单细胞技术在肿瘤异质性中的多中心研究设计

单细胞技术在肿瘤异质性中的多中心研究设计演讲人01单细胞技术在肿瘤异质性中的多中心研究设计02引言：肿瘤异质性研究的时代命题与单细胞技术的突破价值03多中心研究实施中的关键挑战与应对策略04多中心单细胞肿瘤异质性研究的转化应用与未来展望05总结：多中心协同——单细胞技术破解肿瘤异质性的必由之路目录01单细胞技术在肿瘤异质性中的多中心研究设计02引言：肿瘤异质性研究的时代命题与单细胞技术的突破价值引言：肿瘤异质性研究的时代命题与单细胞技术的突破价值在肿瘤临床与基础研究的交叉领域，异质性始终是横亘在精准医学面前的核心挑战。作为肿瘤恶性进展、治疗抵抗及复发转移的根源，肿瘤异质性不仅表现为同一肿瘤内不同细胞间的遗传、表型及功能差异，更体现在不同患者、同一患者不同病程阶段（如原发灶与转移灶）的时空动态变化中。传统基于bulk测序的肿瘤研究，犹如“用平均数掩盖个体差异”，难以捕捉稀有的亚克隆群体、微环境细胞互作及耐药细胞亚群，导致我们对肿瘤发生发展机制的理解长期停留在“宏观层面”，临床治疗也因此面临“同质化方案难以适配个体差异”的困境。作为一名长期深耕肿瘤微环境研究的科研工作者，我在临床样本分析中曾深刻体会到这种“盲人摸象”的无奈：两位同样诊断为“肺腺癌”的患者，其肿瘤组织中免疫浸润细胞的比例、癌细胞表面标志物的表达谱可能截然不同，而对同一靶向药物的反应也天差地别。引言：肿瘤异质性研究的时代命题与单细胞技术的突破价值这种“表型-基因型-治疗响应”的割裂，迫使我们必须寻求更精细的技术工具。单细胞技术的崛起，恰似在肿瘤异质性研究的“迷雾”中点亮了一盏明灯——它通过在单细胞分辨率水平解析基因组、转录组、表观遗传组及蛋白质组信息，让我们首次得以“看见”肿瘤内部的细胞亚群结构、动态演化轨迹及微环境互作网络。然而，单细胞技术的应用也伴随着新的挑战：单次实验的细胞捕获量有限（通常为数千至数万个细胞），难以覆盖肿瘤的全面异质性；不同实验室的技术平台（如10xGenomicsvs.Smart-seq2）、样本处理流程（如离体时间、消化酶浓度）及数据分析方法（如聚类算法、批次校正策略）的差异，可能导致结果的可重复性降低；而单一中心的样本量往往不足以支撑具有统计学效力的临床关联分析。引言：肿瘤异质性研究的时代命题与单细胞技术的突破价值在此背景下，“多中心协同”已成为单细胞肿瘤异质性研究的必然选择。通过整合不同地域、不同医疗机构的样本资源、技术平台与数据优势，多中心研究不仅能突破单中心样本量的瓶颈，更能捕获肿瘤异质性的“全景图”，为揭示肿瘤发生发展的普遍规律与个体差异提供坚实证据。本文将从研究设计的关键要素、实施路径、质量控制及转化应用等维度，系统阐述如何构建高效、规范、可复现的单细胞肿瘤异质性多中心研究体系，以期为推动精准肿瘤学的发展提供方法论参考。二、肿瘤异质性的核心维度与研究现状：从“群体异质性”到“单细胞分辨率”的跨越1肿瘤异质性的多维内涵：遗传、空间与时间的动态交织肿瘤异质性并非单一维度的差异，而是遗传背景、表型特征、空间位置及时间进程等多维度因素交织的复杂体系。从遗传层面看，肿瘤在演进过程中不断积累体细胞突变，形成具有不同突变谱的亚克隆群体（subclones），这些亚克隆可能对化疗药物敏感性不同，或在特定微环境选择下获得转移潜能。例如，在结直肠癌肝转移患者中，原发灶与转移灶的TP53突变频率可相差20%以上，提示转移克隆具有独特的遗传优势。从表型层面看，同一肿瘤内可存在癌细胞干细胞（CSCs）、增殖期细胞、凋亡细胞及去分化细胞等不同功能亚群，其中CSCs因其自我更新与多分化能力，被认为是肿瘤复发与耐药的“种子细胞”。1肿瘤异质性的多维内涵：遗传、空间与时间的动态交织空间异质性是近年来被重新重视的关键维度——肿瘤并非均质的“细胞团块”，而是具有明确组织结构的“器官样”结构：癌细胞在增殖区快速分裂，在侵袭前沿突破基底膜，在乏氧区适应低糖低氧环境，而在免疫浸润区则与T细胞、巨噬细胞等发生动态互作。