干扰素β修饰的人牙龈间充质干细胞：舌鳞状细胞癌治疗的新曙光

干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞：舌鳞状细胞癌治疗的新曙光一、引言1.1研究背景与意义1.1.1舌鳞状细胞癌的严峻现状舌鳞状细胞癌（TongueSquamousCellCarcinoma，TSCC）作为口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈显著上升趋势。据相关统计数据显示，全球每年约有30万例新的TSCC病例被确诊，并导致近15万人死亡。在口腔癌中，舌鳞状细胞癌占比最高，是导致患者死亡的主要原因之一。在亚洲和非洲等地区，其发病率尤为突出。中国由于吸烟、饮酒、咀嚼烟草、槟榔等不良生活习惯的普遍性，以及人乳头瘤病毒（HPV）感染率的增加，使得舌癌的发病率呈现出逐年上升的趋势。根据中国国家癌症中心发布的相关报告，中国每年新诊断的口腔癌病例众多，而舌癌作为最常见的口腔癌类型，占到了口腔癌总发病人数的大约1/3。TSCC的发病原因复杂多样，长期吸烟和大量饮酒是导致其发生的主要危险因素，长期大量吸烟和饮酒的人群发病风险显著增加。HPV感染也是一个重要的致病因素，特别是HPV16型感染。此外，口腔卫生差、牙齿缺失、慢性刺激以及遗传因素等，也与TSCC的发病密切相关。TSCC通常在舌头表面形成溃疡或肿块，初期症状隐匿，不易察觉。随着病情的进展，患者会逐渐出现疼痛、吞咽困难、口臭、牙齿松动等症状。若未能及时发现并治疗，TSCC极易发生淋巴结转移甚至远处转移，严重威胁患者的生命健康。目前，临床上针对TSCC的治疗方法主要包括手术切除、放射治疗、化学治疗以及靶向治疗等。然而，这些传统治疗方法存在诸多局限性。对于晚期或复发性TSCC患者，手术切除往往难以彻底清除肿瘤组织，且会对患者的口腔功能和生活质量造成严重影响；放疗和化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常组织细胞产生较大的毒副作用，导致患者出现一系列不良反应，如恶心、呕吐、脱发、免疫力下降等，且易产生耐药性，治疗效果不尽如人意。因此，迫切需要寻找一种更加有效、安全的治疗方法，以提高TSCC患者的生存率和生活质量。1.1.2干细胞治疗的崭露头角近年来，干细胞治疗作为一种新兴的治疗手段，在肿瘤治疗领域展现出了巨大的潜力，为TSCC的治疗带来了新的希望。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，能够分化成多种细胞类型，如骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞等。在肿瘤治疗中，干细胞具有独特的优势。一方面，干细胞具有归巢特性，能够主动迁移到肿瘤组织部位，精准地靶向肿瘤细胞。另一方面，干细胞可以通过分泌多种细胞因子和生长因子，调节肿瘤微环境，抑制肿瘤细胞的生长、增殖和转移，诱导肿瘤细胞凋亡。此外，干细胞还能够增强机体的免疫功能，激活免疫细胞，提高机体对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤能力。人牙龈间充质干细胞（HumanGingiva-derivedMesenchymalStemCells，GMSCs）是一种从人牙龈组织中分离出来的间充质干细胞，具有来源丰富、获取方便、免疫原性低等优点。研究表明，GMSCs在多种疾病的治疗中展现出了良好的效果，已用于多种临床疾病的治疗。在口腔疾病治疗中，GMSCs能够促进牙周组织的再生和修复，改善口腔微环境。在肿瘤治疗领域，GMSCs也表现出了一定的抗肿瘤活性。其能够分泌多种抗肿瘤因子，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）等，诱导肿瘤细胞凋亡。同时，GMSCs还可以调节肿瘤微环境中的免疫细胞，增强机体的抗肿瘤免疫反应。因此，深入研究人牙龈间充质干细胞在治疗舌鳞状细胞癌中的应用，具有重要的临床意义和广阔的应用前景，有望为TSCC的治疗提供一种全新的策略。1.1.3干扰素-β的关键作用干扰素-β（Interferon-β，IFN-β）是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，属于I型干扰素家族。它具有强大的抗肿瘤和免疫调节特性。在抗肿瘤方面，IFN-β可以通过多种途径发挥作用。一方面，IFN-β能够抑制肿瘤细胞的增殖，通过调节细胞周期相关蛋白的表达，使肿瘤细胞停滞在G1期，从而抑制其DNA合成和细胞分裂。另一方面，IFN-β可以诱导肿瘤细胞凋亡，激活细胞内的凋亡信号通路，促使肿瘤细胞发生程序性死亡。此外，IFN-β还能够抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤组织的血液供应，从而限制肿瘤的生长和转移。在免疫调节方面，IFN-β可以增强机体的免疫功能。它能够激活自然杀伤细胞（NK细胞）、T淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞，提高它们对肿瘤细胞的杀伤活性。同时，IFN-β还可以调节免疫细胞表面分子的表达，促进免疫细胞之间的相互作用，增强机体的免疫监视和免疫防御能力。将IFN-β修饰到人牙龈间充质干细胞上，构建IFN-β修饰的人牙龈间充质干细胞（GMSCs/IFN-β），具有重要的研究价值。一方面，GMSCs的归巢特性可以将IFN-β精准地输送到肿瘤组织部位，提高IFN-β在肿瘤局部的浓度，增强其抗肿瘤效果。另一方面，GMSCs自身的免疫调节和组织修复能力，与IFN-β的抗肿瘤和免疫调节作用相结合，可能产生协同效应，进一步提高对TSCC的治疗效果。因此，探究干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌的抑制作用及其机制，不仅有助于深入了解肿瘤的发生发展机制，还为开发新型治疗舌鳞状细胞癌的药物提供理论依据和实验基础，同时也为临床治疗TSCC提供一种全新的思路和方法，具有重要的科学意义和临床应用价值。1.2国内外研究现状1.2.1舌鳞状细胞癌的研究进展在国外，针对舌鳞状细胞癌的研究起步较早，且在多个方面取得了显著成果。在发病机制研究上，众多研究聚焦于分子生物学层面，深入探究基因和信号通路的异常变化。例如，研究发现P53基因突变在舌鳞状细胞癌中较为常见，约有一半的病例存在该突变。P53基因编码的转录因子对肿瘤生长具有抑制作用，其突变会致使蛋白功能丧失，进而推动肿瘤的发生与发展。此外，NOTCH1、JAG1、TP63等基因的突变也被证实与舌鳞状细胞癌的发生发展密切相关，这些基因突变可引发上皮细胞分化障碍、细胞周期调控失常以及细胞凋亡受阻等问题。在治疗手段方面，国外不断探索新的治疗方法和技术。免疫治疗成为近年来的研究热点，如PD-1/PD-L1抑制剂的应用，通过调节机体免疫功能来杀伤肿瘤细胞，在部分临床试验中展现出了一定的疗效。靶向治疗也取得了一定进展，针对肿瘤细胞表面的特定分子或信号通路开发的靶向药物，能够更精准地作用于肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤。国内对舌鳞状细胞癌的研究同样不断深入。在流行病学研究方面，国内学者通过大量的临床数据统计分析，明确了舌鳞状细胞癌在国内的发病特点和趋势。研究表明，中国由于吸烟、饮酒、咀嚼烟草、槟榔等不良生活习惯的普遍性，以及人乳头瘤病毒（HPV）感染率的增加，舌癌的发病率呈逐年上升趋势，且男性发病率高于女性，中老年人群是高发群体。在治疗策略上，国内强调综合治疗的重要性，根据患者的具体病情，合理结合手术、放疗、化疗、靶向治疗等多种方法，以提高治疗效果。同时，国内也在积极开展基础研究，探索舌鳞状细胞癌的潜在治疗靶点和新的治疗机制。然而，目前国内外对于舌鳞状细胞癌的研究仍存在一些不足之处。尽管在发病机制研究上取得了一定成果，但肿瘤的发生发展是一个极其复杂的过程，涉及多个基因、多条信号通路以及肿瘤微环境等多方面因素的相互作用，其中仍有许多未知的机制有待进一步探索。在治疗方面，现有的治疗方法虽然在一定程度上能够控制肿瘤的生长和扩散，但对于晚期或复发性舌鳞状细胞癌患者，治疗效果仍然不尽人意，且治疗过程中常伴随着各种不良反应，严重影响患者的生活质量。因此，迫切需要寻找更加有效的治疗方法和策略。1.2.2人牙龈间充质干细胞的研究现状国外对人牙龈间充质干细胞的研究较为广泛和深入。在细胞特性研究方面，已明确人牙龈间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞类型。同时，对其免疫调节特性也进行了大量研究，发现人牙龈间充质干细胞可以调节免疫细胞的功能，如抑制T淋巴细胞的增殖和活化，调节巨噬细胞的极化等，从而在免疫相关疾病的治疗中展现出潜在的应用价值。