的药品生产企业必须执行该注册标准。药品注册标准不得低于中国药典的规定。相关指导原则（SFDA新药审评中心）化学药物原料药制备和结构确证研究技术指导原则化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则生物组织提取制品和真核细胞表达制品病毒安全性评价技术评审一般原则化学药物稳定性研究技术指导原则化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则生物制品质量控制分析方法验证技术评审一般原则治疗用生物制品非临床安全性评价技术评审一般原则二、生化药物分析与质控特点—动、植物组织、微生物提取单组分多组分—微生物发酵与提纯单组分多组分—化学合成与提纯单组分—基因工程菌或细胞培养与提纯单组分(重组DNA技术)原料来源：动、植物组织和微生物、哺乳动物细胞质控要求：若要保证终产品质量安全有效，必须对原材料、培养过程和纯化工艺过程的中间体、最终产品进行全面的质量分析与控制。（一）单一成分多组分混合物1．肽类混合物：科博肽注射液及粉针、注射用纯化胸腺活性多肽、缩宫素注射液（猪牛脑垂体后叶，含升压素）2．蛋白质类混合物：人尿、蛇毒、蜂毒提取物、口服水解蛋白、口服水解蛋白粉（低苯丙氨酸）、水解蛋白口服溶液、蜂毒注射液、琥珀酰明胶注射液、细胞色素C注射液（猪或牛心，没控制纯度，细胞代谢改善药）、注射用细胞色素C、注射用胰蛋白酶（猪、牛、羊胰）、注射用糜蛋白酶（猪、牛胰）、注射用玻璃酸酶（哺乳动物睾丸，水解粘多糖）、注射用门冬酰氨酶、注射用尿激酶（新鲜人尿，高分子UK大于90%）、注射用绒促性素(孕妇女尿，hCG)、注射用尿促性素（绝经妇女尿，hMG=FSH,LH）、注射用抑肽酶（牛胰、牛肺）、硫酸鱼精蛋白注射液（鱼新鲜成熟精子，抗肝素药）3．多糖类混合物：低分子肝素注射液、肝素钠注射液（硫酸氨基葡聚糖钠盐）、右旋糖苷40氯化钠注射液（葡萄糖聚合物）、右旋糖苷20葡萄糖注射液、右旋糖苷铁注射液、右旋糖苷20氯化钠注射液、右旋糖苷70葡萄糖注射液、右旋糖苷70氯化钠注射液、右旋糖苷40葡萄糖注射液、右旋糖苷（蔗糖经肠膜状明串珠菌L-M-1226菌株发酵产生高分子葡萄糖聚合物，重均分子量：2、4、7万）4．脂类混合物：脂肪乳注射液、多烯磷脂酰胆碱及其胶囊、海狗油W-3不饱和脂肪酸及胶丸、卵磷脂及其片剂（卵磷脂含有磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺以及磷）、5．核酸与多核苷酸类混合物：聚脱氧核苷酸注射液、核糖核酸I及其粉针、核糖核酸II及其粉针、核糖核酸III及其粉针、脱氧核苷酸钠及其粉针、片剂和注射液、注射用抗肿瘤免疫核糖核酸、注射用抗乙肝免疫核糖核酸、转移因子免疫核糖核酸等。（二）多成分混合物1．氨基酸与肽类混合物：脑蛋白水解物(注射液，注射用粉针)、芦丁脑蛋白水解物注射液、猪心提取物原液及其注射液、小牛血去蛋白提取物注射液及滴眼液、猪血去蛋白提取物原液及其注射液、氨肽素、氨碘肽滴眼液、眼氨肽注射液和滴眼液、肝水解肽注射液、肝浸膏及其片和复方胶囊、骨肽注射液、鹿瓜多肽注射液、促肝细胞生长素及其注射用粉针、小牛血去蛋白提取物注射液及其肠溶片（爱维治）2．氨基酸、核苷酸与肽类混合物：小牛脾提取物溶液及其注射液、牛胎肝提取物及其复方片剂、脑苷肌肽注射液、肌氨肽苷注射液、注射用心肌肽素3．肽类与其他成分混合物：胸腺肽溶液及其注射液、注射用胸腺肽、胸腺肽氯化钠注射液、甲状腺素粉及其片剂，垂体后叶粉及其注射液、尿多酸肽注射液脏器提取的多组分生化药物质量控制1）研究建立原材料的质量标准，包括动物的种属、健康状况、饲养环境（封闭饲养）、年龄、采集时间和采集方法等。2）进行动物源性病毒的灭活和验证，研究建立原液（或半成品）的质量标准。3）制订成品的质量标准。只有严格控制原材料的来源和工艺过程，再加上原液和/或终产品的质量标准，才有可能较好的控制产品的质量，保证临床应用的安全和有效。基因工程药物质量控制生产过程有其固有的易变性—生物材料—生物学过程：发酵、细胞培养、分离、纯化目的产物—化学成分多肽和蛋白质等生物大分子—生物活性容易受酸、碱、高温甚至是常温的影响—化学结构比较复杂—成品特点比活性高、含量较低，有些须加蛋白做稳定剂无法在成品中对制品进行全面的质量检定，为有效地控制产品质量，必须对原液进行检定。三、各类生化药物分析概况（一）氨基酸及其衍生物鉴别：茚三酮显色法：因所有的氨基酸均能与茚三酮显蓝紫色。红外吸收光谱：与中国药典的标准图谱比较定性。紫外吸收图谱：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。高效液相色谱法：比较供试品与对照品的保留时间是否一致特殊杂质检查：其他氨基酸：薄层色谱法—限量热原—细菌内毒素：GlyAlaMetValIleLeuTheSerTyrPhePro乙酸赖氨酸盐酸赖氨酸比色法测定抗氧剂：亚硫酸盐：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠

亚硫酸盐在酸性条件下与含甲醛的碱性品红溶液发生反应，生成的紫红色络合物在578nm波长处有最大吸收。含量测定：原料药：非水酸碱滴定法溶剂—冰醋酸；标准滴定液—高氯酸确定终点—电位法或指示剂法复方氨基酸制剂：高效液相色谱法衍生试剂：异硫氰酸苯酯（PITC）；邻苯二甲醛（OPA）、9-芴甲氧基羰酰氯（Fmoc）；6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)；2,4-二硝基氟苯(DNFB)；茚三酮（Ninhydrin）；氨基酸分析方法柱前衍生法：①PITC衍生法②OPA-FMOC衍生法③AQC衍生法④DNFB衍生法柱后衍生法:①茚三酮衍生检测法②OPA衍生检测法直接分析法：①电化学检测法②蒸发光散射检测法方法及灵敏度的比较：1柱后茚三酮衍生的自动分析仪法（50-100ng）2柱后OPA衍生的自动分析仪法（15ng）3柱前异硫氰酸苯酯衍生法（100-150ng）4柱前OPA衍生法（3ng）5柱前AQC衍生法（10ng）6柱前2.4-二硝基氟苯衍生法（100ng）7DABS-Cl衍生法（10ng）8柱前FMOC-Cl法（2ng）（二）核酸类药物鉴别：采用显色或沉淀反应鉴别碱基、核糖、磷酸的存在。三磷酸腺苷二钠：磷酸根；胞磷胆碱钠：核糖；肌苷：次黄嘌呤UV法：核酸类混合物：核酸水解物溶液、核糖核酸I(猪肝)溶液、核糖核酸II(牛胰)溶液、核糖核酸III（猪脾）溶液的最大吸收波长均为260±2nm.。辅酶I：由D-呋喃核糖吡啶氢氧化物与二磷酸腺苷形成的钠盐。其乙醇Tris溶液在260nm.波长处有最大吸收，加入醇脱氢酶溶液后，该溶液的最大吸收波长变为340nm。RP-HPLC法：三磷酸腺苷二钠混合物：以含有四丁基溴化铵氢氧化钠甲醇的溶液为流动相，柱温为35℃，检测波长259nm。出峰顺序依次为一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷。

