医疗机构核酸检测操作规范汇编

医疗机构核酸检测操作规范汇编核酸检测作为病原体筛查与诊断的核心技术，其操作规范性直接影响检测结果准确性与医疗安全。为指导医疗机构规范开展核酸检测工作，结合临床实践与行业标准，特编制本操作规范汇编。一、检测前准备规范（一）物资与试剂准备开展核酸检测前，需全面核查物资与试剂的有效性、完整性：采样物资：一次性采样拭子（独立包装、无破损）、病毒采样管（含保存液，确认无渗漏、保存液量达标）、采样管架、记号笔等；检测试剂：核酸提取试剂（检查有效期、批号一致性）、扩增试剂（引物、探针、酶等组分无降解、无沉淀）；防护用品：医用防护口罩（N95及以上）、医用防护服、护目镜/面屏、一次性医用手套（双层）、鞋套等，确保防护用品在有效期内且无破损。（二）环境与设备准备实验室分区：严格划分清洁区（试剂准备）、半污染区（样本处理）、污染区（扩增与产物分析），各区设置物理隔离，避免交叉污染；设备校准：核酸提取仪、实时荧光定量PCR仪需定期校准（至少每季度1次），校准记录存档；检测前检查设备运行状态（如温度准确性、转子转速），确认无故障报警；环境消毒：检测前30分钟，用含氯消毒剂（500mg/L）或紫外线（照射≥30分钟）对实验室空气、工作台面消毒；检测后再次消毒，确保无核酸残留（可采用核酸酶处理或高温灭活）。二、样本采集操作规范（一）咽拭子采集1.被采集者准备：取坐位或仰卧位，头部后仰，张口发“啊”音，充分暴露咽喉部；避免采集前30分钟饮水、进食、吸烟或嚼口香糖。2.采集者操作：手持采样拭子，快速擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（每侧至少3次），动作轻柔避免呕吐反射；采样后立即将拭子头浸入病毒保存液，折断拭子杆（或旋紧管盖），确保拭子头完全浸没，管盖旋紧无渗漏。（二）鼻拭子采集1.体位与消毒：被采集者头部保持中立位，采集者用棉签蘸取75%乙醇消毒鼻孔（可选步骤，视场景而定）；2.采样操作：将采样拭子沿鼻腔下鼻道缓缓插入（成人约2-3cm，儿童酌减），贴鼻腔壁旋转3圈（约10秒），然后以同样方式采集另一侧鼻腔；采样后立即将拭子浸入保存液，旋紧管盖。（三）采集过程感染控制每采集1人，更换外层手套（或用速干手消毒剂消毒手套），避免交叉污染；采样台配备消毒湿巾，采集后立即擦拭台面；疑似/确诊病例采样时，采集者需加强防护（如加穿防水围裙、戴双层手套），采样后对采样区域进行终末消毒。三、样本转运与接收规范（一）转运包装要求内层包装：将样本管放入密封袋（生物安全袋），袋内放置吸水纸（防止泄漏），填写样本信息单（含样本编号、采集时间、受检者信息、采集者姓名）；中层包装：密封袋放入带盖转运箱（或保温箱），箱内放置冰排（维持2-8℃，若需长期转运可采用-20℃冰排）；外层包装：转运箱外贴“生物样本”标识，注明“感染性物质”，并填写转运单（含接收单位、联系人、电话）。（二）转运与接收流程转运时限：常温下（25℃以下）样本应在4小时内送达实验室；若无法及时送达，需置于2-8℃保存，保存时间不超过24小时；接收核查：实验室接收时，核对样本数量、信息完整性、包装密封性；若发现样本管泄漏、保存液浑浊或样本管破裂，立即将污染物品放入生物安全柜，用含氯消毒剂（2000mg/L）消毒，按感染性废物处理；异常处理：对信息不全、包装破损的样本，联系采集点重新采集；对超过保存时限的样本，评估后决定是否重新采集。四、核酸提取操作规范（一）试剂与样本处理试剂平衡：提取试剂从冰箱取出后，室温平衡15-30分钟，避免反复冻融（提取酶等组分需避光保存）；样本预处理：样本管室温静置10分钟（或4000rpm离心2分钟），去除气泡；用移液器吸取样本时，避免触碰管壁（防止污染移液器）。（二）提取过程操作加样操作：在生物安全柜内操作，移液器枪头一次性使用，加样后更换枪头；将样本加入提取板（或反应管）时，避免产生气溶胶（可采用“慢吸慢打”手法）；仪器操作：按提取试剂说明书设置提取仪参数（如温度、时间、转速），运行过程中不得开盖；提取完成后，立即将产物转移至扩增区（或4℃暂存，不超过2小时）。五、核酸扩增与结果判读（一）扩增试剂准备试剂解冻：扩增试剂（含酶、引物、探针）从-20℃取出后，室温解冻10分钟，轻轻混匀（避免剧烈振荡产生气泡）；反应体系配制：在冰上操作，按比例加入酶、引物、探针、水等组分，配制完成后短暂离心（3000rpm，1分钟），确保试剂集中于管底。（二）扩增与结果分析加样与扩增：将提取的核酸产物加入反应体系，每加完1份样本更换枪头；PCR仪设置参数（如逆转录温度、预变性温度、循环数），扩增过程中严禁开盖；结果判读：阳性：靶基因Ct值≤35（或按试剂说明书阈值），且扩增曲线呈典型S型；阴性：无扩增曲线或Ct值＞40；无效：内参基因无扩增或曲线异常，需重新检测（检查样本、试剂或仪器，必要时重新采样）。六、质量控制管理（一）室内质量控制质控品设置：每次检测需同时设置阳性质控（浓度接近临床样本）、阴性质控（无模板水或阴性样本），与临床样本同批处理；质控分析：绘制质控图（如Levey-Jennings图），监控Ct值波动；若阳性质控Ct值偏离均值±3SD或阴性质控出现扩增，立即停止检测，分析原因（如试剂污染、操作失误），采取纠正措施（更换试剂、重新清洁实验室）后重新检测。（二）室间质量评价每半年参加省级及以上卫生健康部门组织的核酸检测室间质评，提交检测结果；对质评不合格项目，分析原因（如试剂批号差异、操作不规范），制定整改方案（如加强人员培训、更换试剂品牌），并验证整改效果。七、废弃物处理规范（一）废弃物分类感染性废物：采样拭子、含保存液的样本管、污染的防护用品、扩增后的反应管等，放入双层黄色医疗垃圾袋，标注“核酸检测废物”；其他废物：未污染的试剂包装（如外盒）、一次性手套（未接触样本）按生活垃圾处理（或医疗废物，视机构规定）。（二）处理流程感染性废物需经高压灭菌（121℃，30分钟）或化学消毒（2000mg/L含氯消毒剂浸泡30分钟）后，由医疗废物集中处置单位转运；暂存时间不超过48小时，暂存点需通风、防渗漏，远离医疗区和居民区。八、人员防护与培训（一）防护用品使用采样人员：穿医用防护服、戴N95口罩、护目镜、双层手套、鞋套，防护服破损或污染时立即更换；穿脱流程：穿防护服前执行七步洗手法，脱防护服时按“外污染、内清洁”原则，依次脱鞋套、外层手套、防护服、护目镜、口罩，每步后消毒手；职业暴露处理：若样本溅入眼内，立即用生理盐水冲洗15分钟；若发生针刺伤，挤出伤口血液，用碘伏消毒，报告院感科并就医。（二）培训与考核新入职人员需接受核酸检测理论培训（含生物安全、操作规范）和实操培训（样本采集、提取、扩增），考核合格后方可独立上岗；