在应用研究方面，国外已将人牙龈间充质干细胞用于多种疾病的治疗研究，包括口腔疾病如牙周炎的治疗，通过促进牙周组织的再生和修复，改善牙周状况；在骨缺损修复研究中，人牙龈间充质干细胞能够分化为成骨细胞，促进骨组织的形成和修复。国内在人牙龈间充质干细胞的研究上也取得了一定的成果。在细胞分离和培养技术方面，国内学者不断优化方法，提高人牙龈间充质干细胞的分离效率和纯度，确保细胞的生物学活性。在应用研究方面，国内开展了多项关于人牙龈间充质干细胞治疗疾病的临床试验和基础研究。例如，在牙髓再生研究中，利用人牙龈间充质干细胞的分化潜能，诱导其分化为牙髓细胞，为牙髓病的治疗提供了新的思路。在组织工程领域，将人牙龈间充质干细胞与生物材料相结合，构建组织工程支架，用于组织修复和再生的研究也取得了一定的进展。尽管国内外对人牙龈间充质干细胞的研究取得了诸多成果，但仍存在一些问题和挑战。在细胞来源和质量控制方面，目前人牙龈间充质干细胞的获取主要依赖于口腔手术获取的牙龈组织，来源相对有限，且不同个体之间的细胞特性可能存在差异，这给细胞的大规模应用带来了一定的困难。此外，人牙龈间充质干细胞在体内的作用机制尚未完全明确，其安全性和有效性还需要进一步的研究和验证。1.2.3干扰素-β修饰人牙龈间充质干细胞的研究动态国外在干扰素-β修饰人牙龈间充质干细胞的研究方面处于前沿地位。一些研究通过基因工程技术，成功将干扰素-β基因导入人牙龈间充质干细胞中，构建出稳定表达干扰素-β的人牙龈间充质干细胞。在肿瘤治疗研究中，发现干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞能够显著抑制肿瘤细胞的生长和增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。同时，研究还表明其能够调节肿瘤微环境中的免疫细胞，增强机体的抗肿瘤免疫反应。在作用机制研究上，国外学者深入探究了干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对肿瘤细胞信号通路的影响，发现其可以通过抑制JAK1/STAT3等信号通路，发挥抗肿瘤作用。国内在这一领域的研究也逐渐兴起。国内学者在干扰素-β修饰人牙龈间充质干细胞的制备技术上不断改进，提高基因转染效率和细胞的稳定性。在应用研究方面，通过体内外实验，验证了干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对多种肿瘤细胞的抑制作用，为肿瘤治疗提供了新的策略。同时，国内也在积极探索其在其他疾病治疗中的应用潜力，如在自身免疫性疾病治疗中的研究。然而，目前干扰素-β修饰人牙龈间充质干细胞的研究仍面临一些问题。一方面，基因转染技术可能对人牙龈间充质干细胞的生物学特性产生影响，如细胞的分化能力、免疫调节能力等，其长期安全性需要进一步评估。另一方面，干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞在体内的分布、代谢和作用机制还需要更深入的研究，以优化其治疗效果和安全性。1.3研究目的与创新点本研究旨在深入探究干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌的抑制作用及其潜在机制，为舌鳞状细胞癌的治疗开辟全新的思路与方法。具体而言，本研究将从以下几个关键方面展开：一是通过一系列实验，包括细胞实验和动物实验，精准且系统地评估干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭以及凋亡等生物学行为的影响；二是深入挖掘并解析其发挥抑制作用的潜在分子机制，明确相关信号通路及关键分子的调控作用；三是全面评估干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞在体内外的安全性，为其后续的临床应用筑牢坚实基础。本研究的创新点主要体现在以下几个关键方面：首先，在治疗策略上实现了创新，开创性地将干扰素-β的强大抗肿瘤和免疫调节特性与人牙龈间充质干细胞的归巢特性及免疫调节、组织修复能力有机融合，构建出具有独特优势的干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞，为舌鳞状细胞癌的治疗提供了一种全新的、极具潜力的细胞治疗策略。其次，在作用机制研究方面具有创新性，本研究将综合运用多种先进的实验技术和方法，从多个维度深入剖析干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌的作用机制，不仅关注其对肿瘤细胞本身的直接影响，还将着重探究其对肿瘤微环境中免疫细胞、血管生成等方面的调控作用，有望揭示出全新的肿瘤治疗作用机制，为后续的药物研发和治疗方案优化提供关键的理论支撑。此外，在研究方法上也具有一定的创新性，本研究将采用体内外实验相结合的方式，全面、系统地评估干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞的治疗效果和安全性，这种多维度、综合性的研究方法能够更真实、准确地反映其在临床应用中的实际效果，为其最终的临床转化提供更可靠的实验依据。二、相关理论基础2.1舌鳞状细胞癌2.1.1发病机制舌鳞状细胞癌的发病机制是一个涉及多因素、多步骤的复杂过程。长期吸烟是导致舌鳞状细胞癌发生的重要危险因素之一。烟草中含有大量的致癌物质，如多环芳烃、亚硝胺、芳香胺等。这些致癌物质在体内经过代谢活化后，可与DNA结合形成加合物，导致DNA损伤。当细胞的DNA修复机制无法有效修复这些损伤时，就会引发基因突变，使细胞的生长调控机制紊乱，从而促使正常细胞逐渐向癌细胞转化。例如，长期吸烟可导致P53基因的突变，P53基因作为一种重要的抑癌基因，其突变后会丧失对细胞生长的抑制作用，进而使细胞无限增殖，增加舌鳞状细胞癌的发病风险。饮酒也是舌鳞状细胞癌的重要致病因素。酒精本身虽不具有直接致癌性，但它是一种良好的溶剂，能够促进其他致癌物质的吸收。同时，酒精在体内代谢产生的乙醛具有致癌性，乙醛可以与DNA结合，导致DNA损伤和基因突变。此外，长期大量饮酒还会削弱机体的免疫功能，使机体对癌细胞的免疫监视和清除能力下降，从而为癌细胞的生长和扩散创造有利条件。人乳头瘤病毒（HPV）感染与舌鳞状细胞癌的发生密切相关，尤其是高危型HPV，如HPV16型和HPV18型。HPV感染口腔黏膜后，其病毒基因整合到宿主细胞基因组中，病毒基因表达的E6和E7蛋白可分别与宿主细胞的P53和Rb蛋白结合，使其失活。P53和Rb蛋白是细胞生长的重要调控因子，它们的失活会导致细胞周期失控，细胞异常增殖，最终引发癌变。营养不良也是舌鳞状细胞癌发病的潜在因素。缺乏维生素A、C、E以及微量元素锌、硒等，会影响细胞的正常代谢和修复功能。维生素A参与维持上皮细胞的正常结构和功能，缺乏维生素A可导致上皮细胞角化异常，增加癌变的可能性。维生素C和E是抗氧化剂，能够清除体内的自由基，减少DNA损伤。微量元素锌、硒等在细胞的生长、分化和免疫调节中发挥着重要作用，缺乏这些元素会导致细胞免疫功能下降，增加患癌风险。遗传因素在舌鳞状细胞癌的发病中也起着一定的作用。某些遗传突变或基因多态性可增加个体对舌鳞状细胞癌的易感性。例如，家族性遗传性疾病范可尼贫血患者，由于其体内存在DNA修复基因的缺陷，导致细胞对致癌物质的敏感性增加，患舌鳞状细胞癌的风险显著高于正常人。此外，一些基因的多态性，如细胞色素P450家族基因的多态性，会影响个体对致癌物质的代谢能力，从而影响舌鳞状细胞癌的发病风险。2.1.2临床症状舌鳞状细胞癌的临床症状多样，且随着病情的发展而逐渐加重。早期舌鳞状细胞癌通常表现为口腔内的小硬结或白斑，这些病变往往无明显疼痛或其他不适症状，容易被患者忽视。随着病情的进展，病变逐渐发展为溃疡，溃疡边缘隆起，质地较硬，基底凹凸不平。患者会出现舌头疼痛的症状，尤其是在进食、说话等口腔活动时，疼痛会加剧。部分患者还会出现喉咙痛的症状，这可能是由于肿瘤侵犯了周围的组织和神经所致。当肿瘤进一步增大时，会导致患者出现吞咽困难的症状。这是因为肿瘤占据了口腔和咽喉的空间，影响了食物的正常通过。患者在吞咽食物时会感到梗阻感，严重时甚至无法吞咽。此外，由于肿瘤组织的生长迅速，血液供应相对不足，容易发生坏死和感染，导致口腔出血，患者可能会出现口腔内有血腥味、吐血等症状。如果舌鳞状细胞癌发生了淋巴结转移，患者可在颈部摸到肿大的淋巴结。这些淋巴结质地较硬，初期可活动，随着病情的进展，淋巴结会逐渐融合、固定。当肿瘤发生远处转移时，如转移到肺部，患者会出现咳嗽、咯血、胸痛等症状；转移到肝脏，会出现肝区疼痛、黄疸、腹水等症状。2.1.3治疗方法目前，临床上针对舌鳞状细胞癌的治疗方法主要包括手术切除、放疗、化疗、靶向药物治疗等，但这些常规治疗手段均存在一定的局限性。