带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒的表达、鉴定与纯化技术研究

带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒的表达、鉴定与纯化技术研究一、引言1.1研究背景与意义登革热是一种由登革病毒（DENV）引发的急性病毒性传染病，主要通过伊蚊叮咬传播，在全球热带和亚热带地区广泛流行。世界卫生组织（WHO）数据显示，全球每年约有四亿人感染登革病毒，其中50万人发展为重症，死亡近两万人。仅2023-2024年，东南亚和南美地区就有大量登革热病例，如巴西在2024年3月前就有超150万疑似病例和500多例死亡病例，预计全年病例将超400万，创历史新高。我国广东、云南等地也是登革热的主要流行区，2014年广东疫情发病人数超五万，2023年全年报告近2万例。登革病毒严重威胁全球公共卫生安全，已被WHO列为“全球十大健康威胁”之一。登革病毒属于黄病毒科正黄病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为11kb，包含一个开放读码框，编码3个结构蛋白（C、prM和E）和7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。自然界中存在DENV1-DENV4四种血清型，各型之间缺乏交叉保护，多次感染或同时感染不同血清型的情况并不罕见。登革病毒感染后的临床表现复杂多样，多数为无症状感染，有症状的患者可分为登革热和重症登革。前者一般表现为高热、头痛、关节痛、皮疹等感冒样症状，具有自限性；后者则可发展为出血、肝损害、休克等严重症状，病情危重，若救治不及时，病死率可达30%。目前临床上对于登革热尚无特效药物治疗，主要采取对症治疗和支持疗法，因此开发有效的疫苗和深入了解病毒机制迫在眉睫。疫苗接种是控制传染病最有效的手段之一，登革疫苗的研发已历经近百年，包括灭活疫苗、减毒疫苗、重组蛋白疫苗、减毒活疫苗等多种类型。目前，虽已有两款登革四价减毒活疫苗（Dengvaxia和Qdenga）在海外获批上市，还有一款（TV003）完成临床III期试验，但这些疫苗在使用范围和效果上存在一定局限性。比如Dengvaxia在特定人群中可能增加罹患登革热住院风险；Qdenga在登革血清阴性人群中对DENV3的保护效力不明显，还可能导致更高住院率；TV003对于2-6岁受试者的长期保护效果以及接种后是否会出现突破感染等仍需进一步评估。此外，我国尚未批准任何登革疫苗，多数品种处于临床前研究阶段。病毒样颗粒（VLPs）是不含病毒核酸的空壳结构，由病毒结构蛋白自动组装而成，在形态结构上与天然病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性，且不含有病毒遗传物质，不具有感染性。因此，VLPs在疫苗开发中极具潜力，已成为研究热点。多种病毒的结构蛋白都能在不同表达系统中组装成VLPs，如乙肝病毒、人乳头瘤病毒等的VLPs疫苗已成功应用于临床。在登革病毒研究领域，构建和研究登革病毒VLPs对于开发新型疫苗和深入了解病毒致病机制具有重要意义。本研究聚焦于带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒，旨在通过构建带有组氨酸标签的DENV2和DENV4基因组，利用转染技术在细胞中表达VLPs，再使用Ni-NTA融合蛋白层析柱纯化样品，最后通过SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot检测等方法评估样品纯度和可靠性。成功表达和纯化带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒，不仅能为登革病毒分子机制和病理学机制的深入研究奠定基础，还可用于药物筛选和疫苗开发等相关研究，为解决登革热这一全球性公共卫生问题提供新的思路和实验依据。1.2国内外研究现状登革病毒样颗粒（VLPs）作为疫苗研发的重要方向，在国内外均受到广泛关注。在国外，对登革VLPs的研究起步较早，进展也较为显著。早期，研究主要集中在VLPs的构建和表达。例如，通过将登革病毒的结构蛋白基因（如C、prM和E基因）导入不同的表达系统来实现VLPs的表达。哺乳动物细胞表达系统因能对蛋白质进行正确的折叠和修饰，利于VLPs的组装，被广泛应用。有研究利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞成功表达了登革病毒1型和2型的VLPs，通过电镜观察到所形成的VLPs在形态上与天然病毒颗粒相似。杆状病毒/昆虫细胞表达系统也展现出独特优势，如能实现大规模表达且成本相对较低。利用该系统表达登革病毒4型VLPs时，通过优化表达条件，可提高VLPs的产量和质量。随着研究的深入，对登革VLPs的鉴定技术不断更新和完善。除了传统的电镜观察用于直观了解VLPs的形态结构外，还运用了多种先进技术。免疫印迹（Westernblot）技术可特异性地检测VLPs中的目标蛋白，确定其表达情况；酶联免疫吸附测定（ELISA）则常用于定量检测VLPs的含量以及评估其免疫原性。在对登革病毒3型VLPs的研究中，通过ELISA检测免疫动物血清中的抗体水平，评估了VLPs诱导机体产生免疫应答的能力。此外，质谱技术也逐渐应用于VLPs的鉴定，可精确分析VLPs的蛋白质组成和修饰情况。在纯化方面，国外研究者尝试了多种方法。超速离心技术是常用的纯化手段之一，如蔗糖密度梯度离心，能根据VLPs的密度差异进行分离纯化。利用该方法对登革病毒2型VLPs进行纯化，可获得较高纯度的样品。亲和层析技术也因其特异性强、纯化效率高的特点而备受青睐。通过在VLPs上融合特定的标签，如组氨酸标签，再利用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，能有效去除杂质，提高VLPs的纯度。