TUNEL染色技术操作流程详解

TUNEL染色技术操作流程详解细胞凋亡作为细胞程序性死亡的核心过程，其检测在肿瘤病理、发育生物学及药物研发等领域具有关键价值。TUNEL（TerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling）染色技术通过原位标记DNA断裂的3’-OH末端，为凋亡细胞的可视化分析提供了可靠手段。本文将从样本处理、试剂操作到结果判读，系统解析TUNEL染色的标准化流程，助力科研与临床实践中精准的凋亡分析。一、样本准备：适配不同类型的实验材料TUNEL染色适用于石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片及组织芯片等样本，需根据材料特性优化前处理步骤：（一）石蜡包埋组织切片1.脱蜡与水化：将切片置于二甲苯中（两次，各10分钟）脱蜡，经梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）依次浸泡（各5分钟）至蒸馏水，完成水化。2.通透处理：滴加蛋白酶K工作液（20μg/ml，可根据组织类型调整浓度），37℃孵育15~30分钟（如肝、肾组织可缩短至10分钟，肿瘤组织延长至30分钟），PBS冲洗终止反应（3次，每次5分钟）。（二）冰冻组织切片1.固定：新鲜冰冻切片（厚度5~10μm）立即用4%多聚甲醛（PFA）固定30分钟（室温），PBS冲洗（3次，每次5分钟）。2.通透：0.1%TritonX-100（PBS配制）室温孵育10分钟，PBS冲洗（3次）。（三）细胞爬片/贴壁细胞1.固定：4%PFA室温固定15~20分钟，PBS冲洗（3次）。2.通透：0.1%TritonX-100室温孵育5分钟（悬浮细胞可先离心涂片），PBS冲洗（3次）。二、试剂配制：精准把控反应体系TUNEL检测试剂盒通常包含TdT酶液、dUTP标记液（荧光或地高辛标记）、平衡缓冲液及洗涤液。操作前需注意：1.反应液现配现用：根据样本数量，按比例混合TdT酶与dUTP标记液（如1μl酶+49μl标记液，适配1个样本），轻柔混匀后避光保存（冰上操作）。2.阴性/阳性对照设置：阴性对照：用PBS替代TdT酶液，其余步骤相同；阳性对照：DNaseI（10U/μl）37℃处理样本10分钟，诱导DNA断裂后进行染色。三、染色流程：标准化操作保障结果可靠性（一）平衡与反应孵育1.滴加平衡缓冲液（试剂盒配套），室温孵育10分钟，弃液（无需冲洗）。2.滴加新鲜配制的TUNEL反应液，覆盖样本区域，37℃避光孵育60分钟（细胞样本可缩短至30分钟，组织样本延长至90分钟，具体参考试剂盒说明书）。（二）终止与复染1.终止反应：PBS冲洗样本3次（每次5分钟），去除未结合的反应液。2.核复染：荧光检测：滴加DAPI染液（1:1000稀释），室温避光孵育5分钟，PBS冲洗；明场检测：苏木精复染（滴加工作液1~2分钟），自来水返蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封片。（三）封片与保存荧光样本需用抗淬灭封片剂封片（避免荧光淬灭），明场样本用中性树胶封片。封片后避光干燥，4℃短期保存或-20℃长期保存。四、结果判读：从信号特征到定量分析（一）荧光显微镜观察凋亡细胞：细胞核呈现特异性荧光（如FITC标记为绿色，Cy3标记为红色），形态可呈固缩、碎裂状；正常细胞：仅DAPI（蓝色）或苏木精（蓝色）染色，无荧光信号。（二）定量分析1.手动计数：随机选取5个高倍视野（×400），统计阳性细胞数与总细胞数的比值，计算凋亡率；2.图像分析软件：如ImageJ，通过“ColorThreshold”功能识别荧光信号，自动统计阳性面积与总核面积的比例。五、关键注意事项与常见问题解决（一）操作关键点1.固定及时性：样本离体后需立即固定，避免缺血/缺氧导致的自发凋亡；2.避光操作：dUTP标记液对光敏感，全程需用锡箔纸包裹容器；3.试剂新鲜度：TdT酶活性易受温度影响，需-20℃避光保存，避免反复冻融。（二）常见问题及对策问题表现可能原因解决方法--------------------------------------------------------------------------背景荧光过高通透过度/试剂污染缩短通透时间，更换新鲜试剂阳性信号微弱孵育时间不足/酶失活延长孵育时间，重新配制反应液非特异性染色复染液浓度过高降低复染液浓度，缩短孵育时间结语TUNEL染色技术的核心在于精准控制DNA断裂标记的特异性