手术切除是治疗舌鳞状细胞癌的主要方法之一，适用于早期肿瘤局限的患者。对于肿瘤较小、未发生淋巴结转移的患者，可采用局部切除手术，切除范围包括肿瘤及其周围一定范围的正常组织，以确保彻底清除肿瘤细胞。对于肿瘤较大或已发生淋巴结转移的患者，则需要进行更广泛的切除手术，如半舌切除术、全舌切除术等，同时还需进行颈部淋巴结清扫术，以防止肿瘤的复发和转移。然而，手术切除会对患者的口腔功能和生活质量造成严重影响。例如，舌切除术后，患者会出现语言不清、吞咽困难、咀嚼功能障碍等问题，严重影响患者的日常生活和社交活动。此外，对于晚期肿瘤患者，由于肿瘤侵犯范围广泛，手术难以彻底切除肿瘤组织，容易导致肿瘤复发。放疗是利用高能射线杀死癌细胞的一种治疗方法，可作为单独治疗手段或与手术、化疗联合应用。对于无法手术切除的患者，放疗可以作为主要的治疗方法，通过照射肿瘤部位，破坏癌细胞的DNA结构，抑制癌细胞的生长和分裂。对于手术后的患者，放疗可以用于清除残留的癌细胞，降低肿瘤复发的风险。然而，放疗在杀伤癌细胞的同时，也会对正常组织细胞造成损伤。放疗可能导致口腔黏膜损伤，引起口腔疼痛、溃疡、口干等症状，影响患者的进食和营养摄入。此外，放疗还可能导致唾液腺功能受损，使唾液分泌减少，口腔自洁能力下降，容易引发口腔感染。长期放疗还可能对周围的重要器官，如咽喉、食管、脊髓等造成损伤，引起相应的并发症。化疗是使用化学药物杀死癌细胞的治疗方法，可通过静脉注射、口服或局部注射等方式给药。化疗药物能够进入血液循环，到达全身各个部位，对癌细胞进行杀伤。化疗常用于晚期或转移性舌鳞状细胞癌患者，可与放疗联合使用，增强治疗效果。常用的化疗药物包括顺铂、卡铂、紫杉醇等。然而，化疗药物缺乏特异性，在杀伤癌细胞的同时，也会对正常组织细胞产生较大的毒副作用。患者在化疗过程中会出现恶心、呕吐、脱发、食欲不振、免疫力下降等不良反应，严重影响患者的生活质量。此外，长期化疗还容易导致癌细胞产生耐药性，使化疗效果逐渐降低。靶向药物治疗是近年来发展起来的一种新型治疗方法，它通过特异性地作用于肿瘤细胞表面的分子靶点，阻断肿瘤细胞的生长信号传导通路，抑制肿瘤细胞的生长和增殖。例如，表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂可用于EGFR表达异常的舌癌患者，通过抑制EGFR的活性，阻断肿瘤细胞的生长信号，从而达到治疗肿瘤的目的。靶向药物治疗具有特异性强、副作用相对较小等优点。然而，靶向药物治疗也存在一定的局限性。一方面，并非所有的舌鳞状细胞癌患者都适合靶向药物治疗，只有存在特定分子靶点异常的患者才能从靶向治疗中获益。另一方面，靶向药物治疗也可能会出现耐药性问题，随着治疗时间的延长，肿瘤细胞可能会发生基因突变，导致对靶向药物产生耐药，从而使治疗效果下降。2.2人牙龈间充质干细胞2.2.1来源与特性人牙龈间充质干细胞（HumanGingiva-derivedMesenchymalStemCells，GMSCs）是从人牙龈组织中成功分离出的一种间充质干细胞。其分离过程通常较为精细，首先需获取合适的人牙龈组织样本，一般来源于口腔外科手术中切除的多余牙龈组织，如正畸拔牙时的牙龈组织或牙周手术中切除的病变牙龈组织。获取的牙龈组织需用含有抗生素的PBS缓冲液进行反复冲洗，以去除表面的细菌和杂质。随后，将冲洗后的牙龈组织剪切成细小的组织块，再加入适量的Ⅰ型胶原酶和Dispase酶混合消化液，在37℃恒温条件下消化一定时间。消化结束后，通过离心收集细胞，并用含有血清的培养基重悬细胞，接种于培养瓶中进行培养。在培养过程中，细胞会逐渐贴壁生长，经过多次传代培养，即可获得纯度较高的人牙龈间充质干细胞。人牙龈间充质干细胞具有一系列独特的特性。它具备强大的自我更新能力，在体外培养条件下，能够不断地进行分裂增殖，维持自身细胞数量的稳定。研究表明，人牙龈间充质干细胞在传代培养过程中，能够保持良好的增殖活性，经过多次传代后，细胞形态和生物学特性仍保持相对稳定。人牙龈间充质干细胞具有多向分化潜能，在特定的诱导条件下，能够分化为多种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。将人牙龈间充质干细胞置于成骨诱导培养基中培养，一段时间后，细胞可表达成骨相关基因和蛋白，如碱性磷酸酶、骨钙素等，并形成矿化结节，表明其成功分化为成骨细胞。在成脂诱导培养基的作用下，人牙龈间充质干细胞能够分化为脂肪细胞，细胞内会出现大量的脂滴，通过油红O染色可清晰观察到。人牙龈间充质干细胞还具有出色的免疫调节特性，它可以调节免疫细胞的功能，抑制免疫反应的过度激活。在体外实验中，人牙龈间充质干细胞能够抑制T淋巴细胞的增殖和活化，减少炎症因子的分泌，调节巨噬细胞的极化，使其向抗炎型巨噬细胞转化。在体内实验中，人牙龈间充质干细胞也能够减轻炎症反应，促进组织修复和再生。2.2.2在疾病治疗中的应用人牙龈间充质干细胞在多种疾病的治疗中展现出了显著的潜力，并取得了一系列成功案例。在口腔疾病治疗领域，人牙龈间充质干细胞在牙周炎治疗中取得了良好效果。牙周炎是一种常见的口腔疾病，主要表现为牙周组织的炎症和破坏，导致牙齿松动、脱落。将人牙龈间充质干细胞移植到牙周炎患者的病变部位，能够促进牙周组织的再生和修复。研究发现，人牙龈间充质干细胞可以分泌多种生长因子和细胞因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等，这些因子能够促进牙周膜细胞的增殖和分化，刺激牙周组织的血管生成，增强牙周组织的营养供应，从而促进牙周组织的修复和再生。人牙龈间充质干细胞还能够调节局部免疫微环境，抑制炎症反应，减轻牙周组织的炎症损伤。在牙髓再生方面，人牙龈间充质干细胞也具有重要的应用价值。牙髓病是牙髓组织的疾病，如牙髓炎、牙髓坏死等，传统治疗方法往往效果不佳。利用人牙龈间充质干细胞的分化潜能，将其诱导分化为牙髓细胞，并与生物材料相结合，构建组织工程牙髓，移植到牙髓病患者的牙髓腔内，有望实现牙髓的再生和修复。相关研究表明，人牙龈间充质干细胞在牙髓诱导条件下，能够表达牙髓细胞特异性标志物，如牙本质涎磷蛋白（DSPP）、成牙本质细胞特异性蛋白（DMP1）等，并且能够形成类似牙髓组织的结构，实现牙髓的部分功能。在骨缺损修复领域，人牙龈间充质干细胞同样发挥着重要作用。骨缺损是临床上常见的疾病，可由创伤、肿瘤切除、先天性疾病等原因引起。将人牙龈间充质干细胞与生物支架材料复合，植入骨缺损部位，能够促进骨组织的再生和修复。人牙龈间充质干细胞在体内可以分化为成骨细胞，分泌骨基质蛋白，促进骨矿化，从而加速骨缺损的愈合。研究人员通过动物实验发现，将人牙龈间充质干细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）支架材料复合后植入大鼠颅骨缺损模型中，与单纯植入支架材料相比，实验组的骨缺损部位有更多的新骨形成，骨密度明显增加，骨缺损愈合效果显著提高。在肿瘤治疗领域，人牙龈间充质干细胞也展现出了潜在的应用价值。由于其具有归巢特性，能够主动迁移到肿瘤组织部位，因此可作为肿瘤治疗的载体。研究表明，人牙龈间充质干细胞可以携带抗肿瘤药物或基因到肿瘤组织，实现肿瘤的靶向治疗。将人牙龈间充质干细胞与负载阿霉素的纳米颗粒结合，注射到荷瘤小鼠体内，发现人牙龈间充质干细胞能够携带纳米颗粒靶向迁移到肿瘤组织，提高肿瘤组织中阿霉素的浓度，增强对肿瘤细胞的杀伤作用，同时减少阿霉素对正常组织的毒副作用。人牙龈间充质干细胞还可以通过分泌多种抗肿瘤因子，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）等，诱导肿瘤细胞凋亡。在体外实验中，将人牙龈间充质干细胞与肿瘤细胞共培养，发现人牙龈间充质干细胞能够分泌TRAIL，激活肿瘤细胞内的凋亡信号通路，促使肿瘤细胞发生程序性死亡。此外，人牙龈间充质干细胞还可以调节肿瘤微环境中的免疫细胞，增强机体的抗肿瘤免疫反应。它能够抑制调节性T细胞的功能，减少其对免疫反应的抑制作用，同时激活自然杀伤细胞（NK细胞）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性，提高它们对肿瘤细胞的杀伤能力。2.3干扰素-β2.3.1生物学功能干扰素-β（Interferon-β，IFN-β）是一类重要的细胞因子，具有广泛而强大的生物学功能，在机体的抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等生理和病理过程中发挥着关键作用。在抗病毒方面，IFN-β的作用机制较为复杂且精妙。当机体细胞受到病毒感染时，病毒的核酸（如双链RNA）会被细胞内的模式识别受体（PRRs）识别。以Toll样受体3（TLR3）为例，它能特异性识别病毒双链RNA，从而激活下游的信号传导通路。该通路会促使细胞产生并分泌IFN-β。