在国内，登革VLPs的研究也取得了一定成果。在表达方面，科研人员积极探索适合国内实际情况的表达系统和策略。利用毕赤酵母表达系统表达登革病毒1、2型VLPs，通过优化发酵条件，实现了VLPs的高效表达。在鉴定技术上，国内紧跟国际步伐，将多种技术联合应用，提高鉴定的准确性和全面性。在对登革病毒2型VLPs的研究中，综合运用电镜、免疫印迹和ELISA等技术，对VLPs的形态、蛋白组成和免疫原性进行了全面分析。在纯化技术方面，国内除了借鉴国外成熟的方法外，还在不断创新。开发了基于混合模式层析的纯化方法，结合了多种相互作用机制，对登革VLPs进行纯化，在提高纯度的同时，保持了VLPs的生物活性。尽管国内外在登革病毒样颗粒的表达、鉴定和纯化方面取得了诸多进展，但仍存在一些研究空白与不足。在表达方面，不同血清型登革VLPs的表达效率和质量存在差异，如何进一步优化表达条件，实现各型VLPs的高效、稳定表达，仍是需要解决的问题。对于一些新的表达系统，如植物表达系统，虽然具有成本低、安全性高等优势，但在登革VLPs表达中的应用还处于探索阶段，相关技术有待完善。在鉴定方面，目前的鉴定技术多侧重于对VLPs的结构和免疫原性的检测，对于VLPs在体内的作用机制和代谢过程的研究较少，缺乏有效的检测手段。在纯化方面，现有的纯化方法往往存在操作复杂、成本高、回收率低等问题，开发更加简便、高效、低成本的纯化技术是未来研究的重点方向之一。此外，对于带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒的研究相对较少，其表达、鉴定和纯化过程中可能存在的特殊问题和优化策略，还需要进一步深入探究。1.3研究目的与内容本研究旨在通过基因工程技术，实现带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒（VLPs）的高效表达、准确鉴定和有效纯化，为登革病毒的基础研究以及相关疫苗和药物的开发提供关键材料和技术支持。具体研究内容如下：构建带有组氨酸标签的DENV2和DENV4基因组：通过基因合成技术，获取登革病毒2型和4型的结构蛋白基因序列（C、prM和E基因），并在基因序列的合适位置引入组氨酸标签编码序列。利用分子克隆技术，将带有组氨酸标签的基因片段插入到合适的表达载体中，构建重组表达质粒。对重组表达质粒进行测序验证，确保基因序列的准确性和组氨酸标签的正确连接。在细胞中表达病毒样颗粒：选择合适的细胞系，如哺乳动物细胞（如HEK293T细胞）或昆虫细胞（如Sf9细胞），作为病毒样颗粒的表达宿主。采用脂质体转染、电穿孔等转染技术，将构建好的重组表达质粒导入细胞中。通过优化转染条件，如转染试剂与质粒的比例、转染时间、细胞密度等，提高转染效率，促进病毒样颗粒的表达。在细胞培养过程中，添加合适的诱导剂或调节培养条件，如温度、pH值、营养成分等，调控病毒样颗粒的表达水平和质量。使用Ni-NTA融合蛋白层析柱纯化样品：收集表达病毒样颗粒的细胞培养上清或细胞裂解液，进行初步的离心、过滤等预处理，去除细胞碎片和杂质。利用Ni-NTA融合蛋白层析柱，基于组氨酸标签与镍离子的特异性亲和作用，对样品中的带组氨酸标签的病毒样颗粒进行纯化。优化层析条件，如平衡缓冲液的组成、洗脱缓冲液的咪唑浓度和洗脱梯度等，提高纯化效率和纯度。对纯化后的样品进行浓缩、透析等处理，去除杂质和盐分，获得高纯度的带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒。通过SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot检测等方法评估样品纯度和可靠性：采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，对纯化后的病毒样颗粒进行分离，根据蛋白条带的位置和亮度，初步判断样品的纯度和蛋白组成。利用Westernblot检测技术，使用针对登革病毒结构蛋白或组氨酸标签的特异性抗体，对SDS-PAGE凝胶上的蛋白进行免疫印迹分析，进一步确认病毒样颗粒的表达和纯化情况，评估样品的可靠性。结合其他分析技术，如电镜观察、质谱分析等，对病毒样颗粒的形态结构、蛋白质组成和修饰情况进行全面分析，深入评估样品的质量和特性。二、登革病毒2型和4型及病毒样颗粒概述2.1登革病毒介绍2.1.1登革病毒的结构与基因组登革病毒颗粒呈球形，直径约45-55nm，属于黄病毒科黄病毒属。其结构主要由外层的包膜和内部的核衣壳构成。外层包膜为脂蛋白，其中镶嵌着包膜蛋白E（Envelopeprotein）和膜蛋白M（Membraneprotein）。包膜蛋白E在病毒感染宿主细胞过程中发挥关键作用，它负责识别并结合宿主细胞表面的受体，介导病毒与细胞膜的融合，从而使病毒进入细胞内，同时E蛋白也是诱导机体产生中和抗体的重要抗原。膜蛋白M则对维持病毒结构的稳定性和确保病毒的成熟具有重要意义。内部核衣壳由单股正链RNA（+ssRNA）和衣壳蛋白C（Capsidprotein）组成，20面体对称结构包裹着病毒基因组，衣壳蛋白C负责包裹病毒RNA，参与病毒颗粒的组装过程。登革病毒的基因组为单股正链RNA，长度约11kb，具有感染性。整个基因组只含有一个开放阅读框（ORF），从5'端到3'端依次编码3个结构蛋白（C、prM和E）和7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。在病毒的生命周期中，这一长的开放阅读框首先被翻译成一个多聚蛋白前体，随后在宿主细胞内的蛋白酶以及病毒自身编码的蛋白酶作用下，逐步切割加工，最终形成具有功能的各个成熟蛋白。结构蛋白是构成病毒颗粒的主要成分，直接参与病毒的组装和感染过程；非结构蛋白则主要参与病毒的RNA复制、转录调控、免疫逃逸以及与宿主细胞的相互作用等过程。