有关物质检查：主要是一些降解产物。采用RP-HPLC法检测控制。其他有关物质常采用TLC法检测。次黄嘌呤：肌苷的降解产物，鸟嘌呤：阿昔洛韦的降解产物。胞磷胆碱钠：RP-HPLC主成分自身对照法检测控制，泛昔洛韦：检测波长为221nm。利巴韦林：氢型阳离子HPLC法。核糖核酸I：脱氧核糖核酸，采用对照品限值比色法测定。含量测定：采用UV法、RP-HPLC法；对照品外标法（三）多糖类药物鉴别：显色反应、药理活性性状检查：溶解度、比旋度和粘度的测定，多糖的分子量及分子量分布：只是代表相似链长的平均分布，采用凝胶色谱法测定。色谱柱：与供试品分子大小相适应；流动相：通常为水或缓冲液，其pH值不应超过填充剂的耐受范围，可加入适量的有机溶剂，但浓度不应超过20%；流速：以0.5-1.0ml/min为宜；检测器：示差折光检测器。对照品：分子量范围及颗粒形状应与供试品匹配。数据处理：经适宜的GPC软件求得相关参数。多糖的含量测定：直接测定多糖本身：如高效液相色谱法和酶法，这需要多糖的纯品和特定的酶。利用组成多糖的单糖缩合反应：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法；原理：多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量，单糖对照品：尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖，这样测得的值较准确。需要强调的是，这种方法所测定的是总糖的含量而不是总多糖的含量，因此首先应测定样品中游离的单糖含量，然后将总糖的含量减去游离单糖的含量，即为总多糖的含量。3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）：它是在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可消除还原性杂质的干扰。（四）脂类药物鉴别：多采用化学鉴别试验，也有采用TLC、HPLC和GC法。卵磷脂（含有磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺以及磷）：化学反应鉴别；多烯酸乙酯、角鲨烯：GC法比较供试品与对照品的保留时间；大豆磷脂粉（含有磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺）：TLC法比较供试品与对照品的主斑点颜色与位置是否相同。前列地尔：比较供试品与对照品的RP-HPLC保留时间、IR光谱是否一致。脂类药物对照品的结构确认：GC-MS、UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR进行分析。特有项目检查：性状呈油状液体时，常需要进行溶解性、酸值、碘值、折光率、相对密度、过氧化值等项目的分析。水分和挥发物、炽灼残渣、丙酮不溶物、乙醚不溶物、乙醇可溶物、不皂化物等，还有有机溶剂残留。有关物质：如溶血磷脂酰胆碱。含量测定：气相色谱法、定氮、定磷，HPLC外标法。多烯磷脂酰胆碱：采用丙二醇键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的正己烷、异丙醇、冰醋酸、三乙胺为流动相；用蒸发光散射检测器，柱温超过50℃。梯度洗脱。（五）肽、蛋白、酶类药物

肽、蛋白、酶的常用分析方法鉴别纯度检查含量测定活力测定RP-HPLCHPSECIEF肽图HPSECSDSRP-HPLCRP-HPLCHPSEC体内体外底物：天然合成含量与活性相关性肽图谱测定与分析:裂解-分离-检测裂解：化学法-溴化氢（Met羧基端，酸性条件）；5，5-二硝基苯甲酸（Cys,pH8.0）；酶法--专一性蛋白水解酶

胰蛋白酶：Arg和Lys羧基端，对Arg-Pro,Lys-Pro健无作用；胰凝乳蛋白酶：芳香族aa羧基端；内肽酶：Lys羧基端；

V8蛋白酶：Asp和Glu羧基端（PBS，pH8.0）;Asp-X（乙酸BSpH4.0）

梭菌蛋白酶：Arg羧基端；凝血酶：专一裂解Arg-Gly键；

分离：HPLC：C18C8HPCE：胶束，聚焦，区带，凝胶模式，SDS：15%胶浓度，Tricine-三甲基甘氨酸检测：紫外检测器214nm肽图谱质谱检测器肽段分子量质量肽图