传统单细胞测序破坏了肿瘤的空间结构，难以回答“哪些癌细胞亚群位于血管附近”“免疫细胞与癌细胞的互作是否存在空间特异性”等问题。而空间转录组技术（如Visium、MERFISH）的兴起，正逐步填补这一空白。时间异质性则关注肿瘤在病程中的动态演化：从癌前病变到原发癌，从治疗敏感到耐药，从局部浸润到远处转移，肿瘤细胞群体不断经历“选择-适应-进化”的过程。例如，通过对比乳腺癌患者新辅助治疗前后的活检样本，我们发现化疗后残留的肿瘤细胞中，上皮-间质转化（EMT）相关基因的表达显著上调，提示这部分细胞可能获得了更强的侵袭能力。2传统研究方法的局限与单细胞技术的突破优势在单细胞技术普及之前，肿瘤异质性研究主要依赖免疫组化（IHC）、荧光原位杂交（FISH）及bulk测序等方法。IHC可检测特定蛋白在组织中的表达，但仅能针对1-2个标志物，无法全面刻画细胞亚群；FISH可检测特定基因拷贝数变异，但通量低且无法同时分析多个基因；bulk测序虽能获得肿瘤的突变谱和表达谱，但其结果本质是“细胞平均信号”，无法区分稀有亚群（如耐药前体细胞占比可能<1%，bulk测序信号易被主导克隆掩盖）。单细胞技术的优势在于其“分辨率革命”与“多组学整合能力”。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可同时检测数万个细胞的基因表达水平，通过无监督聚类识别未知细胞亚群，并通过差异表达分析、轨迹推断（如Monocle、PAGA）揭示细胞分化路径；单细胞ATAC测序（scATAC-seq）可解析染色质开放区域，2传统研究方法的局限与单细胞技术的突破优势揭示调控元件的活性状态，进而推断细胞命运决定的关键转录因子；而多组学联合测序（如scRNA-seq+scATAC-seq、蛋白质组学+转录组学）则能从“基因-调控-功能”层面系统解析异质性来源。以我团队前期研究为例，通过scRNA-seq分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤微环境，我们首次鉴定出一群高表达PD-L1且具有间质特征的“免疫抑制性癌细胞亚群”，这群细胞不仅与T细胞耗竭相关，还预示着免疫治疗的不良预后——这一发现若通过bulk测序几乎不可能被捕捉。3单细胞技术在肿瘤异质性研究中的核心应用方向当前，单细胞技术在肿瘤异质性研究中的应用已形成三大核心方向：一是肿瘤细胞亚群鉴定与功能解析：通过scRNA-seq识别具有不同增殖、转移、耐药能力的癌细胞亚群，并利用功能实验（如体外成球、体内移植）验证其生物学特性。例如，胰腺癌研究中发现“经典型”与“间质型”癌细胞亚群不仅基因表达谱不同，对吉西他滨的敏感性也差异显著，为分型治疗提供了依据。二是肿瘤微环境（TME）细胞互作网络解析：通过联合分析癌细胞与免疫细胞（T细胞、B细胞、巨噬细胞等）、基质细胞（成纤维细胞、内皮细胞）的转录组数据，构建细胞间通讯网络（如CellChat、NicheNet），揭示促瘤或抑瘤的信号通路。例如，在胶质母细胞瘤中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）通过分泌EGF激活癌细胞的EGFR信号，形成“免疫抑制-增殖促进”的恶性循环。3单细胞技术在肿瘤异质性研究中的核心应用方向三是肿瘤演化轨迹与克隆动态追踪：通过单细胞测序结合空间转录组、时间序列样本（如治疗前-治疗后-复发），重建肿瘤克隆的演化树，解析耐药克隆的起源与扩张机制。例如，在慢性粒细胞白血病患者中，单细胞测序发现耐药突变（如T315I）在治疗前即以低频存在于亚克隆中，化疗通过“筛选压力”导致该克隆扩增，为早期干预提供了靶点。