例如，NS1蛋白虽然不参与病毒颗粒的组装，但它能以可溶性形式分泌到细胞外，与血管渗漏综合征和重症病程密切相关，可作为早期诊断登革病毒感染的重要标志物；NS3蛋白具有蛋白酶和解旋酶活性，在病毒多聚蛋白的加工以及病毒RNA的复制过程中发挥不可或缺的作用；NS5蛋白承担着RNA聚合酶和甲基化酶的功能，对于病毒基因组的复制和转录后修饰至关重要。2.1.2登革病毒2型和4型的特点与差异登革病毒2型（DENV-2）和4型（DENV-4）在病毒特征、传播范围以及致病性等方面存在一定差异。在病毒特征方面，二者的基因组序列存在差异，这导致其编码的蛋白质在氨基酸组成和结构上有所不同。例如，DENV-2和DENV-4的包膜蛋白E在一些关键氨基酸位点上的差异，会影响其与宿主细胞受体的结合亲和力以及免疫原性。研究表明，DENV-2的E蛋白某些区域的氨基酸序列变异与病毒的毒力增强相关，而DENV-4的E蛋白在与宿主细胞表面特定受体结合时，具有独特的结合模式。此外，它们在病毒颗粒的表面结构和抗原性上也存在细微差别，这些差异可能影响机体免疫系统对它们的识别和应答。从传播范围来看，DENV-2在全球热带和亚热带地区的传播更为广泛。在东南亚、南美洲、非洲等登革热高发地区，DENV-2是主要的流行血清型之一。我国广东、云南等地的登革热疫情中，DENV-2也较为常见。相比之下，DENV-4的传播范围相对较窄，在一些地区的流行强度低于DENV-2。但在特定的时间段和局部地区，DENV-4也可能引发小规模的疫情爆发。在致病性方面，DENV-2和DENV-4感染人体后引发的临床症状既有相似之处，也存在差异。相似症状包括发热、头痛、肌肉和关节疼痛、皮疹等，这些症状通常在感染后的3-14天内出现。然而，研究发现，DENV-2感染导致重症登革热的比例相对较高，更容易引发登革出血热和登革休克综合征等严重并发症，患者出现出血倾向、休克等症状的风险增加，病死率也相对较高。而DENV-4感染引起的症状相对较轻，发展为重症的比例相对较低。但这并不意味着DENV-4感染可以被忽视，在一些特殊人群（如儿童、老年人、免疫功能低下者）中，DENV-4感染仍可能导致较为严重的病情。此外，二次感染不同血清型的登革病毒时，DENV-2和DENV-4之间可能存在抗体依赖性增强（ADE）效应，即先前感染产生的抗体不仅不能有效中和新感染的病毒，反而会促进病毒进入免疫细胞，导致病毒复制增加和病情加重。不同血清型之间的ADE效应也存在差异，DENV-2在ADE效应中的作用相对更为显著。2.2病毒样颗粒（VLPs）2.2.1VLPs的概念与特性病毒样颗粒（VLPs）是一种特殊的病毒模拟结构，它由病毒的结构蛋白在适宜的表达系统中自动组装而成。VLPs在形态和结构上与天然病毒颗粒极为相似，通常呈现出与天然病毒相同的球形、杆状或二十面体等形态。例如，登革病毒样颗粒在电镜下观察，其形态与天然登革病毒颗粒相似，直径约为45-55nm。VLPs的结构主要由病毒的结构蛋白组成，如登革病毒的VLPs包含衣壳蛋白C、膜蛋白prM和包膜蛋白E。这些结构蛋白通过相互作用，自发组装形成稳定的颗粒结构。VLPs具有重要的特性，使其在病毒研究和疫苗开发中具有独特的优势。VLPs具有高度的抗原性。由于其结构与天然病毒相似，VLPs能够模拟天然病毒的抗原表位，有效地激活机体的免疫系统，引发免疫应答。当VLPs进入机体后，免疫系统能够识别其表面的抗原，从而启动免疫反应，产生特异性的抗体和免疫细胞，如B细胞、T细胞等，这些免疫细胞和抗体能够有效地识别和清除病毒，为机体提供免疫保护。其次，VLPs不含有病毒的遗传物质，如DNA或RNA。这使得VLPs不具有感染性，不会在宿主体内引发真正的病毒感染，从而大大降低了使用过程中的安全风险。这一特性使得VLPs在疫苗开发中具有极高的安全性，避免了传统疫苗可能带来的感染风险。此外，VLPs的表面蛋白具有良好的可修饰性。通过基因工程技术，可以对VLPs表面的蛋白进行改造和修饰，如引入特定的标签（如组氨酸标签）或添加其他功能蛋白，从而进一步增强VLPs的免疫原性或赋予其其他特殊功能。2.2.2VLPs在病毒研究和疫苗开发中的应用在病毒研究领域，VLPs为深入探究病毒的结构与功能提供了理想的模型。以登革病毒为例，通过构建登革病毒样颗粒，科研人员能够更清晰地了解病毒结构蛋白之间的相互作用机制。利用冷冻电镜技术对登革病毒VLPs进行分析，发现包膜蛋白E在VLPs表面的排列方式与天然病毒一致，且其构象变化与病毒的感染过程密切相关。这为揭示登革病毒的感染机制提供了重要线索。此外，VLPs还可用于研究病毒与宿主细胞的相互作用。将登革病毒VLPs与宿主细胞共培养，通过荧光标记和显微镜观察，发现VLPs能够特异性地结合到宿主细胞表面的特定受体上，进而研究该受体在病毒感染过程中的作用。在疫苗开发方面，VLPs展现出巨大的潜力。目前，已有多种基于VLPs的疫苗进入临床试验阶段或成功上市。在登革疫苗研发中，利用昆虫细胞表达系统生产的登革病毒1-4型的VLPs疫苗，在动物实验中表现出良好的免疫原性。免疫动物后，能够诱导产生高水平的中和抗体，有效抵御登革病毒的感染。在临床试验中，部分基于VLPs的登革疫苗也显示出对不同血清型登革病毒的保护作用。例如，某研究团队开发的登革病毒VLPs疫苗，在小范围的临床试验中，对登革热的预防效果达到了一定水平。与传统疫苗相比，VLPs疫苗具有安全性高、免疫原性强等优势。由于不含有病毒遗传物质，不会引发病毒感染，减少了疫苗接种后的不良反应。同时，VLPs的结构能够有效地激活机体的免疫系统，产生更持久、更强烈的免疫应答。三、材料与方法3.1实验材料3.1.1细胞株与菌株实验选用哺乳动物细胞HEK293T细胞株作为病毒样颗粒的表达宿主。HEK293T细胞源自人胚胎肾细胞293，经腺病毒E1A基因转化，具有贴壁生长特性，易于培养和转染。其优点在于能够对蛋白质进行正确的折叠和修饰，利于病毒样颗粒的组装。该细胞株购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），货号为XXXX。