肽、蛋白类药物理化性质分析分子量测定一般采用还原型SDS法测定，测定误差约为10%；对小分子蛋白和多肽如重组人EGF用该法测定误差更大,应采用质谱法进行分析。采用凝胶过滤（分子筛）法测定蛋白分子量，但由于其误差比SDS大，目前已很少应用。等电点测定不易用银染或考马斯亮蓝染色的蛋白质制品，可用毛细管电泳（CE）进行分析，该法具有简便，快速，灵敏度和分辩率高等特点，但仪器价格昂贵。抗原性分析免疫印迹法(Westernb1ot)、点免疫法、免疫电泳法、免疫扩散法、抗体中和活性抑制法比旋度是肽类原料药质控的重要项目，通过测定比旋度来区别和检查肽类原料药的纯杂程度。肽的比旋度与所用溶剂剂及其溶液的浓度密切相关。醋酸或酸根离子测定醋酸含量测定方法有RP-HPLC法、气相色谱法酸根离子含量测定方法主要采用离子色谱法。含量测定Lowry法HPLC法纯度分析非还原型SDS法SEC-HPLCRP-HPLCIC-HPLC微量杂质和外源污染物检测宿主细胞的残余蛋白双抗体夹心ELISA宿主细胞DNA测定荧光分析鼠原型IgG含量外源污染物分析病毒支原体其它杂质分析蛋白A、小牛血清、残余抗生素测定蛋白质和肽中氨基酸的水解方法含有苯酚的酸水解法：即含有0.1%-1%苯酚的6mol/L盐酸溶液，加入苯酚是为了防止酪氨酸的卤化。巯基乙酸（TGA）水解法：可防止色氨酸的氧化。三氟乙酸碘苯（BTI）水解法：天冬酰胺和谷氨酰胺。过甲酸氧化法：使半胱氨酸转变为磺基丙氨酸。体外细胞培养测定法能促进某种细胞生长EGF(3T3细胞)bFGF(3T3细胞)hPTH

(UMR-106细胞)促肝细胞生长素(SSMMC-7721细胞)为某种细胞株生长依赖G-CSF（NFS-60细胞）GM-CSF(TF1细胞)IL-2(CTLL-2细胞)IL-11(T10细胞)IL-3和GM-IL-3融合蛋白(Mo7E,TF-1细胞)IL-6(B9-11,7TD1细胞)杀伤细胞作用TNF（L929细胞）体内测定法FSH采用幼大鼠卵巢增重法hLH幼大鼠精囊增重法hCG幼小鼠子宫增重法Insulin比较标准品与供试品引起小鼠血糖下降的作用hGH幼龄去垂体大鼠体重增加和胫骨骨骺板宽度增加的程度酶类药物的鉴别：酶的化学本质为蛋白质，而且具有专一性作用于合成底物或天然底物的特性。SDS法测定分子量、鉴别对照品与供试品的迁移率是否一致，如降纤酶。SE-HPLC和RP-HPLC法鉴别对照品与供试品的保留时间是否一致，如门冬酰胺酶。凝块裂解法鉴别溶栓作用，如一些溶栓酶；利用酶作用于合成的生色底物产生颜色来鉴别，如糜蛋白酶、胰蛋白酶。抑肽酶是蛋白酶抑制剂，它不裂解胰蛋白酶的底物（对甲苯磺酰L-精氨酸甲酯盐酸盐），故不产生颜色反应。酶活性测定：一般以其生物学作用为基础，选择特定的底物，在一定的条件下测定。酶活性测定：纤溶酶原激活剂（UK、SK、tPA）——凝块裂解法这些酶能激活纤维蛋白溶酶原，使其转化为纤溶酶，纤溶酶可将蛋白块（由纤维蛋白在凝血酶的作用下形成）水解成可溶性的小分子多肽。当凝块溶解时，凝块中的气泡均上升，记录气泡上升的时间，将标准品的时间与浓度单位取双对数后，再进行线性回归，将样品的时间取对数，带入标准曲线，即可查得样品的效价单位。葡萄糖脑苷脂酶——合成底物法利用GCR底物类似物p-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷，经r-GCR降解后产生生色基团p-硝基苯基（pNP），在波长400nm处有吸收，通过一定反应时间内该吸收度的变化可计算出酶活性。通常定义37℃下1分钟内水解1μmol底物所需的r-GCR量为一个活性单位（1U）。精氨酸酶：精氨酸经精氨酸酶、尿素酶两步作用产生氨，利用

-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、

-NADPH吸收产生的氨，使得

-NADPH浓度降低，然后测定

-NADPH在340nm处吸光度的变化，计算精氨酸酶活性。尿酸氧化酶：尿酸在尿酸氧化酶的作用下分解成为尿囊素，尿酸最大紫外吸收波长为292nm，而尿囊素为224nm，在一定范围内尿酸在292nm的吸收值与其浓度成正比，可用分光光度法进行尿酸的定量测定。酶活性（EAU）单位定义：30℃，pH8.9，每分钟将1μmol尿酸氧化为尿囊素所需的酶量。葡萄糖脑苷脂酶（伊米苷酶）：伊米苷酶可水解合成底物p-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷（pNP-Glc），产生的生色基团p-硝基酚在碱性pH条件下，其浓度可通过400nm波长下的光吸收度来测定。1个活性单位