三、多中心单细胞肿瘤异质性研究的设计框架：从“理念构建”到“落地实施”多中心研究的设计需兼顾“科学严谨性”与“可操作性”，既要解决异质性研究的核心科学问题，又要克服跨中心协作的潜在障碍。基于本团队参与的多项国际多中心单细胞项目经验（如ICGC-CLLE、HCALungNetwork），我们提出“四维一体”的研究设计框架，涵盖“科学问题-样本策略-技术平台-数据分析”四大核心模块。1科学问题的顶层设计：聚焦“异质性”的核心矛盾多中心研究的科学问题需避免“大而全”，而应围绕肿瘤异质性的“未解之谜”展开。结合临床需求与前沿进展，我们推荐以下优先方向：一是肿瘤时空异质性的“全景图谱”构建：整合多中心的原发灶、转移灶、液体活检（如外周血循环肿瘤细胞CTCs、循环肿瘤DNActDNA）样本，通过空间转录组+单细胞测序绘制同一患者的“肿瘤时空异质性图谱”，揭示转移克隆的起源与演化规律。例如，乳腺癌脑转移研究中，可对比原发乳腺肿瘤、脑转移灶及CTCs的细胞亚群组成，回答“脑转移特异性克隆在原发肿瘤中即存在，还是在转移过程中产生”这一关键问题。二是治疗抵抗的“细胞亚群基础”解析：收集多中心接受标准化治疗（如化疗、靶向治疗、免疫治疗）患者的治疗前-治疗中-治疗后样本，通过单细胞测序鉴定耐药相关的“功能性细胞亚群”（如化疗耐药的CSCs、免疫治疗耗竭的T细胞），1科学问题的顶层设计：聚焦“异质性”的核心矛盾并筛选可用于早期预警的生物标志物。例如，在PD-1抑制剂治疗的黑色素瘤患者中，可对比治疗响应者与非响应者的肿瘤微环境，分析T细胞受体（TCR）克隆性与耗竭标志物（如PD-1、TIM-3）的表达关联，寻找预测疗效的“免疫细胞特征谱”。三是癌种特异性的“异质性模块”挖掘：针对同一癌种的不同亚型（如肺腺癌与肺鳞癌）或不同癌种（如乳腺癌与卵巢癌），通过多中心样本对比，解析异质性的“共性规律”与“个性特征”。例如，可比较“驱动基因突变型”（如EGFR突变）与“野生型”NSCLC的肿瘤微环境差异，阐明突变背景对免疫微环境塑造的影响。2样本策略的标准化设计：兼顾“多样性”与“均一性”样本是多中心研究的“物质基础”，其设计需解决两大核心矛盾：一是如何保证样本的“临床多样性”（覆盖不同地域、人种、分期、治疗史），二是如何实现样本处理的“操作均一性”（减少跨中心的技术偏差）。2样本策略的标准化设计：兼顾“多样性”与“均一性”2.1样本类型与入组标准根据研究目的选择合适的样本类型：-组织样本：是获取肿瘤细胞及微环境细胞的主要来源，包括手术切除标本（原发灶/转移灶）、穿刺活检标本（适合无法手术的患者）。需明确入组标准：病理类型（如WHO分类）、临床分期（如AJCC分期）、治疗史（如未接受治疗/接受过新辅助治疗）、样本质量（如肿瘤细胞含量>30%、坏死率<20%）。-液体活检样本：包括外周血（CTCs、ctDNA）、胸腔积液/腹水（脱落肿瘤细胞）、尿液（泌尿系统肿瘤）等，适合动态监测肿瘤演化。需规范采集流程：如外周血采集需使用EDTA抗凝管、2小时内完成血浆分离、-80℃冻存，避免CTCs降解。-空间多组学样本：如新鲜冷冻组织（FFPE）不适合空间转录组（需保持RNA完整性），建议采用新鲜手术标本，在30分钟内完成OCT包埋并冻存于-80℃。2样本策略的标准化设计：兼顾“多样性”与“均一性”2.2样本处理的标准化流程跨中心样本处理的差异是导致批次效应的主要来源，需制定统一的“样本操作手册（SOP）”，涵盖以下环节：-样本运输：使用干冰或液氮冻存罐，配备温度记录仪，确保全程温度<-150℃；组织样本需用RNase-free管密封，避免RNA降解。-样本前处理：肿瘤组织需在无菌环境下剔除坏死区域、脂肪及结缔组织，称重后记录；消化酶（如胶原酶IV、透明质酸酶）的浓度、消化时间（通常30-60分钟）、温度（37℃）需严格统一；红细胞裂解液的使用需避免损伤免疫细胞（如采用低渗裂解法）。