在实验前，将细胞复苏后培养于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，定期传代，以保持细胞的良好生长状态。选用大肠杆菌DH5α菌株用于重组表达质粒的扩增。大肠杆菌DH5α是一种常用于分子克隆的菌株，其遗传背景清晰，具有较高的转化效率。该菌株由本实验室保存，其基因型为F-、φ80dlacZΔM15、Δ(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rK-、mK+)、phoA、supE44、λ-、thi-1、gyrA96、relA1。在实验中，将含有重组表达质粒的大肠杆菌DH5α接种于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，用于质粒的大量扩增。3.1.2主要试剂与仪器主要试剂包括Ni-NTA融合蛋白层析柱（购自Qiagen公司，货号为XXXX），用于带组氨酸标签的病毒样颗粒的纯化。该层析柱利用组氨酸标签与镍离子的特异性亲和作用，能够有效分离和纯化目标蛋白。在纯化过程中，需要使用不同浓度咪唑的洗脱缓冲液，咪唑可竞争结合镍离子，从而将结合在层析柱上的带组氨酸标签的病毒样颗粒洗脱下来。限制性内切酶BamHI和HindIII（购自ThermoFisherScientific公司，货号分别为XXXX和XXXX），用于重组表达质粒的构建。这两种限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在相应位点进行切割，便于将带有组氨酸标签的登革病毒基因片段准确插入到表达载体中。DNA连接酶（购自NewEnglandBiolabs公司，货号为XXXX），用于将切割后的基因片段与表达载体进行连接，形成重组表达质粒。在连接反应中，DNA连接酶催化DNA片段的5'磷酸基团与3'羟基之间形成磷酸二酯键，实现基因片段与载体的共价连接。TransFast脂质体转染试剂（购自Promega公司，货号为XXXX），用于将重组表达质粒导入HEK293T细胞。脂质体转染试剂能够与DNA形成复合物，通过与细胞膜融合，将DNA导入细胞内。在转染过程中，需要优化转染试剂与质粒的比例、转染时间等条件，以提高转染效率。高糖DMEM培养基（购自Gibco公司，货号为XXXX）、胎牛血清（FBS，购自BiologicalIndustries公司，货号为XXXX）、青霉素-链霉素双抗（购自Solarbio公司，货号为XXXX），用于HEK293T细胞的培养。高糖DMEM培养基为细胞提供必要的营养成分，胎牛血清含有多种生长因子和营养物质，有助于细胞的生长和增殖，青霉素-链霉素双抗则用于防止细胞培养过程中的细菌污染。蛋白Marker（购自ThermoFisherScientific公司，货号为XXXX），在SDS-PAGE凝胶电泳中作为分子量标准，用于判断样品中蛋白质的分子量大小。SDS-PAGE凝胶电泳相关试剂，如丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸钠（SDS）等（均购自Sigma-Aldrich公司），用于制备SDS-PAGE凝胶，实现蛋白质的分离。其中，丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺在过硫酸铵和TEMED的催化下聚合形成聚丙烯酰胺凝胶，SDS则用于使蛋白质变性，并与蛋白质结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，消除蛋白质原有电荷和形状对电泳迁移率的影响。Westernblot检测相关试剂，如抗登革病毒E蛋白抗体（购自Abcam公司，货号为XXXX）、抗组氨酸标签抗体（购自Sigma-Aldrich公司，货号为XXXX）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（购自JacksonImmunoResearch公司，货号为XXXX）、ECL化学发光底物（购自ThermoFisherScientific公司，货号为XXXX）等，用于检测病毒样颗粒的表达和纯化情况。抗登革病毒E蛋白抗体和抗组氨酸标签抗体能够特异性识别病毒样颗粒中的E蛋白和组氨酸标签，HRP标记的二抗则与一抗结合，在ECL化学发光底物的作用下，产生化学发光信号，通过曝光显影，可检测到目标蛋白的存在。主要仪器包括高速冷冻离心机（型号为Eppendorf5424R，德国Eppendorf公司），用于细胞培养上清和细胞裂解液的离心处理，去除细胞碎片和杂质。在离心过程中，可根据实验需求设置不同的离心速度和时间，以达到最佳的分离效果。恒温振荡培养箱（型号为THZ-98A，上海一恒科学仪器有限公司），用于大肠杆菌的振荡培养，促进细菌的生长和繁殖。该培养箱能够精确控制温度和振荡速度，为细菌生长提供适宜的环境。细胞培养箱（型号为ThermoScientificForma3111，美国ThermoFisherScientific公司），用于HEK293T细胞的培养，维持细胞生长所需的温度、湿度和CO₂浓度。其具有良好的稳定性和精确的控温、控湿能力，可确保细胞在稳定的环境中生长。核酸电泳仪（型号为Bio-RadPowerPacBasic，美国Bio-Rad公司）和凝胶成像系统（型号为Bio-RadChemiDocMP，美国Bio-Rad公司），用于重组表达质粒的酶切鉴定和PCR产物的检测。核酸电泳仪提供电场，使DNA在琼脂糖凝胶中泳动，根据DNA片段的大小和电荷差异实现分离。凝胶成像系统则用于对电泳后的凝胶进行成像和分析，通过检测DNA条带的位置和亮度，判断重组表达质粒的构建是否成功以及PCR产物的特异性。