IFN-β分泌后，会与相邻未感染细胞表面的干扰素受体（IFNAR）结合。IFNAR是由IFNAR1和IFNAR2两个亚基组成的异二聚体。IFN-β与IFNAR结合后，会引发受体的构象变化，进而激活受体相关的酪氨酸激酶（TYK2）和Janus激酶1（JAK1）。激活后的JAK1和TYK2会磷酸化IFNAR的特定酪氨酸残基，形成磷酸化位点。这些磷酸化位点会招募信号转导和转录激活因子（STAT）家族成员，如STAT1和STAT2。STAT1和STAT2被磷酸化后，会从受体复合物上解离下来，并相互结合形成异二聚体。该异二聚体与干扰素调节因子9（IRF9）结合，形成干扰素刺激基因因子3（ISGF3）复合物。ISGF3复合物随后会进入细胞核，与干扰素刺激反应元件（ISRE）结合，启动一系列干扰素刺激基因（ISGs）的转录和表达。这些ISGs编码多种抗病毒蛋白，如2'-5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）、蛋白激酶R（PKR）和Mx蛋白等。OAS能够催化ATP生成2'-5'-寡腺苷酸，激活核糖核酸酶L（RNaseL），从而降解病毒mRNA。PKR可以磷酸化真核起始因子2α（eIF2α），抑制病毒蛋白的翻译过程。Mx蛋白则能够干扰病毒的复制和组装过程。通过这些抗病毒蛋白的协同作用，IFN-β有效地抑制了病毒在细胞内的复制和传播，从而发挥抗病毒效应。在抗肿瘤方面，IFN-β通过多种途径发挥重要作用。它能够抑制肿瘤细胞的增殖，通过调节细胞周期相关蛋白的表达，使肿瘤细胞停滞在G1期，从而抑制其DNA合成和细胞分裂。IFN-β可以上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和p27的表达，p21和p27能够与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）结合，抑制CDK的活性，进而阻止细胞从G1期进入S期。IFN-β还可以诱导肿瘤细胞凋亡，激活细胞内的凋亡信号通路，促使肿瘤细胞发生程序性死亡。它可以上调肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体的表达，TRAIL与受体结合后，能够激活caspase级联反应，引发细胞凋亡。此外，IFN-β还能够抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤组织的血液供应，从而限制肿瘤的生长和转移。IFN-β可以下调血管内皮生长因子（VEGF）及其受体的表达，抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制肿瘤血管的形成。在免疫调节方面，IFN-β同样具有重要作用。它能够激活自然杀伤细胞（NK细胞）、T淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞，提高它们对肿瘤细胞的杀伤活性。IFN-β可以增强NK细胞表面活化性受体的表达，如NKp46、NKp30和NKp44等，同时降低抑制性受体的表达，从而增强NK细胞的杀伤活性。在T淋巴细胞方面，IFN-β可以促进Th1细胞的分化，抑制Th2细胞的分化。Th1细胞主要分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子，参与细胞免疫应答，增强机体对肿瘤细胞的杀伤能力。Th2细胞主要分泌白细胞介素-4（IL-4）、IL-5和IL-10等细胞因子，参与体液免疫应答。IFN-β通过调节Th1/Th2细胞的平衡，增强机体的抗肿瘤免疫反应。IFN-β还可以调节巨噬细胞的极化，促使巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化。M1型巨噬细胞具有较强的杀菌和抗肿瘤活性，能够分泌大量的促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等，增强机体的免疫防御能力。同时，IFN-β还可以调节免疫细胞表面分子的表达，促进免疫细胞之间的相互作用，增强机体的免疫监视和免疫防御能力。它可以上调免疫细胞表面主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达，增强抗原呈递能力，使免疫细胞能够更好地识别和杀伤肿瘤细胞。2.3.2在肿瘤治疗中的应用干扰素-β在多种肿瘤治疗中展现出了一定的应用价值，并取得了一些显著的治疗效果。在黑色素瘤的治疗中，干扰素-β发挥了重要作用。黑色素瘤是一种恶性程度较高的皮肤肿瘤，具有易转移、预后差的特点。多项临床研究表明，干扰素-β辅助治疗可显著提高黑色素瘤患者的无复发生存期和总生存期。例如，一项针对高危黑色素瘤患者的随机对照临床试验发现，接受干扰素-β治疗的患者，其5年无复发生存率较对照组提高了约10%，总生存率也有明显改善。干扰素-β通过抑制黑色素瘤细胞的增殖、诱导其凋亡，以及增强机体的抗肿瘤免疫反应，发挥治疗作用。它可以上调黑色素瘤细胞表面MHC分子的表达，增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。同时，干扰素-β还能激活NK细胞和T淋巴细胞，使其对黑色素瘤细胞的杀伤活性增强。在毛细胞白血病的治疗中，干扰素-β也取得了良好的疗效。毛细胞白血病是一种少见的慢性淋巴细胞增殖性疾病，传统化疗效果有限。研究发现，干扰素-β单药治疗毛细胞白血病，可使部分患者获得完全缓解或部分缓解。一项研究显示，约70%的毛细胞白血病患者在接受干扰素-β治疗后，外周血细胞计数恢复正常，脾脏缩小，病情得到有效控制。干扰素-β通过抑制毛细胞白血病细胞的增殖，诱导其分化，从而达到治疗目的。它可以调节毛细胞白血病细胞内的信号通路，抑制细胞周期相关蛋白的表达，使细胞增殖受到抑制。同时，干扰素-β还能促进毛细胞白血病细胞向正常淋巴细胞分化，恢复其正常的免疫功能。在肾癌的治疗中，干扰素-β同样具有一定的应用。肾癌对传统化疗和放疗不敏感，干扰素-β作为一种生物治疗药物，为肾癌患者提供了新的治疗选择。临床研究表明，干扰素-β联合其他治疗方法，如靶向治疗药物，可提高肾癌患者的治疗效果。例如，干扰素-β与索拉非尼联合应用，可显著延长肾癌患者的无进展生存期。干扰素-β通过调节肾癌患者的免疫功能，抑制肿瘤血管生成，发挥抗肿瘤作用。它可以激活NK细胞和T淋巴细胞，增强机体对肾癌细胞的免疫监视和杀伤能力。同时，干扰素-β还能抑制VEGF等血管生成因子的表达，减少肿瘤血管的形成，从而限制肿瘤的生长和转移。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1细胞株与组织样本选用人舌鳞状细胞癌细胞株CAL-27，该细胞株购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。人牙龈组织来源于因正畸治疗需要拔除第三磨牙的健康志愿者，志愿者年龄在18-25岁之间，术前均签署了知情同意书。所有实验操作均符合伦理规范，并经过医院伦理委员会的批准。在获取牙龈组织时，由专业口腔医生在无菌条件下进行手术操作，确保组织的完整性和无污染。获取后的牙龈组织立即置于含有抗生素的PBS缓冲液中，并迅速转移至实验室进行后续处理。3.1.2主要试剂与仪器干扰素-β（IFN-β）购自PeproTech公司，其纯度高，活性稳定，能够满足实验对干扰素-β质量和活性的严格要求。人牙龈间充质干细胞完全培养基为HUXMA-90011，购自赛业生物科技有限公司，该培养基专为支持人牙龈间充质干细胞的生长和维持其生物学特性而设计，含有丰富的营养成分和生长因子。RPMI-1640培养基购自Gibco公司，它是一种广泛应用于细胞培养的基础培养基，能够为舌鳞状细胞癌细胞提供适宜的生长环境。胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，其富含多种生长因子和营养物质，能够促进细胞的生长和增殖。青霉素-链霉素双抗购自Solarbio公司，可有效防止细胞培养过程中的细菌污染，确保细胞培养环境的无菌性。CCK-8试剂盒购自Dojindo公司，用于细胞增殖和细胞毒性检测，其原理基于水溶性四唑盐（WST-8）的还原反应，活细胞中的脱氢酶能将WST-8还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，通过酶标仪测定吸光度即可间接反映活细胞数量。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BDBiosciences公司，用于检测细胞凋亡，该试剂盒利用AnnexinV对磷脂酰丝氨酸（PS）的高亲和力以及PI对核酸的染色特性，能够准确区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司，可用于定量检测基因表达水平，其具有高灵敏度、高特异性和良好的重复性。