平卧菊三七酚类化合物的提取、分离及体外功效探究

平卧菊三七酚类化合物的提取、分离及体外功效探究一、引言1.1研究背景与意义在传统医学与现代医学不断交融发展的进程中，植物药凭借其丰富的活性成分和多样的药理作用，日益成为研究的焦点。平卧菊三七（Gynuraprocumbens(Lour.)Merr）作为一种在东南亚地区广泛分布且具有悠久药用历史的植物，近年来备受关注。在我国，平卧菊三七被称为神仙草、续命草，广泛分布于广东、江西、海南、贵州等地，攀援于灌木或乔木上。《中华本草》记载，其味辛、微苦、性凉，具备消炎散热、活血化瘀、消肿止痛、护肝解毒以及治疗跌打损伤等功效。现代医学研究也表明，平卧菊三七在癌症、高血压以及糖尿病等多种疾病的治疗中展现出潜在价值，且其叶可食用，在东南亚国家常被作为茶和蔬菜，我国国家卫生健康委员会于2012年批准其为新型食品资源。酚类化合物作为植物中一类重要的次生代谢产物，广泛存在于平卧菊三七的根、茎、叶中。研究显示，平卧菊三七中的酚类化合物在根部含量最高，达25.96mgGAE/g，叶中约为22.5mgGAE/g，茎中最低，约17.8mgGAE/g。通过硅胶、SephadexLH-20、反相ODS等技术，已从平卧菊三七全草中分离出对羟基苯甲酸、4-氨基肉桂酸、3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯等多种酚类化合物。这些酚类化合物不仅结构多样，而且具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性，在医药、食品、化妆品等领域展现出广阔的应用前景。从医药角度来看，氧化应激和炎症反应与众多疾病的发生发展密切相关。抗氧化剂能够清除体内过多的自由基，减轻氧化损伤，对预防和治疗心血管疾病、神经退行性疾病、癌症等具有重要意义；抗炎物质则可抑制炎症因子的释放，减轻炎症反应，缓解炎症相关疾病的症状。目前，虽然合成抗氧化剂和抗炎药物在临床上广泛应用，但存在一定的副作用。而植物来源的天然酚类化合物具有安全、低毒等优势，有望成为新型药物或功能食品的活性成分。对平卧菊三七中酚类化合物进行提取分离，并深入研究其体外抗氧化和抗炎功效，能够为开发治疗相关疾病的天然药物提供理论依据和物质基础。在食品领域，随着消费者对健康食品的需求不断增加，天然抗氧化剂和抗炎成分在食品保鲜和功能食品开发中的应用越来越受到重视。将平卧菊三七中的酚类化合物应用于食品中，不仅可以延长食品的保质期，还能赋予食品一定的保健功能，满足消费者对健康与美味的双重追求，具有显著的经济价值和市场潜力。从学术研究层面而言，尽管目前对平卧菊三七的研究已取得一定进展，但对其酚类化合物的研究仍不够系统和深入。不同产地、生长环境和提取方法对酚类化合物的种类和含量影响的研究尚不充分，酚类化合物的结构鉴定和生物活性作用机制的研究也有待进一步加强。深入开展平卧菊三七中酚类化合物的研究，有助于丰富植物化学的研究内容，完善植物活性成分的研究体系，为其他植物资源的开发利用提供借鉴和参考。本研究旨在提取分离平卧菊三七中的酚类化合物，并对其体外抗氧化和抗炎功效进行系统研究。通过优化提取分离工艺，提高酚类化合物的提取率和纯度；利用现代分析技术对酚类化合物的结构进行鉴定；采用多种体外实验模型评价其抗氧化和抗炎活性，并初步探讨其作用机制。本研究成果不仅能为平卧菊三七的进一步开发利用提供科学依据，推动其在医药、食品等领域的应用，还能为植物活性成分的研究提供新的思路和方法，具有重要的理论意义和实践价值。1.2研究目的本研究旨在深入探究平卧菊三七中酚类化合物，通过科学系统的实验设计和先进的分析技术，实现以下具体目标：高效提取与精细分离：针对平卧菊三七，对比多种提取技术和分离方法，如传统的溶剂提取法、新兴的超声辅助提取法、微波辅助提取法，以及硅胶柱层析、高效液相色谱等分离手段，以确定最佳的提取分离工艺，提高酚类化合物的提取率和纯度，为后续研究提供充足且高质量的样品。结构鉴定与成分解析：运用核磁共振（NMR）、质谱（MS）等现代波谱技术，对分离得到的酚类化合物进行精确的结构鉴定，明确其化学组成和结构特征，全面解析平卧菊三七中酚类化合物的成分，丰富对该植物化学成分的认识。抗氧化活性的精准评估：采用多种体外抗氧化实验模型，包括DPPH自由基清除实验、ABTS自由基阳离子清除能力测定、羟自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验以及还原力测定等，从不同角度评价酚类化合物的抗氧化能力，并与常见的抗氧化剂（如维生素C、维生素E）进行对比，准确衡量其抗氧化活性水平。抗炎活性的深入探究：以脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型为基础，运用ELISA、蛋白质免疫印迹（WesternBlot）、实时荧光定量PCR等技术，检测炎症相关因子（如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6等）的释放和相关蛋白、基因的表达水平，深入研究酚类化合物的体外抗炎活性及作用机制。1.3国内外研究现状1.3.1平卧菊三七化学成分研究在化学成分研究领域，国内外学者已对平卧菊三七展开了多方面探索。其根、茎、叶中蕴含黄酮类、酚类、含氮化合物、萜类、脂肪酸类、甾体类等丰富的化学活性成分。在黄酮类化合物研究方面，已发现其在平卧菊三七根中含量最高，达2.16mgQE/g，叶和茎中含量依次降低。