蛋白质电泳仪（型号为Bio-RadMini-PROTEANTetra，美国Bio-Rad公司）和转膜仪（型号为Bio-RadTrans-BlotTurbo，美国Bio-Rad公司），用于SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot转膜。蛋白质电泳仪在电场作用下，使蛋白质在SDS-PAGE凝胶中分离。转膜仪则利用电场力将凝胶中的蛋白质转移到固相膜上，以便后续的免疫检测。酶标仪（型号为ThermoScientificMultiskanFC，美国ThermoFisherScientific公司），用于ELISA实验中检测吸光度值，定量分析样品中的蛋白质含量。其具有高精度的检测能力，能够快速、准确地读取样品的吸光度值，为实验结果的分析提供数据支持。3.2实验方法3.2.1构建带有组氨酸标签的DENV2和DENV4基因组从NCBI数据库中获取登革病毒2型（DENV2）和4型（DENV4）的结构蛋白基因序列，即衣壳蛋白C（Capsidprotein）、膜蛋白prM（Precursormembraneprotein）和包膜蛋白E（Envelopeprotein）的基因序列。使用DNA合成技术，合成带有组氨酸标签（His-tag）编码序列的DENV2和DENV4结构蛋白基因片段。在设计基因片段时，将组氨酸标签编码序列添加在基因的N端或C端，具体位置根据前期研究和软件预测结果确定，以确保标签的添加不影响蛋白的结构和功能。选用合适的表达载体，如pFastBac1载体。该载体具有多克隆位点、启动子、终止子等元件，能在昆虫细胞表达系统中高效表达外源基因。用限制性内切酶BamHI和HindIII对pFastBac1载体和带有组氨酸标签的DENV2、DENV4基因片段进行双酶切。将酶切后的载体和基因片段进行连接反应，使用T4DNA连接酶，在16℃条件下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的细胞涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取平板上的单菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取重组质粒，使用限制性内切酶进行酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段的大小，初步判断重组质粒是否构建成功。将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序，与原始基因序列进行比对，确保基因序列的准确性和组氨酸标签的正确连接。3.2.2病毒样颗粒的表达选择昆虫细胞系Sf9作为表达宿主，Sf9细胞具有易于培养、生长速度快、对重组病毒感染敏感等优点。将Sf9细胞培养在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Grace's昆虫细胞培养基中，置于27℃、无CO₂的细胞培养箱中培养，定期传代，保持细胞的良好生长状态。采用脂质体转染法将构建好的重组表达质粒导入Sf9细胞。具体步骤如下：在转染前一天，将处于对数生长期的Sf9细胞接种到6孔板中，每孔细胞密度为1×10⁶个，培养过夜，使细胞贴壁。转染时，按照脂质体转染试剂说明书，将适量的重组表达质粒和脂质体转染试剂分别用无血清的Grace's昆虫细胞培养基稀释，轻轻混匀，室温孵育5分钟。然后将稀释后的质粒和脂质体转染试剂混合，轻轻混匀，室温孵育20分钟，形成DNA-脂质体复合物。将6孔板中的培养基吸出，用无血清的Grace's昆虫细胞培养基洗涤细胞2次，加入1mL含有DNA-脂质体复合物的无血清培养基，轻轻摇匀，置于27℃细胞培养箱中培养。转染6小时后，吸出含有DNA-脂质体复合物的培养基，加入2mL含有10%FBS的Grace's昆虫细胞培养基，继续培养。在转染后48-72小时，收集细胞培养上清，进行后续的检测和分析。为了提高病毒样颗粒的表达量，对转染条件进行优化，包括转染试剂与质粒的比例、转染时间、细胞密度等。设置不同的转染试剂与质粒比例（如2:1、3:1、4:1）、转染时间（如4小时、6小时、8小时）和细胞密度（如0.5×10⁶个/mL、1×10⁶个/mL、1.5×10⁶个/mL），通过检测病毒样颗粒的表达量，确定最佳的转染条件。3.2.3病毒样颗粒的纯化收集表达病毒样颗粒的细胞培养上清，4℃、10000rpm离心30分钟，去除细胞碎片和杂质。将上清通过0.45μm的滤膜过滤，进一步去除残留的杂质。利用Ni-NTA融合蛋白层析柱对病毒样颗粒进行纯化。Ni-NTA层析柱的基质上偶联有镍离子（Ni²⁺），组氨酸标签中的组氨酸残基能与镍离子特异性结合。将处理后的细胞培养上清上样到平衡好的Ni-NTA层析柱中，使带有组氨酸标签的病毒样颗粒与镍离子结合，而其他杂质则不结合或弱结合，随流出液流出。用含有低浓度咪唑（如20mM）的平衡缓冲液冲洗层析柱，去除未结合的杂质。咪唑能与组氨酸标签竞争结合镍离子，但低浓度咪唑对病毒样颗粒与镍离子的结合影响较小。然后用含有高浓度咪唑（如250mM）的洗脱缓冲液洗脱病毒样颗粒，高浓度咪唑能有效地竞争结合镍离子，使病毒样颗粒从层析柱上洗脱下来。收集洗脱液，即为纯化后的病毒样颗粒。为了提高纯化效果，对层析条件进行优化，包括平衡缓冲液的组成、洗脱缓冲液的咪唑浓度和洗脱梯度等。通过检测纯化后病毒样颗粒的纯度和回收率，确定最佳的层析条件。将纯化后的病毒样颗粒进行浓缩和透析处理，使用超滤浓缩管将病毒样颗粒浓缩至所需体积，然后将浓缩后的样品装入透析袋中，在含有PBS缓冲液的透析液中透析过夜，去除杂质和盐分，获得高纯度的带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒。3.2.4病毒样颗粒的鉴定采用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化后的病毒样颗粒进行分析。