标准化菌种保存操作规范

标准化菌种保存操作规范一、引言菌种作为微生物学研究、生物发酵、医学诊断等领域的核心资源，其保存质量直接影响实验重复性、生产稳定性及研究结论的可靠性。标准化的菌种保存操作可有效延缓菌种退化、防止杂菌污染、维持遗传特性稳定，为科研与产业应用提供“活的”、可复现的生物材料。本规范结合微生物学操作实践与质控要求，梳理不同保存方法的核心流程与质控要点，旨在为实验室、生物企业的菌种管理提供实操指引。二、菌种保存的基本原则（一）无菌操作原则全程遵循无菌操作规范：操作环境（超净台、生物安全柜）需提前灭菌，接种工具（接种环、吸管）经灼烧/高压灭菌，操作人员佩戴无菌手套、口罩，避免环境微生物或人体菌群污染菌种。（二）适配性原则根据菌种的生理特性（如嗜温/嗜冷、好氧/厌氧、产孢能力）、使用频率（高频使用菌种宜选短期保存法，低频菌种优先长期保存法）及资源条件（设备、成本），选择最适配的保存方法（如酵母菌可选用甘油冻存，芽孢杆菌可结合斜面与冻干保存）。（三）稳定性与可复现性原则保存过程需维持菌种遗传稳定性（避免频繁传代导致变异），并保证“保存—复苏”流程的可复现性（即复苏后菌种的活性、特性与原始菌株一致）。需定期对保存菌种进行活性检测与遗传特性验证（如菌落形态、生化反应、分子标记）。三、主要保存方法的操作规范（一）斜面低温保存法（短期保存，≤6个月）1.适用范围适用于细菌、酵母菌、丝状真菌等非严格厌氧菌的短期保存，或作为“工作菌种”供日常实验使用。2.操作流程培养基制备：根据菌种需求选择培养基（如细菌用LB斜面，酵母菌用YPD斜面，真菌用PDA斜面），按配方配制后分装试管（每管10~15mL），121℃高压灭菌20min，冷却后摆成斜面（斜面长度占试管1/2~2/3）。接种与培养：无菌操作下，用接种环挑取新鲜纯培养物（菌落/菌苔），在斜面上划“Z”字或蛇形线接种，30℃/28℃（依菌种调整）培养1~3天，至斜面长满菌苔/菌落。保存与管理：将长满菌的斜面试管用无菌棉塞/硅胶塞封口（避免使用易滋生霉菌的普通棉塞），标记菌种编号、名称、接种日期、保存条件（4℃冰箱），并记录于《菌种保存台账》。3.注意事项每3~6个月转接一次，转接前需镜检确认无杂菌污染；保存温度严格控制在4℃±1℃，避免温度波动导致培养基干裂或菌种代谢紊乱；若斜面出现杂菌菌落（形态、颜色异常）、培养基干裂或菌种活性下降，立即丢弃并重新制备。（二）甘油管冻存法（长期保存，1~5年）1.适用范围适用于细菌、酵母菌、部分丝状真菌（需预处理）的长期保存，尤其适合-80℃冰箱或液氮冻存（需更换耐低温冻存管）。2.操作流程甘油预处理：分析纯甘油经121℃高压灭菌20min，冷却后备用（避免甘油中杂质影响菌种活性）。菌液制备：挑取新鲜纯培养物（单菌落/菌苔），接种至5mL液体培养基（如LB、YPD），30℃振荡培养12~24h（至对数生长期，确保菌活性）。冻存管制备：在无菌冻存管中加入1mL50%无菌甘油（甘油:菌液=1:1），再加入1mL对数期菌液，轻轻颠倒混合（避免剧烈振荡导致菌体破裂）。冻存与复苏：-80℃保存：冻存管标记后，先置于4℃预冷30min（缓慢降温，减少冰晶损伤），再转移至-80℃冰箱长期保存；液氮保存：需使用耐液氮冻存管，按上述步骤制备后，直接投入液氮罐气相层（-150℃~-196℃）保存。