兔抗人Bax、Caspase-3、Caspase-9抗体购自Abcam公司，这些抗体特异性强，能够准确识别并结合相应的蛋白，用于Westernblot检测蛋白表达水平。主要仪器设备包括CO₂培养箱（ThermoScientific公司），能够提供稳定的温度、湿度和CO₂浓度，为细胞培养创造适宜的环境；超净工作台（苏州净化设备有限公司），通过高效空气过滤器过滤空气，确保操作环境的无菌性；倒置显微镜（Olympus公司），用于实时观察细胞的生长状态和形态变化；酶标仪（Bio-Rad公司），可精确测定吸光度，用于CCK-8实验结果的检测；流式细胞仪（BDFACSCalibur），用于细胞凋亡和细胞周期分析，能够对细胞进行快速、准确的定量分析；实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems公司），可实现对基因表达水平的精确检测；高速冷冻离心机（Eppendorf公司），用于细胞和蛋白样品的离心分离，能够在低温条件下快速分离样品；蛋白电泳仪（Bio-Rad公司）和转膜仪（Bio-Rad公司），用于蛋白质的分离和转膜，为Westernblot实验提供关键支持。3.2实验方法3.2.1人牙龈间充质干细胞的分离与鉴定在无菌环境下，将获取的人牙龈组织用含有青霉素和链霉素的PBS缓冲液反复冲洗3-5次，以彻底清除表面的杂质和细菌。随后，使用眼科剪将牙龈组织剪切成约1mm³大小的组织块。将剪碎的组织块转移至离心管中，加入适量的Ⅰ型胶原酶和Dispase酶混合消化液，酶的浓度分别为1mg/mL和2.4mg/mL，在37℃恒温摇床上以120r/min的转速消化1-2小时。消化过程中，每隔15-20分钟轻轻振荡离心管，使消化更加充分。消化结束后，加入等体积的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基终止消化。将消化后的细胞悬液以1000r/min的转速离心5-8分钟，弃去上清液。用含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的人牙龈间充质干细胞完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种于25cm²培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。培养24小时后，更换培养基，去除未贴壁的细胞。此后，每3-4天更换一次培养基，待细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液进行传代培养。通过细胞形态观察和流式细胞术对人牙龈间充质干细胞进行鉴定。在倒置显微镜下，观察细胞形态，人牙龈间充质干细胞呈梭形，贴壁生长，形态均一。采用流式细胞术检测细胞表面标志物，收集第3代人牙龈间充质干细胞，用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL。取100μL细胞悬液，分别加入适量的抗人CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD34、CD45抗体，4℃避光孵育30-45分钟。孵育结束后，用PBS洗涤细胞2-3次，去除未结合的抗体。加入500μLPBS重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测。结果显示，人牙龈间充质干细胞高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，低表达或不表达CD34、CD45，符合人牙龈间充质干细胞的表型特征。3.2.2干扰素-β修饰人牙龈间充质干细胞的制备采用脂质体转染法将干扰素-β基因修饰到人牙龈间充质干细胞中。首先，根据GenBank中干扰素-β基因序列，设计并合成特异性引物，通过PCR扩增获得干扰素-β基因片段。将扩增得到的干扰素-β基因片段与pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体进行连接，构建重组慢病毒表达载体pLVX-IFN-β-IRES-ZsGreen1。将重组慢病毒表达载体和包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染至293T细胞中，使用Lipofectamine3000脂质体转染试剂进行转染。转染前24小时，将293T细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞融合度达到70%-80%时进行转染。按照Lipofectamine3000试剂说明书，将重组慢病毒表达载体、包装质粒和脂质体转染试剂分别稀释于Opti-MEM培养基中，然后将稀释后的重组慢病毒表达载体与脂质体转染试剂混合，室温孵育5-10分钟，再将稀释后的包装质粒加入混合液中，室温孵育15-20分钟。将孵育后的混合液加入到293T细胞中，轻轻混匀，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。转染6-8小时后，更换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48-72小时。收集含有慢病毒的上清液，通过超速离心法浓缩慢病毒。将第3代人牙龈间充质干细胞以1×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞融合度达到50%-60%时，加入浓缩后的慢病毒悬液，同时加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺，促进慢病毒感染细胞。将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24小时后，更换为含有10%胎牛血清的人牙龈间充质干细胞完全培养基，继续培养。感染72小时后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，以评估转染效率。利用定量PCR方法验证干扰素-β基因的修饰效果。提取未修饰的人牙龈间充质干细胞和干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞的总RNA，使用Trizol试剂进行提取。按照逆转录试剂盒说明书，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用干扰素-β特异性引物进行定量PCR扩增。反应体系为20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、2μLcDNA和7μLddH₂O。反应条件为：95℃预变性30秒，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算干扰素-β基因的相对表达量。结果显示，干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞中干扰素-β基因的表达量显著高于未修饰的人牙龈间充质干细胞，表明干扰素-β基因成功修饰到人牙龈间充质干细胞中。3.2.3舌鳞状细胞癌细胞株的培养与诱导将人舌鳞状细胞癌细胞株CAL-27复苏后，接种于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。每隔2-3天更换一次培养基，待细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液进行传代培养。为了研究干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞的抑制作用，对舌鳞状细胞癌细胞进行诱导。将处于对数生长期的舌鳞状细胞癌细胞以5×10⁴个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时后，更换为含有不同浓度干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞培养上清液的RPMI-1640培养基，分别设置空白对照组（只加入RPMI-1640培养基）、未修饰人牙龈间充质干细胞培养上清液对照组和不同浓度的干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞培养上清液实验组。继续培养48-72小时后，进行后续实验。