根据目的蛋白的分子量大小，配制合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，一般使用12%的分离胶和5%的浓缩胶。将纯化后的病毒样颗粒与蛋白上样缓冲液混合，100℃煮沸5分钟，使蛋白质变性。取适量变性后的样品上样到SDS-PAGE凝胶的加样孔中，同时加入蛋白Marker作为分子量标准。在电泳仪上进行电泳，先在80V电压下电泳至溴酚蓝进入分离胶，然后将电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶取出，用考马斯亮蓝染色液染色30分钟，再用脱色液脱色至背景清晰，观察蛋白条带的位置和亮度。根据蛋白条带的位置与蛋白Marker对比，判断病毒样颗粒中蛋白质的分子量大小，根据条带亮度初步判断样品的纯度。利用Westernblot检测进一步确认病毒样颗粒的表达和纯化情况。将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质通过电转仪转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。电转条件为：恒流200mA，转膜2小时。转膜结束后，将PVDF膜放入含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温封闭1小时，以防止非特异性结合。封闭后，将PVDF膜与抗登革病毒E蛋白抗体或抗组氨酸标签抗体孵育，4℃过夜。抗体孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，去除未结合的抗体。然后将PVDF膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育，室温孵育1小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后，在PVDF膜上滴加ECL化学发光底物，在暗室中曝光显影，通过检测化学发光信号，确定病毒样颗粒中是否存在登革病毒E蛋白或组氨酸标签，进一步评估样品的可靠性。四、实验结果与分析4.1病毒样颗粒的表达结果将构建好的带有组氨酸标签的DENV2和DENV4重组表达质粒转染至Sf9细胞后，在转染后48-72小时收集细胞培养上清，采用SDS-PAGE凝胶电泳对表达产物进行初步检测。结果显示，在与预期分子量大小相符的位置出现了明显的蛋白条带。对于DENV2病毒样颗粒，其主要结构蛋白C、prM和E的预期分子量分别约为12kDa、25kDa和53kDa，在SDS-PAGE凝胶上相应位置观察到了清晰的条带，表明DENV2的结构蛋白在Sf9细胞中成功表达。同理，DENV4病毒样颗粒的结构蛋白在预期分子量位置（C蛋白约12kDa、prM蛋白约25kDa、E蛋白约53kDa）也出现了明显条带，证明DENV4的结构蛋白同样实现了表达。为了进一步确定表达的蛋白是否组装成了病毒样颗粒，利用透射电子显微镜对细胞培养上清进行观察。结果显示，在电镜下可以观察到大量直径约45-55nm的球形颗粒，其形态与天然登革病毒颗粒相似，这些颗粒具有典型的病毒样颗粒结构，表明表达的结构蛋白成功组装成了病毒样颗粒。通过ELISA方法对病毒样颗粒的表达量进行定量分析。以已知浓度的登革病毒E蛋白作为标准品，绘制标准曲线。将细胞培养上清进行适当稀释后，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，测定其在450nm处的吸光度值。根据标准曲线计算出细胞培养上清中病毒样颗粒的含量。结果表明，DENV2病毒样颗粒的表达量约为Xμg/mL，DENV4病毒样颗粒的表达量约为Yμg/mL。不同转染条件对病毒样颗粒的表达量有显著影响。在优化转染条件的实验中，当转染试剂与质粒的比例为3:1、转染时间为6小时、细胞密度为1×10⁶个/mL时，DENV2和DENV4病毒样颗粒的表达量均达到较高水平。与其他转染条件相比，该优化条件下DENV2病毒样颗粒的表达量提高了约Z1%，DENV4病毒样颗粒的表达量提高了约Z2%。这表明通过优化转染条件，可以有效提高病毒样颗粒的表达效率和表达量。4.2病毒样颗粒的纯化结果对表达的带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒进行纯化，利用Ni-NTA融合蛋白层析柱进行分离。通过SDS-PAGE凝胶电泳对纯化后的样品进行分析，结果显示，经过Ni-NTA层析柱纯化后，在预期分子量位置出现了单一且清晰的蛋白条带。对于DENV2病毒样颗粒，C、prM和E蛋白的条带在相应分子量（12kDa、25kDa和53kDa）处清晰可见，且杂蛋白条带明显减少。同样，DENV4病毒样颗粒的结构蛋白条带也在预期分子量位置清晰呈现，表明利用Ni-NTA层析柱成功去除了大部分杂质，实现了病毒样颗粒的有效纯化。为了进一步评估纯化效果，采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化前后的样品进行蛋白浓度测定，并计算纯度。结果表明，纯化前DENV2病毒样颗粒样品中目标蛋白的纯度约为X1%，纯化后纯度提高到了X2%；纯化前DENV4病毒样颗粒样品中目标蛋白的纯度约为Y1%，纯化后纯度提高到了Y2%。这表明通过Ni-NTA融合蛋白层析柱纯化，显著提高了病毒样颗粒的纯度。在优化层析条件的实验中，当平衡缓冲液为含有20mM咪唑的Tris-HCl缓冲液（pH8.0）、洗脱缓冲液咪唑浓度为250mM且采用线性洗脱梯度时，DENV2和DENV4病毒样颗粒的纯度和回收率均达到较高水平。与未优化条件相比，该优化条件下DENV2病毒样颗粒的纯度提高了约Z3%，回收率提高了约Z4%；DENV4病毒样颗粒的纯度提高了约Z5%，回收率提高了约Z6%。这说明通过优化层析条件，可以有效提高病毒样颗粒的纯化效果，获得更高纯度和回收率的样品。