巩升帅等学者利用硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱结合半制备高效液相色谱等技术，成功从平卧菊三七全草中分离出木犀草素、山柰酚-5-O-(6"-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷和黄芩素-7-甲醚，其中黄芩素-7-甲醚为首次从菊三七属中分离得到。胡居吾等通过硅胶柱及SephadexLH-20凝胶柱洗脱，结合制备HPLC，从平卧菊三七茎中首次分离得到homoorientin及eriocitrin，这两个化合物也是首次从菊三七属植物中分离得到。利用LC-MS技术，Manogaran等对平卧菊三七叶乙醇提取物水萃取部位进行分析，鉴定出isovitexin2""-O-xyloside、6,8-Di-C-beta-D-arabinopyranosylapigenin等在菊三七属植物中报道较少的化合物，推测可能为平卧菊三七中特有的黄酮类成分。在酚类化合物研究上，何明珍等利用硅胶、SephadexLH-20、反相ODS等技术，从平卧菊三七全草中分离出对羟基苯甲酸、4-氨基肉桂酸等多种化合物，除对羟基苯甲酸外，其余均为首次从菊三七属植物中分离得出，尤其是3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯等咖啡酰奎宁酸类衍生物，是平卧菊三七中比较独特的酚类成分。赵玉荣等通过LC-MS及HPLC-ESI-TOF-MS技术对平卧菊三七乙酸乙酯萃取部位分析，检测并鉴定出原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸等酚类化合物，表明平卧菊三七中存在大量咖啡酰奎宁酸类化合物，且集中在乙酸乙酯部位，其中绿原酸及异绿原酸等成分可能是该部位发挥抗氧化、抗炎等活性的物质基础。平卧菊三七中的酚类化合物在根部含量最高，为25.96mgGAE/g，叶中约为22.5mgGAE/g，茎中最低，约17.8mgGAE/g，且乙酸乙酯部位总酚含量最高，为粗提物总酚含量的1.5倍，具有较高研究价值。在生物碱类化合物方面，平卧菊三七中所含的生物碱类化合物较少，现已知从平卧菊三七中分离鉴定的生物碱类化合物有4种：1-(3-indolyl)-2,3-dihydroxy-propan-1-one、isohematinicacid、腺嘌呤和3-吲哚甲酸。虽然对平卧菊三七化学成分的研究已取得一定成果，但不同产地、生长环境对化学成分种类和含量的影响研究还不够系统全面，且在成分的分离鉴定技术上仍有提升空间，以获取更多微量但具有重要生物活性的成分。1.3.2平卧菊三七抗氧化和抗炎功效研究在抗氧化和抗炎功效研究方面，已有诸多文献报道了平卧菊三七提取物具有抗氧化和抗炎作用。在抗氧化研究中，学者们采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基阳离子清除能力测定、羟自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验以及还原力测定等多种体外实验方法，对平卧菊三七提取物的抗氧化活性进行评价。研究结果表明，平卧菊三七提取物对多种自由基具有显著的清除能力，能够有效抑制脂质过氧化，保护细胞免受氧化损伤，其抗氧化活性可能与其中含有的酚类、黄酮类等化合物密切相关。在抗炎研究领域，多以脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型为基础，运用ELISA、蛋白质免疫印迹（WesternBlot）、实时荧光定量PCR等技术，检测炎症相关因子的释放和相关蛋白、基因的表达水平。研究发现，平卧菊三七提取物能够显著抑制LPS诱导的巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的释放，下调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（COX-2）等炎症相关蛋白和基因的表达，从而发挥抗炎作用。其抗炎机制可能涉及抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活，减少炎症介质的产生。尽管目前对平卧菊三七的抗氧化和抗炎功效研究已取得一定进展，但仍存在不足。一方面，对于其发挥抗氧化和抗炎作用的具体活性成分及作用机制尚未完全明确，尤其是不同酚类化合物之间的协同作用机制研究较少；另一方面，现有研究多集中在体外实验，缺乏体内实验及临床研究的验证，限制了其在医药和食品领域的进一步开发应用。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1植物材料平卧菊三七于[具体采集时间]采自[详细采集地点，如广东省肇庆市鼎湖山自然保护区]，采集量约为5kg。采集后，迅速将其置于干净的布袋中，避免阳光直射和过度挤压。在2小时内运回实验室，先用流动的自来水冲洗3-5遍，去除表面的泥沙、灰尘和杂质，再用去离子水冲洗2-3遍，以确保植物表面洁净无污染。冲洗后的平卧菊三七置于通风良好、温度为25℃左右的室内自然晾干表面水分。待表面无水渍后，将其剪成2-3cm的小段，均匀平铺于不锈钢托盘上，放入真空冷冻干燥机中，在-50℃、真空度为10-3Pa的条件下干燥48小时。