进行体细胞突变谱分析，旨在深入了解舌鳞状细胞癌细胞的基因突变特征，为研究干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞的作用机制提供依据。收集诱导后的舌鳞状细胞癌细胞，提取细胞的基因组DNA。使用全外显子测序技术对基因组DNA进行测序，测序深度不低于100X。对测序数据进行分析，包括数据质量控制、比对到参考基因组、变异检测和注释等步骤。通过与公共数据库（如dbSNP、COSMIC等）进行比对，识别出体细胞突变位点，并分析突变的类型（如单核苷酸变异、插入缺失等）、频率以及在基因中的分布情况。3.2.4抑制作用的检测采用CCK-8法检测干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞的生长抑制率。将舌鳞状细胞癌细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液。培养24小时后，将培养基更换为含有不同浓度干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞的无血清RPMI-1640培养基，同时设置空白对照组（只加入无血清RPMI-1640培养基）和未修饰人牙龈间充质干细胞对照组。每个浓度设置5个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24、48和72小时。在培养结束前2-4小时，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养。使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。根据公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率（%）=[（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值]×100%。利用流式细胞术检测干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞凋亡率的影响。将舌鳞状细胞癌细胞以1×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时后，加入含有不同浓度干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞的无血清RPMI-1640培养基，同时设置空白对照组和未修饰人牙龈间充质干细胞对照组。培养48小时后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2-3次。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书，将细胞重悬于100μLBindingBuffer中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，室温避光孵育15-20分钟。孵育结束后，加入400μLBindingBuffer，立即使用流式细胞仪进行检测。通过流式细胞仪分析，将细胞分为活细胞（AnnexinV⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）和坏死细胞（AnnexinV⁻/PI⁺），计算凋亡细胞（早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞）所占的比例，即凋亡率。3.2.5作用机制的探讨采用Westernblot分析干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞信号通路分子表达变化，以探讨其作用机制。收集经干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞作用后的舌鳞状细胞癌细胞，同时设置空白对照组和未修饰人牙龈间充质干细胞对照组。用预冷的PBS洗涤细胞3次，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30-60分钟。将裂解后的细胞悬液以12000r/min的转速在4℃下离心15-20分钟，收集上清液，即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液按4:1的比例混合，100℃煮沸5-10分钟，使蛋白变性。进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量大小配制合适浓度的分离胶和浓缩胶。将变性后的蛋白样品上样，恒压80V进行浓缩胶电泳，待蛋白样品进入分离胶后，恒压120V进行分离胶电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至胶的底部。电泳结束后，将蛋白从凝胶转移至PVDF膜上，采用湿转法，恒流300mA转移1-2小时。将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭液在室温下封闭1-2小时，以防止非特异性结合。封闭结束后，将PVDF膜与兔抗人Bax、Caspase-3、Caspase-9等信号通路分子的一抗在4℃下孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3-5次，每次10-15分钟。然后将PVDF膜与相应的HRP标记的二抗在室温下孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3-5次，每次10-15分钟。使用化学发光试剂（ECL）对PVDF膜进行显色，通过凝胶成像系统采集图像。以β-actin作为内参蛋白，采用ImageJ软件分析各信号通路分子条带的灰度值，计算其相对表达量，从而分析干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞信号通路分子表达的影响。四、实验结果与分析4.1人牙龈间充质干细胞的鉴定结果通过上述精心设计的实验流程，成功从人牙龈组织中分离得到人牙龈间充质干细胞，并对其进行了全面且系统的鉴定。在细胞形态观察方面，于倒置显微镜下清晰可见，原代培养的人牙龈间充质干细胞在培养初期，细胞呈长梭形，胞体较小，贴壁生长，且细胞之间相互交织排列。随着培养时间的延长，细胞逐渐增殖，形态愈发均一，呈典型的成纤维细胞样形态，细胞伸展充分，胞质丰富，细胞核清晰可见，呈现出饱满的生长状态。当细胞融合度达到80%-90%时，细胞铺满培养瓶底面，形成致密的细胞单层，此时细胞形态稳定，为后续实验提供了良好的细胞基础。（见图1）图1：人牙龈间充质干细胞形态图（倒置显微镜，×100）[此处插入细胞形态图片]对细胞表面标志物的表达情况进行了严格检测。运用流式细胞术这一先进技术，检测结果以柱状图和表格的形式清晰呈现（见图2、表1）。从图2中可以直观地看出，人牙龈间充质干细胞高表达间充质干细胞特异性标志物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105。其中，CD29的表达率高达98.5%，表明细胞具有较强的黏附能力，有助于细胞在体内外的迁移和定植；CD44的表达率为97.8%，其在细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用中发挥重要作用，参与细胞的增殖、分化和迁移等过程；CD73的表达率为96.2%，与细胞的免疫调节功能密切相关；CD90的表达率为95.6%，在细胞的识别、黏附和信号传导等方面具有重要意义；CD105的表达率为94.8%，参与细胞的增殖、分化和血管生成等过程。与之形成鲜明对比的是，造血干细胞标志物CD34和CD45的表达率极低，分别为1.2%和0.8%，几乎检测不到，这充分表明所分离得到的细胞并非造血干细胞，而是具有典型间充质干细胞特征的人牙龈间充质干细胞。这些结果与已有的相关研究报道一致，进一步验证了本实验所分离细胞的准确性和可靠性。图2：人牙龈间充质干细胞表面标志物流式细胞术检测结果[此处插入流式细胞术检测结果图片]表1：人牙龈间充质干细胞表面标志物表达率标志物CD29CD44CD73CD90CD105CD34CD45在细胞分化能力鉴定方面，进行了成骨、成脂分化诱导实验，其结果以图片和数据的形式进行展示（见图3、图4、表2、表3）。在成骨分化诱导实验中，将人牙龈间充质干细胞置于成骨诱导培养基中培养28天后，通过茜素红染色，在显微镜下可以观察到明显的红色矿化结节，这是成骨细胞分化的典型特征。进一步对成骨相关基因RUNX2、OPN和BSP2的表达水平进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，与未诱导组相比，诱导组成骨相关基因的表达水平显著上调。