实验-中药制药08-药物制剂08

药物制剂08、中药制剂08实验室规则1.进入实习室实验要穿白大衣.2.除实验中必用的学习用品外,其他物品不要放在实验台上.书包放桌屉内.3.实习室内不允许吃食物或饮料.4.实验中一定要保持实习室安静,彼此讨论问题时不要大声喧哗,严禁打闹.5.实验过程要按照教师要求进行操作,如有疑问要请教指导教师.6.爱护实验器材,如有损坏应及时报告教师,需赔偿者按规定办理.7.实验完毕,要清理台面.需冲洗的物品按要求冲洗,需收回的物品按要求摆放整齐送回教学准备室.8.值日生要做好值日,离开实习室时,一定要有专人负责关好门窗,水源及照明设备.实验一免疫学实验（4学时，w14）【需带显微镜】

一、凝集试验

1．人类ABO血型鉴定------学生操作 每人做二、沉淀试验1．双向扩散------学生操作 每人做三、普通光学显微镜（油镜）使用和维护

教师示讲 1架/人四、大小吞噬试验---发片观察 2片/台五、E花环试验---发片观察 2片/台六、淋转试验----发片观察 2片/台

血清学反应1含义:抗原和抗体的体外反应2

特性:(1)特异性结合(2)可逆性结合(3)需一定条件:生理盐水;温度;pH值;

合适的抗原抗体比例3种类凝集反应：玻片凝集试验，试管凝集试验等沉淀反应:

补体参加的试验：用标记抗体或抗原进行的反应：

一，凝集试验-玻片凝集试验人类ABO血型鉴定-学生操作每人做

1原理：

2材料

抗体：抗A血清，抗B血清

抗原：自身红细胞

器材：无菌采血针，加生理盐水的洁净小试管等。凝集试验的原理电解质颗粒性Ag(细菌、细胞等)特异性Ab

Ag/Ab-IC（肉眼可见的凝集块）抗A标准血清抗B标准血清血型＋—＋——＋＋—ABABO“＋”表示红细胞凝集，“－”表示红细胞未凝集ABO血型鉴定表

3方法步骤：

采手指血混合于生理盐水于载玻片滴加抗A血清或抗B血清滴加红细胞悬液混匀室温静置数分钟，观察结果二，双向琼脂扩散试验双向扩散-学生操作每人做（检测甲胎蛋白AFP）

1原理:

可溶性抗原可和抗体在琼脂凝胶中同时向四周自由扩散(形成浓度梯度),在抗原和抗体合适比例处形成白色沉淀线,每一抗原抗体系统只能形成一条沉淀线,因此能对抗原成分进行精细分析.沉淀试验的原理电解质特异性Ab可溶性Ag(蛋白质等)Ag/Ab-IC（肉眼可见的沉淀物）

2材料

样品:待检人血清(抗原),脐带血清(AFP阳性对照),健康人正常血清(AFP阴性对照)

试剂:AFP诊断血清(抗体)

1.2%琼脂:

玻璃板:

玻璃平皿:

打孔器：

微量加样器:

3方法:1制备琼脂板:2打孔:3将抗体加入7号孔,1,4号孔加入阳性对照,6号为阴性对照,2,3,5号为待检样品,将琼脂板置湿盒于37℃过夜,观察结果

4结果：1)1、4孔与7孔间应出现白色沉淀线(阳性对照),6与7孔间应不出现白色沉淀线(阴性对照);2)若2、3、5孔与7孔间出现白色沉淀线而且与阳性对照沉淀线吻合,表明待检血清中含有AFP;如出现沉淀线,但不与阳性对照吻合，则判定AFP阴性；如无沉淀线，也判定为AFP阴性。12345671234567132476127345617234561237456三，普通光学显微镜（油镜）的使用和维护--教师示讲 1架/人

油镜的使用:100X,HI,oil等香柏油增加照明亮度：增加分辩率：透镜透镜玻片玻片香柏油加油前加油后显微镜油镜的原理使用注意事项：使用油镜观察样品后，随即用二甲苯将油镜镜头和载波片擦净，以防其他的物镜玻璃上沾上香柏油。二甲苯有毒，使用后马上洗手。四，大小吞噬试验---发片观察 2片/台

1原理：

中性粒细胞：核分叶，细菌染成蓝紫色（小吞噬）单核巨噬细胞：紫色或不规则形巨噬细胞，鸡红细胞核呈淡紫色（大吞噬）2材料：（1）样品：表皮葡萄球菌；1%鸡红细胞（2）吞噬细胞：人外周静脉血；小鼠腹腔巨噬细胞（3）试剂：Wright-Giemsa染色液等3方法：（1）小吞噬：人外周静脉血+表皮葡萄球菌悬液（2）大吞噬：小鼠腹腔注射1%鸡红细胞中性粒细胞大吞噬细胞10×100鸡红细胞巨噬细胞球菌鸡红细胞巨噬细胞巨噬细胞吞噬鸡红细胞五，E花环形成试验-发片观察2片/台