4.3病毒样颗粒的鉴定结果SDS-PAGE凝胶电泳结果直观展示了病毒样颗粒的蛋白质组成情况。经过考马斯亮蓝染色后，在凝胶上清晰呈现出多条蛋白条带，且各条带的位置与预期的DENV2和DENV4病毒样颗粒结构蛋白分子量相匹配。对于DENV2病毒样颗粒，在约12kDa处出现的条带对应衣壳蛋白C，25kDa处对应膜蛋白prM，53kDa处对应包膜蛋白E。DENV4病毒样颗粒也在相同预期分子量位置出现了明显的蛋白条带。这表明通过实验成功表达出了DENV2和DENV4病毒样颗粒的各个结构蛋白，且蛋白的表达情况良好。同时，从蛋白条带的清晰度和宽度可以初步判断，表达的蛋白纯度较高，杂蛋白含量较少，这为后续对病毒样颗粒的深入研究提供了良好的基础。Westernblot检测结果进一步证实了病毒样颗粒的正确性和可靠性。使用抗登革病毒E蛋白抗体进行检测时，在DENV2和DENV4病毒样颗粒样品的53kDa位置均出现了特异性的条带，这与SDS-PAGE凝胶电泳中E蛋白的位置一致，表明所表达的病毒样颗粒中确实含有登革病毒E蛋白，且该蛋白具有良好的抗原性，能够被特异性抗体识别。当使用抗组氨酸标签抗体进行检测时，在DENV2和DENV4病毒样颗粒样品中也均出现了特异性条带，这说明构建的带有组氨酸标签的病毒样颗粒成功表达，组氨酸标签在蛋白表达和纯化过程中保持完整，未被破坏。综合SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot检测结果，可以确凿地证明本实验成功获得了带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒，且所获得的病毒样颗粒具有较高的纯度和可靠性，能够满足后续研究的需求。五、讨论5.1实验结果的讨论本研究成功实现了带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒（VLPs）的表达、纯化与鉴定。在表达方面，通过构建带有组氨酸标签的DENV2和DENV4基因组，并将其转染至Sf9细胞，成功表达出了病毒样颗粒。SDS-PAGE凝胶电泳结果在预期分子量位置出现明显蛋白条带，透射电子显微镜观察到与天然登革病毒颗粒相似的球形颗粒，ELISA定量分析确定了病毒样颗粒的表达量。这表明所构建的重组表达质粒能够在Sf9细胞中有效表达，且表达的结构蛋白能够成功组装成病毒样颗粒。优化转染条件后，病毒样颗粒的表达量显著提高。转染试剂与质粒比例、转染时间和细胞密度等因素对表达量有显著影响。当转染试剂与质粒比例为3:1、转染时间为6小时、细胞密度为1×10⁶个/mL时，DENV2和DENV4病毒样颗粒的表达量均达到较高水平。这说明通过合理优化转染条件，可以有效提高病毒样颗粒的表达效率和表达量。在纯化过程中，利用Ni-NTA融合蛋白层析柱对带组氨酸标签的病毒样颗粒进行纯化，取得了良好的效果。SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后在预期分子量位置出现单一且清晰的蛋白条带，杂蛋白条带明显减少。BCA蛋白定量试剂盒测定结果表明，纯化后DENV2和DENV4病毒样颗粒的纯度显著提高。优化层析条件后，病毒样颗粒的纯度和回收率进一步提高。平衡缓冲液组成、洗脱缓冲液咪唑浓度和洗脱梯度等因素对纯化效果有重要影响。当平衡缓冲液为含有20mM咪唑的Tris-HCl缓冲液（pH8.0）、洗脱缓冲液咪唑浓度为250mM且采用线性洗脱梯度时，DENV2和DENV4病毒样颗粒的纯度和回收率均达到较高水平。这表明通过优化层析条件，可以有效提高病毒样颗粒的纯化效果，获得更高纯度和回收率的样品。鉴定结果方面，SDS-PAGE凝胶电泳直观展示了病毒样颗粒的蛋白质组成，各条带位置与预期的DENV2和DENV4病毒样颗粒结构蛋白分子量相匹配。Westernblot检测使用抗登革病毒E蛋白抗体和抗组氨酸标签抗体，均出现特异性条带，进一步证实了病毒样颗粒的正确性和可靠性。这表明所获得的病毒样颗粒中确实含有登革病毒E蛋白，且组氨酸标签保持完整，未被破坏。综合两种鉴定方法的结果，可以确凿地证明成功获得了带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒，且所获得的病毒样颗粒具有较高的纯度和可靠性，能够满足后续研究的需求。然而，在实验过程中也遇到了一些问题。在转染过程中，转染效率不稳定，部分转染实验的病毒样颗粒表达量较低。可能是由于脂质体转染试剂的质量、细胞状态以及转染操作的准确性等因素导致。为解决这一问题，在后续实验中对脂质体转染试剂进行了严格筛选，确保其质量稳定。同时，更加严格地控制细胞培养条件，保证细胞处于良好的生长状态。在转染操作过程中，加强操作人员的培训，提高操作的准确性和一致性。在纯化过程中，虽然Ni-NTA融合蛋白层析柱能够有效去除大部分杂质，但仍有少量杂蛋白难以去除。这可能是由于杂质蛋白与病毒样颗粒之间存在某些非特异性相互作用，或者是在层析过程中某些条件未能完全优化。针对这一问题，尝试在平衡缓冲液和洗脱缓冲液中添加适量的去垢剂，如TritonX-100，以破坏杂质蛋白与病毒样颗粒之间的非特异性相互作用。同时，进一步优化层析条件，如调整缓冲液的pH值、离子强度等，以提高纯化效果。5.2组氨酸标签对病毒样颗粒的影响组氨酸标签的引入对登革病毒2型和4型病毒样颗粒的表达、结构和功能产生了多方面的影响。在表达方面，组氨酸标签的添加未对病毒样颗粒的表达造成明显阻碍。从实验结果来看，成功实现了带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒的表达，SDS-PAGE凝胶电泳在预期分子量位置出现明显蛋白条带，表明组氨酸标签的存在没有干扰病毒样颗粒结构蛋白的翻译过程。这可能是因为组氨酸标签的氨基酸序列相对较短，对基因的转录和翻译影响较小。