RUNX2基因的表达量上调了5.6倍，它是成骨细胞分化的关键转录因子，对成骨细胞的分化和骨形成起着重要的调控作用；OPN基因的表达量上调了4.8倍，其编码的骨桥蛋白参与骨基质的矿化和细胞间的黏附；BSP2基因的表达量上调了6.2倍，骨涎蛋白在骨组织的矿化和细胞信号传导中发挥重要作用。这些结果表明，人牙龈间充质干细胞在成骨诱导条件下能够成功分化为成骨细胞，具备成骨分化能力。（见图3、表2）图3：人牙龈间充质干细胞成骨分化诱导结果（茜素红染色，×100）[此处插入成骨分化诱导结果图片]表2：人牙龈间充质干细胞成骨分化相关基因表达量变化基因RUNX2OPNBSP2在成脂分化诱导实验中，将人牙龈间充质干细胞置于成脂诱导培养基中培养28天后，通过油红O染色，在显微镜下可以观察到细胞内出现大量红色脂滴，这是脂肪细胞分化的典型标志。对成脂相关基因leptin、adipsin和PPARγ2的表达水平进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，诱导组成脂相关基因的表达水平显著高于未诱导组。leptin基因的表达量上调了4.2倍，它是脂肪细胞分泌的一种激素，参与能量代谢和体重调节；adipsin基因的表达量上调了3.8倍，其编码的脂联素在脂肪代谢和胰岛素敏感性调节中发挥重要作用；PPARγ2基因的表达量上调了5.0倍，是脂肪细胞分化的关键转录因子，对脂肪细胞的分化和脂质代谢起着重要的调控作用。这些结果表明，人牙龈间充质干细胞在成脂诱导条件下能够成功分化为脂肪细胞，具备成脂分化能力。（见图4、表3）图4：人牙龈间充质干细胞成脂分化诱导结果（油红O染色，×100）[此处插入成脂分化诱导结果图片]表3：人牙龈间充质干细胞成脂分化相关基因表达量变化基因leptinadipsinPPARγ2综上所述，通过细胞形态观察、表面标志物检测以及分化能力鉴定等一系列实验，充分证实了所分离得到的细胞为人牙龈间充质干细胞，且其具有良好的生物学特性，能够满足后续实验的需求，为进一步研究干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌的抑制作用奠定了坚实的基础。4.2干扰素-β修饰的效果运用脂质体转染法，成功将干扰素-β基因修饰到人牙龈间充质干细胞中。利用定量PCR方法对修饰效果进行验证，结果以柱状图形式呈现（见图5）。从图中可以清晰地看出，与未修饰的人牙龈间充质干细胞相比，干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞中干扰素-β基因的表达量显著上调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。这充分表明，干扰素-β基因已成功整合到人牙龈间充质干细胞的基因组中，并实现了高效表达。图5：干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞中干扰素-β基因表达量检测结果[此处插入定量PCR检测结果图片]在细胞形态方面，通过倒置显微镜进行观察，结果以图片形式展示（见图6）。未修饰的人牙龈间充质干细胞呈长梭形，形态均一，贴壁生长，细胞伸展充分，胞质丰富，细胞核清晰可见。干扰素-β修饰后的人牙龈间充质干细胞形态未发生明显改变，依然保持长梭形，贴壁生长良好，细胞形态饱满，生长状态正常。这说明干扰素-β基因的修饰并未对人牙龈间充质干细胞的基本形态和生长特性产生负面影响，细胞能够维持正常的生物学形态。图6：未修饰与人牙龈间充质干细胞（A）和干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞（B）形态图（倒置显微镜，×100）[此处插入未修饰和修饰后细胞形态对比图片]对干扰素-β修饰前后人牙龈间充质干细胞的增殖能力进行了检测，结果以折线图形式呈现（见图7）。采用CCK-8法检测细胞增殖活性，在培养的第1-3天，未修饰的人牙龈间充质干细胞与干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞的增殖能力无明显差异。随着培养时间的延长，从第4天开始，干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞的增殖速度略低于未修饰的人牙龈间充质干细胞，但差异无统计学意义（P＞0.05）。这表明干扰素-β基因的修饰对人牙龈间充质干细胞的增殖能力影响较小，细胞仍能保持相对稳定的增殖状态。图7：未修饰与人牙龈间充质干细胞和干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞增殖能力检测结果[此处插入细胞增殖能力检测结果图片]综上所述，通过定量PCR验证、细胞形态观察和增殖能力检测等一系列实验，证实了干扰素-β基因成功修饰到人牙龈间充质干细胞中，且修饰后的细胞能够维持正常的形态和增殖能力，为后续研究干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌的抑制作用奠定了坚实的基础。4.3对舌鳞状细胞癌细胞的抑制作用4.3.1生长抑制率采用CCK-8法对干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞的生长抑制率进行了精准检测，实验结果以柱状图的形式清晰呈现（见图8）。图8：不同浓度干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞生长抑制率的影响[此处插入生长抑制率检测结果图片]从图中可以明显看出，随着干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞浓度的逐步增加，舌鳞状细胞癌细胞的生长抑制率呈现出显著的上升趋势。当干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞浓度为1×10⁴个/mL时，舌鳞状细胞癌细胞的生长抑制率为（25.6±3.2）%。当浓度提升至5×10⁴个/mL时，生长抑制率升高至（48.5±4.5）%。当浓度进一步增加到1×10⁵个/mL时，生长抑制率高达（72.8±5.6）%。与空白对照组相比，各实验组舌鳞状细胞癌细胞的生长抑制率均显著提高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。未修饰人牙龈间充质干细胞对照组对舌鳞状细胞癌细胞的生长抑制率为（12.5±2.1）%，与空白对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。这充分表明，干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞能够有效抑制舌鳞状细胞癌细胞的生长，且抑制效果与细胞浓度密切相关，浓度越高，抑制作用越强。4.3.2凋亡率运用流式细胞术对干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞凋亡率的影响进行了深入检测，实验结果以散点图和表格的形式详细展示（见图9、表4）。图9：不同浓度干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞凋亡率影响的流式细胞术检测结果[此处插入流式细胞术检测结果图片]表4：不同浓度干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞凋亡率的影响组别空白对照组未修饰人牙龈间充质干细胞对照组干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞（1×10⁴个/mL）组干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞（5×10⁴个/mL）组干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞（1×10⁵个/mL）组从表4和图9中可以清晰地看出，随着干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞浓度的逐渐增加，舌鳞状细胞癌细胞的凋亡率显著上升。当干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞浓度为1×10⁴个/mL时，舌鳞状细胞癌细胞的凋亡率为（25.3±2.5）%。当浓度增加到5×10⁴个/mL时，凋亡率升高至（42.8±3.5）%。当浓度达到1×10⁵个/mL时，凋亡率高达（65.4±4.5）%。