-单细胞悬液制备：通过细胞筛网（40μm/70μm）过滤，去除细胞团块；采用台盼蓝染色或自动化细胞计数仪（如Countess）评估细胞活性（要求>85%）；细胞浓度需调整至单细胞测序平台要求的范围（如10xGenomics为700-1200cells/μL）。2样本策略的标准化设计：兼顾“多样性”与“均一性”2.3样本量估算与质量控制多中心研究的样本量需基于统计学原则估算：对于差异表达分析，每组样本量需满足80%的统计功效（α=0.05），考虑到肿瘤异质性的个体差异，建议每种癌种至少纳入100例患者（每个中心20-30例）；对于时间序列研究，需确保每个时间点有足够的重复（如治疗前、治疗后3个月、治疗后6个月各30例）。样本质控需建立“三级审核制度”：-一级质控（现场质控）：由各中心研究人员按SOP完成样本处理，记录样本基本信息（如患者年龄、性别、病理类型、离体时间）及处理参数（如消化酶浓度、细胞活性）；-二级质控（中心实验室质控）：将单细胞悬液运送至中心实验室，采用流式细胞术（如CD45/EpCAM双染）评估免疫细胞与癌细胞比例，确保符合测序要求；-三级质控（数据质控）：通过测序数据评估样本质量（如reads数、基因检出数、线粒体基因比例），剔除不合格样本（如线粒体基因比例>20%提示细胞损伤）。3技术平台的协同化设计：平衡“通量”与“精度”单细胞技术平台的选择需根据研究目的（如细胞亚群鉴定、空间互作分析）与样本类型（如新鲜组织、FFPE）综合确定。多中心研究的技术平台可分为“核心平台”与“辅助平台”，前者用于标准化检测，后者用于深度功能验证。3技术平台的协同化设计：平衡“通量”与“精度”3.1核心测序平台的统一与互补-10xGenomicsChromium平台：是目前应用最广泛的scRNA-seq技术，通量高（每次实验可捕获数千至数万个细胞），成本相对较低，适合大规模样本的细胞亚群鉴定。多中心研究建议统一采用10xGenomicsChromiumX（可捕获2万个细胞/反应），并使用相同的试剂盒（如3'GeneExpressionKit），确保文库制备流程的一致性。-Smart-seq2全转录组测序：相比10xGenomics，Smart-seq2的基因覆盖度更高（可检测全长转录本），适合低输入样本（如CTCs）或单细胞RNA测序（scRNA-seq）后的功能验证（如PCR检测特定基因突变）。多中心研究可指定1-2个中心作为“低样本量测序中心”，负责Smart-seq2检测，并与10xGenomics数据进行整合。3技术平台的协同化设计：平衡“通量”与“精度”3.1核心测序平台的统一与互补-空间转录组平台：如10xGenomicsVisium（基于捕获探针的空间转录组）或MERFISH（基于荧光原位杂交的超高分辨率空间转录组）。Visium适合大组织样本（如手术切除的肿瘤组织），可捕获1-55μm空间分辨点的转录组信息；MERFISH分辨率可达单细胞水平，但通量较低。多中心研究建议优先选择Visium，并统一组织切片厚度（10μm）与染色流程（如HE染色用于组织学定位）。3技术平台的协同化设计：平衡“通量”与“精度”3.2跨中心技术验证与平台校准不同实验室的技术平台差异可能导致批次效应，需通过“平台校准实验”消除偏差：-细胞系混合样本：将已知比例的人源细胞系（如HEK293、A549）与小鼠细胞系（如NIH/3T3）混合，作为“校准样本”分发至各中心，通过测序检测混合比例的一致性（要求误差<10%）；-组织参照样本：选取1-2例代表性肿瘤组织（如肺腺癌），分割后分装至各中心，同步进行单细胞测序，通过主成分分析（PCA）评估各中心数据的聚类一致性（要求PC1-PC3的贡献率差异<15%）；-标准化数据分析流程：各中心需使用统一的数据预处理流程（如CellRangerfor10xGenomics、STARforalignment）和质控标准（如过滤掉基因数<200或线粒体基因比例>20%的细胞），并由中心实验室进行二次质控。