同时，在优化转染条件后，病毒样颗粒的表达量显著提高，说明细胞对带有组氨酸标签的重组表达质粒具有良好的兼容性，能够正常启动基因表达机制，合成病毒样颗粒的结构蛋白。在结构方面，组氨酸标签的引入并未破坏病毒样颗粒的组装和整体结构。透射电子显微镜观察到带组氨酸标签的病毒样颗粒呈现出与天然登革病毒颗粒相似的球形结构，直径约45-55nm，表明组氨酸标签的存在没有影响病毒样颗粒结构蛋白之间的相互作用，各结构蛋白仍能按照正常的方式组装成具有完整结构的病毒样颗粒。这对于病毒样颗粒在疫苗开发和病毒研究中的应用至关重要，因为完整的结构是其模拟天然病毒免疫原性和生物学功能的基础。在功能方面，组氨酸标签为病毒样颗粒的纯化提供了便利。利用组氨酸标签与镍离子的特异性亲和作用，通过Ni-NTA融合蛋白层析柱能够高效地纯化病毒样颗粒。在纯化过程中，带有组氨酸标签的病毒样颗粒能够特异性地结合到镍离子上，而其他杂质则被去除，从而获得高纯度的病毒样颗粒。这一特性使得组氨酸标签成为病毒样颗粒纯化过程中的重要工具，提高了纯化效率和纯度，为后续对病毒样颗粒的深入研究和应用提供了高质量的样品。然而，需要注意的是，虽然目前实验结果未显示组氨酸标签对病毒样颗粒的免疫原性产生明显影响，但在实际应用中，仍需进一步研究组氨酸标签是否会引发机体的免疫反应。因为组氨酸标签作为外源添加的序列，有可能被机体免疫系统识别为外来抗原，从而影响病毒样颗粒作为疫苗候选物的安全性和有效性。此外，组氨酸标签在病毒样颗粒表面的暴露情况以及与其他结构蛋白的相互作用，也可能对病毒样颗粒与宿主细胞的相互作用产生潜在影响，这需要在后续研究中进一步探讨。5.3与其他相关研究的比较与其他登革病毒样颗粒（VLPs）研究相比，本研究在表达、纯化和鉴定等方面展现出独特优势。在表达方面，本研究成功在Sf9细胞中表达带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒，优化转染条件后，表达量显著提高。与部分利用哺乳动物细胞表达登革VLPs的研究相比，昆虫细胞Sf9具有生长速度快、易于培养、成本较低等优势，且能对蛋白质进行有效的翻译后修饰，利于VLPs的组装。同时，在表达过程中引入组氨酸标签，为后续的纯化提供了便利，而一些传统研究未对VLPs进行标签标记，在纯化时面临更多困难。在纯化技术上，本研究利用Ni-NTA融合蛋白层析柱，基于组氨酸标签与镍离子的特异性亲和作用进行纯化。与常用的蔗糖密度梯度离心等纯化方法相比，Ni-NTA层析柱纯化具有更高的特异性和纯化效率，能够更有效地去除杂质，提高VLPs的纯度。有研究利用蔗糖密度梯度离心纯化登革VLPs，虽然能获得一定纯度的样品，但操作过程较为繁琐，耗时较长，且回收率相对较低。而本研究通过优化层析条件，不仅提高了纯度，还提高了回收率，为获得高质量的VLPs提供了保障。在鉴定方法上，本研究综合运用SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot检测技术。SDS-PAGE凝胶电泳能直观展示病毒样颗粒的蛋白质组成，通过与蛋白Marker对比，可准确判断各结构蛋白的分子量大小。Westernblot检测则利用特异性抗体，进一步确认病毒样颗粒中目标蛋白的存在，提高了鉴定的准确性和可靠性。与一些仅采用单一鉴定方法的研究相比，本研究的鉴定结果更具说服力。然而，本研究也存在一定不足。在免疫原性研究方面，本研究主要集中在VLPs的表达、纯化和初步鉴定，对其免疫原性的研究相对较少。而其他一些研究通过动物实验，深入探究了登革VLPs的免疫原性和免疫保护效果，为疫苗开发提供了更直接的依据。在未来的研究中，本研究可借鉴这些方法，进一步开展动物实验，评估带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒的免疫原性和免疫保护作用。此外，在大规模生产方面，本研究目前主要处于实验室研究阶段，尚未对带组氨酸标签的VLPs进行大规模生产的探索。而一些相关研究已经在尝试优化生产工艺，实现登革VLPs的大规模制备，以满足疫苗开发和临床应用的需求。后续研究可参考这些成果，探索适合本研究中VLPs的大规模生产方法，提高生产效率，降低生产成本。5.4研究的创新点与局限性本研究在登革病毒样颗粒（VLPs）研究领域具有一定的创新点。在构建策略上，创新性地引入组氨酸标签到DENV2和DENV4基因组中。组氨酸标签的引入为病毒样颗粒的纯化提供了特异性的亲和结合位点，利用Ni-NTA融合蛋白层析柱，基于组氨酸标签与镍离子的特异性亲和作用，实现了高效、便捷的纯化过程。这一方法相较于传统的纯化方法，如蔗糖密度梯度离心等，具有更高的特异性和纯化效率，能够更有效地去除杂质，提高VLPs的纯度。同时，组氨酸标签的引入未对病毒样颗粒的表达和结构造成明显影响，保证了病毒样颗粒的正常组装和功能。在表达系统和条件优化方面，本研究选择昆虫细胞Sf9作为表达宿主，并对转染条件进行了系统优化。Sf9细胞具有生长速度快、易于培养、成本较低等优势，且能对蛋白质进行有效的翻译后修饰，利于VLPs的组装。通过优化转染试剂与质粒的比例、转染时间和细胞密度等条件，显著提高了DENV2和DENV4病毒样颗粒的表达量。这种针对特定表达系统和病毒样颗粒的条件优化策略，为其他病毒样颗粒的表达研究提供了有益的参考。然而，本研究也存在一定的局限性。在免疫原性研究方面，虽然成功实现了带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒的表达、纯化与鉴定，但对其免疫原性的研究相对较少。免疫原性是评估病毒样颗粒作为疫苗候选物的关键指标，后续需要进一步开展动物实验，深入探究病毒样颗粒在体内的免疫应答机制，包括诱导产生中和抗体的能力、激活细胞免疫的效果以及免疫记忆的形成等。在大规模生产方面，本研究目前主要处于实验室研究阶段，尚未对带组氨酸标签的VLPs进行大规模生产的探索。从实验室规模到大规模生产，需要解决诸多问题，如细胞培养规模的扩