1原理：

人T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（SRBC）受体（E受体，CD2），故在一定条件下，SRBC能结合在淋巴细胞表面，形似玫瑰花环（E-花环），常用于测定T细胞数量。

Erythrocyte,红细胞

2材料：

1）样品：人静脉血

2）试剂：1%SRBC悬液等

3）器材：试管等

3方法（微量法）

1）粗制淋巴细胞悬液：双蒸水去除红细胞，用Hank’s液悬浮

2）加入小牛血清,水浴10~15分钟,加入1%SRBC混合,置37℃水浴5分钟,低速离心5分钟,滴片或涂片观察,计算E花环形成细胞数量E花环形成细胞数量=花环数/淋巴细胞数E花环T细胞sRBC4结果：结合3个以上SRBC的淋巴细胞为E花环细胞六，T淋巴细胞转化试验（淋转）---发片观察，2片/台

1原理：

T淋巴细胞表面具丝裂原(PHA等)受体及TCR,在PHA作用下发生活化,进入有丝分裂期从而增殖(淋巴细胞转化,形成淋巴母细胞):DNA倍增,染色质疏松,核仁明显,核增大;细胞体积增大,胞浆丰富等。可了解机体细胞免疫状态

检测方法:形态学法;同位素法(3H-TdR)

2材料

1）样品:人静脉血

2）RPMI1640细胞培养基（含PHA）

3）其他器材等

3方法步骤(形态学法-全血法)

取人静脉血0.2ml加入到2ml细胞培养基中,1瓶加入PHA(终浓度1%),另一瓶为对照(等量细胞培养基),于37℃培养72小时,涂片,Wright-Giemsa染色，计算淋巴细胞转化率转化率=转化淋巴细胞数/淋巴细胞总数4结果：转化细胞细胞形体变大、细胞浆量大大增加并出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等静止的淋巴细胞转化的淋巴细胞淋转试验实验二综合性实验：细菌形态观察与分离培养（一）（4学时）一、普通肉汤培养基的制备---教师操作并讲解二、细菌的接种和培养：平板、斜面、半固体和肉汤---学生操作 1套/人三、细菌的培养技术---教师示讲四、细菌的生化反应（糖发酵、IMViC、H2S）---结果示教 1套/室五、消毒与灭菌---示范与讲解

培养基1含义：人工配制的能满足细菌及其他微生物生长繁殖或累积代谢产物的营养基质。2分类：

天然培养基

营养物质来源合成培养基

液体培养基：无琼脂

物理状态半固体培养基：0.3~0.7%琼脂固体培养基：1.5~2.5%琼脂

基础培养基

用途营养培养基选择培养基鉴别培养基一，普通肉汤培养基的制备：示教

1材料:牛肉膏,蛋白胨，氯化钠，蒸馏水等；

2器材：pH试纸，烧瓶，量筒，漏斗，滤纸，试管，棉塞，平皿,高压蒸汽灭菌器等

3配方:牛肉膏（0.3～0.5g),蛋白胨(1g)，氯化(0.5g)，蒸馏水(100ml);调pH为7.44制备过程:A称量:B溶解:C调pH值:D过滤:E分装:F高压灭菌：121℃,20分钟以上

G无菌检测:二，固体或半固体普通肉汤琼脂培养基的制备：讲解

配方及制备过程:

在前面所制备普通肉汤培养基中加入琼脂:浓度为0.3～0.7%可制备成半固体培养基,浓度为1.5～2.5%可制备成固体培养基；高压灭菌：121℃,20分钟以上待培养基冷至50～60℃时，在超净工作台内无菌操作：①斜面培养基：斜置试管冷却即可（琼脂浓度：1.5～2.5%）。②半固体培养基：直立试管冷却即可（琼脂浓度：0.3～0.7%）。③平板培养基：将固体培养液（琼脂浓度：1.5～2.5%）倾注入无菌空平皿，使培养基均匀铺满皿底，盖好皿盖冷却即可。三，细菌的接种和培养----平板、斜面、半固体和肉汤

细菌的分离方法：

稀释法、平板分区划线法。

细菌的接种方法：

斜面培养基接种法、液体培养基接种法、穿刺接种法、倾注平板法、平板涂布法。

细菌的培养方法：需氧培养法

CO2培养法厌氧培养法（一）平板分区划线法：学生操作

1原理:

采用在普通肉汤琼脂平板培养基上划线，将标本中的细菌尽量分散生长以获得较多的单个菌落。

2菌种:

混合菌（大肠杆菌、葡萄球菌）

3培养基:

普通平板，练习平板

4器材:

接种环,酒精灯等

5步骤:(1)接种环的火焰灭菌:(2)划线:四区（每划一区，需灼烧接种环！）

(3)培养:37℃,18-24小时1区2区3区4区1234平板分区划线法（学生操作）（二）斜面培养基接种法：学生操作

1目的:在肉汤斜面培养基上接种培养细菌

2菌种:葡萄球菌、大肠杆菌、志贺菌、沙门菌疑似菌落等

3培养基:肉汤斜面培养基

4器材:接种环,酒精灯等

5步骤:(1)接种环的火焰灭菌:(2)划线:(3)培养:37℃,18-24小时（三）半固体培养基穿刺接种法学生操作

1目的:在肉汤半固体培养基上接种培养细菌以观察细菌有无动力等。

2菌种:大肠杆菌,葡萄球菌等

3培养基:肉汤半固体培养基

4器材:接种针,酒精灯等

5步骤:(1)接种针的火焰灭菌:(2)穿刺:(3)培养:37℃,18-24小时（四）液体培养基接种法学生操作

1目的:

在肉汤培养基接种培养细菌

2菌种:

金黄色葡萄球菌等

3培养基:

肉汤培养基

4器材:

接种环,酒精灯等

5步骤:(1)接种环的火焰灭菌:(2)接种细菌:(3)培养:37℃,18-24小时液体培养基沉淀生长混浊生长表面生长四，细菌的生化反应（糖发酵，IMVIC，H2S）结果示教 1套/室（一）糖发酵试验:原理：将某种糖或醇加入蛋白胨水培养基内，同时加入指示剂[溴甲酚紫pH5.2(黄色)-pH6.8(紫色)]和一只杜氏管；如细菌能利用该糖，则可产酸或/和产气。材料:大肠埃希菌，伤寒沙门菌；糖发酵管（葡、乳、麦等）方法：将细菌接种于各发酵管中，37℃培养24～48小时后观察。结果：培养液要变混浊：紫色：糖发酵为阴性（-）黄色，小管有气泡（产酸，产气）糖发酵为阳（+）黄色，小管无气泡（产酸，不产气）大肠埃希菌：（+）；伤寒沙门菌：+Carbohydratefermentation-（+）+大肠埃希菌：I：+；伤寒沙门菌：I：-+-大肠埃希菌：M：+；产气肠杆菌：M：-+-VP试验:Vi原理：产气杆菌具丙酮酸脱羧酶,可将葡萄糖分解产生的丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性条件下可被氧化成二乙酰,二乙酰可与蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成红色化合物(α-萘酚可催化此反应)。材料：大肠埃希菌，产气肠杆菌；葡萄糖蛋白胨水培养基；V-P试剂（α-萘酚酒精液，KOH液）方法：取细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养18～24小时，沿管壁先加入1毫升α-萘酚酒精液，再加入0.4毫升KOH液,充分振荡,室温静置5～30分钟观察。结果：红色为V-P阳性。大肠埃希菌：Vi：-；产气肠杆菌：Vi：++-枸橼酸盐利用试验(Citrateutilization)：C原理：产气肠杆菌利用枸橼酸盐为碳源,能将枸橼酸盐分解产生CO2,CO2再转变成碳酸盐,使培养基成碱性,加入溴麝香草酚蓝作为指示剂,可由绿色变为深蓝色。材料：大肠埃希菌，产气肠杆菌；西蒙氏枸橼酸盐培养基（斜面）。方法：将细菌接种于西蒙氏枸橼酸盐培养基斜面上，37℃培养24～48小时后观察结果。结果：斜面上有菌苔，且变成深蓝色，为阳性；斜面上无菌苔，仍是绿色为阴性。大肠埃希菌：C：-；产气肠杆菌：C：+++--硫化氢试验：原理：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生H2S，H2S遇铅或亚铁离子可形成黑色硫化铅或硫化亚铁沉淀材料：大肠埃希菌，肖氏沙门菌；醋酸铅半固体培养基方法：将细菌接种于醋酸铅半固体培养基，37℃培养24～48小时后观察结果。结果：培养基为黑色沉淀，即为产硫化氢阳性大肠埃希菌：H2S

：-；肖氏沙门菌：H2S

：+克氏双糖铁培养基：

（1）原理：

克氏双糖铁(KIA)培养基制成高层和短的斜面，其中葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的十分之一，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖产酸使pH降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部分又变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。细菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。细菌产生硫化氢时与培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁。

（2）方法：

用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到KIA或TSI深层，距管底3～5mm为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置35℃孵育18～24h，观察结果。

五、微生物的控制

（一）高压蒸汽灭菌：

注入适量蒸馏水等放入需高压灭菌物品，加盖打开排气阀，加热排气数分钟（排出空气），关闭排气阀

继续加热，待121℃时，计时，20分钟后，停止加热压力降为零时，开盖取出物品

（二）紫外线杀菌实验

1

原理：DNA链上相邻T在紫外线作用下可形成

T=T，可使DNA断裂或不能复制。

2

材料

细菌：葡萄球菌或大肠杆菌菌液无菌普通平板：无菌棉签：

3

方法：将用无菌棉签沾取葡萄球菌或大肠杆菌菌液，均匀涂布于普通平板表面，置于超净工作台紫外灯下（皿盖打开约1/3），紫外照射30分钟后，盖上皿盖于37℃培养24小时后观察结果。一、革兰染色---上次实验的分离平板培养物 学生操作 每人做

不染色:

暗视野观察法

细菌观察

单染色法:

染色

复染色法:革兰染色(Gramstain)、抗酸染色特殊染色法:芽胞染色、荚膜