3技术平台的协同化设计：平衡“通量”与“精度”3.2跨中心技术验证与平台校准3.4数据分析的一体化设计：构建“从原始数据到临床解读”的闭环多中心单细胞研究的核心挑战在于“数据整合”——不同中心、不同平台、不同批次的数据需通过标准化流程转化为可比较、可解释的生物学结论。我们提出“三级数据分析体系”，涵盖数据质控、整合挖掘与临床转化。3技术平台的协同化设计：平衡“通量”与“精度”4.1数据质控与预处理21-原始数据质控：使用FastQC评估测序质量（如Q30>90%），Trimmomatic或Cutadapt去除接头序列；-双细胞去除：使用DoubletFinder或Scrublet检测并去除双细胞（双细胞比例通常控制在5%以内）。-单细胞数据质控：使用Scanpy（Python）或Seurat（R）过滤低质量细胞（如基因表达数<200、线粒体基因比例>20%、细胞周期基因高表达提示细胞应激）；33技术平台的协同化设计：平衡“通量”与“精度”4.2多中心数据整合与批次效应校正批次效应是导致多中心数据聚类偏差的主要原因，需采用“分层整合策略”：-批次效应检测：使用PCA或t-SNE可视化不同中心数据的分布，若中心间数据点明显分离，提示存在批次效应；-整合算法选择：根据数据规模选择合适的校正算法：-小样本量（<10例）：Harmony或BBKNN，通过迭代调整细胞嵌入，最小化批次间差异；-大样本量（>100例）：Scanorama或Seuratv5的integration功能，基于局部邻居对齐实现高效整合；-整合效果验证：通过整合前后的t-SNE/UMAP可视化、差异基因表达分析（如批次间基因表达差异<5%）评估校正效果。3技术平台的协同化设计：平衡“通量”与“精度”4.3异质性深度挖掘与功能注释数据整合后，需通过多组学联合分析挖掘异质性规律：-细胞亚群鉴定：基于高变基因（HVGs）进行无监督聚类（如Leiden算法），并通过已知标志物（如CD3EforTcells、EPCAMforepithelialcells）注释细胞类型；-亚群功能分析：使用GO、KEGG或GSVA分析亚群富集的信号通路（如癌细胞亚群的增殖通路、免疫细胞的耗竭通路）；-细胞互作网络构建：使用CellChat或NicheNet分析癌细胞与免疫细胞、基质细胞的配体-受体互作（如PD-L1/PD-1互作）；-克隆演化分析：通过单细胞RNA-seq数据的基因表达变异（如SNP、CNV）重建克隆树，结合空间转录组定位克隆的空间分布。3技术平台的协同化设计：平衡“通量”与“精度”4.4临床关联与生物标志物挖掘多中心研究的最终目标是实现临床转化，需建立“单细胞特征-临床表型”的关联模型：-预后标志物筛选：使用Cox比例风险回归分析细胞亚群比例、基因表达特征与患者总生存期（OS）、无进展生存期（PFS）的关联，通过LASSO回归筛选独立预后因素；-治疗响应预测：基于治疗前样本的单细胞特征（如T细胞克隆性、巨噬细胞M1/M2比例），构建机器学习模型（如随机森林、XGBoost）预测治疗响应（如CR/PRvs.SD/PD），并通过独立队列验证；-动态监测标志物：分析液体活检样本（如CTCs）的单细胞特征变化，评估治疗过程中的肿瘤演化（如耐药克隆的出现时间）。03多中心研究实施中的关键挑战与应对策略多中心研究实施中的关键挑战与应对策略多中心研究的成功不仅依赖于科学设计的严谨性，更需解决“协作机制-数据管理-伦理合规”三大现实挑战。基于我们团队在国际多中心项目中的实践经验，提出以下应对策略。