复苏时，取冻存管迅速置于37℃水浴（细菌）或30℃水浴（酵母菌）中融化，吸取0.1mL菌液接种至液体培养基，培养后转接斜面。3.注意事项甘油终浓度需控制在15%~20%（过高抑制活性，过低易形成冰晶）；冻存管需密封良好，避免液氮渗入或甘油泄漏；复苏后若菌活性低，可尝试“梯度降温”预处理（如4℃→-20℃→-80℃分步冻存）。（三）冻干保存法（超长期保存，5~10年）1.适用范围适用于细菌芽孢、酵母菌、丝状真菌孢子等抗逆性强的菌株，或需长期（＞5年）保存且需极低代谢活性的菌种。2.操作流程预处理：制备高浓度菌悬液（如芽孢菌用生理盐水洗下芽孢，酵母菌用5%脱脂乳悬浮），菌浓度需达10^8~10^9CFU/mL（保证冻干后每安瓿含足够活菌）。分装与预冻：在无菌安瓿瓶中加入0.2~0.5mL菌悬液，立即置于-40℃冰箱/冻干机预冻仓预冻2~4h（至样品完全冻结）。冻干处理：将预冻的安瓿瓶转入冻干机，设置真空度＜10Pa、冷阱温度-50℃~-60℃，冻干12~24h（至样品完全干燥，呈疏松粉末状）。密封与保存：冻干后立即用火焰熔封安瓿瓶（确保无氧、无水分进入），标记菌种信息，置于4℃或室温干燥处保存。3.注意事项冻干前需验证菌悬液的活性与纯度（镜检+平板计数），污染菌严禁冻干；熔封时避免安瓿瓶炸裂，可先充入惰性气体（如氮气）再熔封；开启安瓿瓶时，需在超净台中用砂轮划开后消毒，避免玻璃碎屑污染。四、质量控制与管理（一）菌种鉴定与验证每批保存菌种需进行三级鉴定：1.形态学鉴定：观察菌落形态（大小、颜色、边缘）、菌体形态（革兰氏染色、孢子形态）；2.生理生化鉴定：通过API试纸条、生化反应（如糖发酵、酶活性）验证特性；3.分子生物学鉴定：对16SrRNA（细菌）、ITS（真菌）基因测序，与原始序列比对（相似度≥99%为合格）。（二）活性与污染检测活性检测：定期（斜面法3个月/次，冻存法1年/次）复苏菌种，通过平板计数（CFU）、生长曲线测定活性，活性下降至原始值的80%以下时需复壮或更换保存方法；污染检测：镜检（油镜下观察杂菌形态）、选择性培养基划线（如细菌用LB+青霉素筛选真菌污染），发现污染立即隔离并追溯污染源。（三）文档管理建立《菌种保存档案》，记录：菌种基本信息：编号、名称、来源（菌株库/分离地点）、原始特性（菌落、生化、序列）；保存信息：方法、培养基、保存温度、接种/冻存/冻干日期；操作记录：转接、复苏、鉴定、污染处理等时间与结果；责任人：操作人、审核人签名，确保责任可追溯。五、注意事项与应急处理（一）个人防护与环境安全操作致病性菌种（如致病菌、真菌毒素产生菌）时，需在生物安全柜中操作，佩戴护目镜、防护服，避免气溶胶暴露；废弃菌种需经121℃高压灭菌30min后处理，严禁直接丢弃。（二）设备维护超净台/生物安全柜定期（每月）用75%乙醇+紫外灯灭菌，检测风速与过滤效率；-80℃冰箱、液氮罐每周检查温度/液位，记录波动情况，备用电源确保断电时温度稳定。（三）应急处理菌种污染：立即隔离污染菌种，对保存环境（冰箱、超净台）用甲醛熏蒸或过氧乙酸喷雾消毒，追溯污染来源（如培养基、操作流程）并整改；菌种失活：若复苏后活性为0，核查保存条件（温度、密封性）、操作流程（冻存保护剂浓度、冻干时间），从备份菌种（如另一管冻存菌、斜面菌）重新保存，或从原始来源（如ATCC、CGMCC）申请菌种。六、结语标准化菌种保存是微生物资源管理的核心环节，