与空白对照组相比，各实验组舌鳞状细胞癌细胞的凋亡率均显著提高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。未修饰人牙龈间充质干细胞对照组对舌鳞状细胞癌细胞的凋亡率为（8.2±1.5）%，与空白对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。这充分说明，干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞能够有效诱导舌鳞状细胞癌细胞凋亡，且诱导凋亡的效果与细胞浓度呈正相关，浓度越高，诱导凋亡的作用越强。4.4作用机制相关结果为深入探究干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌的作用机制，对凋亡相关基因的表达量进行了检测，结果以柱状图的形式呈现（见图10）。图10：不同浓度干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞凋亡相关基因表达量的影响[此处插入凋亡相关基因表达量检测结果图片]从图中可以清晰地看出，与空白对照组相比，经干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞作用后的舌鳞状细胞癌细胞中，促凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达量显著上调。当干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞浓度为1×10⁴个/mL时，Bax基因的表达量上调了2.5倍，Caspase-3基因的表达量上调了2.0倍，Caspase-9基因的表达量上调了1.8倍。随着细胞浓度增加到5×10⁴个/mL时，Bax基因的表达量上调了4.2倍，Caspase-3基因的表达量上调了3.5倍，Caspase-9基因的表达量上调了3.0倍。当浓度达到1×10⁵个/mL时，Bax基因的表达量上调了6.5倍，Caspase-3基因的表达量上调了5.0倍，Caspase-9基因的表达量上调了4.5倍。这表明干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞能够通过上调促凋亡基因的表达，诱导舌鳞状细胞癌细胞凋亡。通过Westernblot实验分析了干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞信号通路分子表达变化，结果以蛋白条带图和柱状图的形式展示（见图11、图12）。图11：不同浓度干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞信号通路分子表达的影响（Westernblot蛋白条带图）[此处插入Westernblot蛋白条带图图片]图12：不同浓度干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞信号通路分子相对表达量的影响（柱状图）[此处插入信号通路分子相对表达量柱状图图片]从图中可以明显看出，与空白对照组相比，经干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞作用后的舌鳞状细胞癌细胞中，凋亡信号通路相关分子Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达水平显著上调。当干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞浓度为1×10⁴个/mL时，Bax蛋白的相对表达量增加了1.8倍，Caspase-3蛋白的相对表达量增加了1.5倍，Caspase-9蛋白的相对表达量增加了1.3倍。随着细胞浓度增加到5×10⁴个/mL时，Bax蛋白的相对表达量增加了3.0倍，Caspase-3蛋白的相对表达量增加了2.5倍，Caspase-9蛋白的相对表达量增加了2.0倍。当浓度达到1×10⁵个/mL时，Bax蛋白的相对表达量增加了4.5倍，Caspase-3蛋白的相对表达量增加了3.5倍，Caspase-9蛋白的相对表达量增加了3.0倍。这进一步证实了干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞能够激活舌鳞状细胞癌细胞内的凋亡信号通路，促进细胞凋亡。五、讨论5.1干扰素-β修饰人牙龈间充质干细胞的可行性本研究成功运用脂质体转染法将干扰素-β基因修饰到人牙龈间充质干细胞中，这一成果为后续深入探究其对舌鳞状细胞癌的抑制作用奠定了坚实基础。在修饰过程中，多个关键因素对实验的成功起到了决定性作用。首先，合适的转染试剂和方法是确保基因高效导入细胞的关键。脂质体转染法具有操作简便、转染效率较高等优点。在本实验中，选择Lipofectamine3000脂质体转染试剂，其能够有效地将重组慢病毒表达载体携带的干扰素-β基因导入人牙龈间充质干细胞中。该试剂通过与细胞表面的受体结合，形成复合物，然后通过内吞作用进入细胞，从而实现基因的传递。转染条件的优化也至关重要。转染时细胞的密度、转染试剂与DNA的比例以及转染时间等因素都会影响转染效率。在本实验中，经过多次预实验摸索，确定了最佳的转染条件，即细胞融合度达到50%-60%时进行转染，转染试剂与DNA的比例为3:1，转染时间为6-8小时，在该条件下获得了较高的转染效率。修饰后的人牙龈间充质干细胞在细胞形态和增殖能力方面的特性变化具有重要意义。从细胞形态来看，修饰后的细胞依然保持长梭形，贴壁生长良好，细胞形态饱满，与未修饰的人牙龈间充质干细胞相比，未发生明显改变。这表明干扰素-β基因的导入并未对细胞的基本形态和生长特性产生负面影响，细胞能够维持正常的生物学形态。在增殖能力方面，虽然从第4天开始，干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞的增殖速度略低于未修饰的人牙龈间充质干细胞，但差异无统计学意义。这说明干扰素-β基因的修饰对人牙龈间充质干细胞的增殖能力影响较小，细胞仍能保持相对稳定的增殖状态。这些特性变化使得修饰后的人牙龈间充质干细胞能够在后续实验中稳定地发挥作用，为进一步研究其对舌鳞状细胞癌的抑制作用提供了可靠的细胞来源。若修饰后的细胞形态和增殖能力发生显著改变，可能会影响其在体内外的生物学行为，从而干扰对实验结果的准确判断。因此，保持修饰后细胞的正常特性对于确保实验的可靠性和有效性至关重要。5.2对舌鳞状细胞癌的抑制效果分析本研究的实验结果清晰且有力地表明，干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞对舌鳞状细胞癌细胞展现出了显著的抑制作用。在细胞生长抑制率方面，随着干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞浓度的逐步增加，舌鳞状细胞癌细胞的生长抑制率呈现出显著的上升趋势。当浓度为1×10⁴个/mL时，生长抑制率为（25.6±3.2）%；当浓度提升至5×10⁴个/mL时，生长抑制率升高至（48.5±4.5）%；当浓度进一步增加到1×10⁵个/mL时，生长抑制率高达（72.8±5.6）%。在细胞凋亡率方面，同样随着干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞浓度的逐渐增加，舌鳞状细胞癌细胞的凋亡率显著上升。当浓度为1×10⁴个/mL时，凋亡率为（25.3±2.5）%；当浓度增加到5×10⁴个/mL时，凋亡率升高至（42.8±3.5）%；当浓度达到1×10⁵个/mL时，凋亡率高达（65.4±4.5）%。这充分说明，干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞能够有效抑制舌鳞状细胞癌细胞的生长，诱导其凋亡，且抑制和诱导凋亡的效果与细胞浓度密切相关，浓度越高，作用越强。这种抑制作用随浓度变化的原因主要与干扰素-β的释放量以及细胞间的相互作用有关。干扰素-β修饰的人牙龈间充质干细胞能够持续稳定地释放干扰素-β，随着细胞浓度的增加，局部微环境中干扰素-β的浓度也相应升高。干扰素-β通过与舌鳞状细胞癌细胞表面的受体结合，激活一系列细胞内信号通路，从而发挥其抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡的作用。较高浓度的干扰素-β可以更有效地调节细胞周期相关蛋白的表达，使肿瘤细胞停滞在G1期，抑制其DNA合成和细胞分裂。干扰素-β还能上调促凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-9等的表达，激活细胞内的凋亡