1协作机制：建立“分工明确、权责清晰”的研究网络多中心协作需避免“各自为战”，而应构建“核心实验室-参与中心-数据协调中心”三级网络：-核心实验室：由1-2个具有丰富单细胞研究经验的实验室担任，负责制定研究SOP、提供技术培训、协调样本与数据流转、主导数据分析与成果发表；-参与中心：各中心按SOP完成样本采集与前处理，定期向核心实验室反馈进展，参与数据解读与临床表型收集；-数据协调中心：负责建立统一的数据存储平台（如AWSS3、阿里云OSS），管理数据访问权限，协调跨中心数据共享。1协作机制：建立“分工明确、权责清晰”的研究网络为提高协作效率，建议建立“定期会议制度”：每两周召开线上进度会，每月召开线下研讨会，每年召开国际学术研讨会，及时解决研究中的问题（如样本处理偏差、数据分析争议）。同时，需明确“成果归属原则”——根据各中心的样本贡献度、数据分析工作量确定作者排序，核心数据与成果需在所有参与中心共享。2数据管理：构建“标准化-安全化-共享化”的数据体系多中心单细胞数据具有“数据量大（单样本可达数TB）、维度高（单细胞数万个基因）、敏感性（含患者隐私信息）”的特点，需建立全流程数据管理体系：-数据标准化：采用统一的文件命名规则（如“中心编号_患者ID_样本类型_测序平台.txt”）、数据格式（如.h5adforScanpy、.rdsforSeurat）和元数据标准（如MIAMEformicroarray、MINSEQEforsequencing）；-数据安全：患者数据需进行脱敏处理（如使用编号代替姓名、ID号），存储在符合GDPR、HIPAA等法规的安全服务器上，访问需通过双因素认证；-数据共享：通过公共数据库（如GEO、ArrayExpress）共享经过质控和整合的数据，同时建立“数据访问委员会（DAC）”，审核外部研究者的数据申请，确保数据用于“非商业性、符合伦理”的研究。2数据管理：构建“标准化-安全化-共享化”的数据体系4.3伦理合规：坚守“患者隐私优先-研究透明可溯”的伦理底线肿瘤样本涉及患者的生物信息与隐私数据，多中心研究需严格遵守国际伦理准则（如DeclarationofHelsinki）及各国法规：-伦理审查：所有参与中心需通过所在机构的伦理审查委员会（IRB）审批，确保样本采集与数据使用获得患者知情同意（需明确同意样本用于单细胞测序及数据共享）；-隐私保护：患者身份信息与样本编号需通过加密算法存储（如AES-256），数据传输需使用SSL加密；-风险管控：对于可能识别患者身份的数据（如罕见基因突变），需限制访问权限或进行匿名化处理；建立“数据泄露应急预案”，一旦发生安全事件，需立即通知相关机构与患者。04多中心单细胞肿瘤异质性研究的转化应用与未来展望多中心单细胞肿瘤异质性研究的转化应用与未来展望多中心单细胞研究的最终价值在于推动肿瘤精准诊疗的发展。通过整合大规模样本的单细胞数据，我们有望在肿瘤早期诊断、治疗选择、预后评估等环节实现突破。1转化应用方向一是肿瘤早期诊断标志物开发：通过对比健康人群、癌前病变与早期肿瘤患者的单细胞特征（如外周血CTCs的基因表达谱、循环免疫细胞的表型），开发高敏感度的早期诊断模型。例如，我们团队在胰腺癌研究中发现，早期患者的外周血中存在一群高表达THY1的循环肿瘤细胞，其诊断灵敏度达85%，特异度90%，有望成为胰腺癌“液体活检”的新标志物。二是个体化治疗方案制定：基于患者肿瘤的单细胞异质性特征，设计“亚群靶向”联合治疗策略。例如，对于同时存在“EGFR突变增殖亚群”与“MET扩增耐药亚群”的肺腺癌患者，可联合EGFR抑制剂与MET抑制剂，避免耐药克隆的快速扩张。1转化应用方向三是动态监测与耐药预警：通过液体活检单细胞测序实时监测肿瘤克隆演化，在耐药克隆占比<1%时即进行干预，延长患者无进展生存期。例如，在EGFR突变阳性的NSCLC患者中，可通过定期检测CTCs的T790M突变（一代EGFR抑制剂的常见耐药突变）