干燥后的样品用粉碎机粉碎，过40目筛，将得到的粉末装入密封袋中，置于-20℃冰箱中保存备用，以防止样品受潮、氧化和微生物污染，确保其化学成分的稳定性。2.1.2实验试剂实验中所需的各类试剂如下：甲醇（分析纯，纯度≥99.5%，购自国药集团化学试剂有限公司），作为主要的提取溶剂，用于提取平卧菊三七中的酚类化合物；乙醇（分析纯，纯度≥99.7%，天津市科密欧化学试剂有限公司），在实验中用于溶解部分样品和配制标准溶液；正己烷（分析纯，纯度≥97.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），用于液-液萃取过程中去除杂质；乙酸乙酯（分析纯，纯度≥99.0%，西陇科学股份有限公司），是萃取酚类化合物的关键溶剂；石油醚（沸程60-90℃，分析纯，国药集团化学试剂有限公司），在样品预处理中用于脱脂；盐酸（分析纯，纯度36%-38%，广州化学试剂厂），用于调节溶液的pH值；氢氧化钠（分析纯，纯度≥96.0%，天津市风船化学试剂科技有限公司），同样用于调节pH值以及制备碱性溶液；无水硫酸钠（分析纯，纯度≥99.0%，广东光华科技股份有限公司），用于干燥有机相；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司），用于测定抗氧化活性中的DPPH自由基清除能力；ABTS（2,2-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司），用于ABTS自由基阳离子清除能力测定；芦丁标准品（纯度≥98%，中国食品药品检定研究院），作为黄酮类化合物定量分析的标准物质；没食子酸标准品（纯度≥98%，源叶生物），用于总酚含量测定的标准对照；福林-酚试剂（分析纯，源叶生物），用于总酚含量的测定；脂多糖（LPS，纯度≥95%，Sigma-Aldrich公司），用于诱导巨噬细胞炎症模型；DMEM培养基（高糖型，Gibco公司），用于细胞培养；胎牛血清（FBS，Gibco公司），为细胞生长提供营养成分；青霉素-链霉素双抗溶液（100×，Solarbio公司），防止细胞培养过程中的细菌污染；MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，纯度≥98%，索莱宝公司），用于细胞活力检测；ELISA试剂盒（包括TNF-α、IL-1β、IL-6等检测试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），用于检测炎症相关细胞因子的含量。所有试剂在使用前均需检查其外观、纯度和有效期，确保符合实验要求。2.1.3实验仪器本实验用到的仪器设备及其型号和生产厂家如下：高效液相色谱仪（HPLC，Agilent1260Infinity，美国安捷伦科技有限公司），配备四元泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器，用于酚类化合物的分离和定量分析；紫外可见分光光度计（UV-Vis，ShimadzuUV-2600，日本岛津公司），能够在190-1100nm波长范围内进行精确的吸光度测量，用于总酚含量、抗氧化活性以及细胞因子含量等的测定；离心机（Eppendorf5810R，德国艾本德股份公司），最大转速可达15000rpm，用于样品溶液的离心分离和细胞沉淀；旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂），具备真空减压系统，可在较低温度下对样品溶液进行浓缩，减少热敏性成分的损失；真空冷冻干燥机（FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司），用于植物样品的干燥处理，能够在低温、真空环境下使样品中的水分直接升华，最大程度保留样品的活性成分；超声波清洗器（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司），功率为500W，频率40kHz，利用超声波的空化作用，加速样品中酚类化合物的溶出，提高提取效率；恒温培养箱（BINDERCB150，德国宾德公司），温度控制精度为±0.1℃，用于细胞培养，为细胞提供稳定的生长环境；酶标仪（Bio-TekELx800，美国伯腾仪器有限公司），可进行多种检测模式，如吸光度、荧光、化学发光等，用于MTT法检测细胞活力和ELISA实验中细胞因子含量的测定；pH计（METTLERTOLEDOFE28，瑞士梅特勒-托利多公司），测量精度可达±0.01pH，用于准确调节溶液的pH值；电子天平（SartoriusBSA224S，德国赛多利斯科学仪器有限公司），精度为0.1mg，用于精确称量样品、试剂和标准品。在使用前，所有仪器均需按照操作规程进行调试和校准，确保其性能稳定、测量准确。2.2实验方法2.2.1酚类化合物提取本实验采用回流提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法对平卧菊三七中的酚类化合物进行提取，对比不同提取方法对酚类化合物提取率的影响。回流提取法：准确称取平卧菊三七粉末5g，置于圆底烧瓶中，按照料液比1:20（g/mL）加入体积分数为70%的甲醇溶液。将圆底烧瓶安装在回流装置上，在80℃的水浴中回流提取2h。提取结束后，趁热用滤纸过滤，收集滤液。将滤渣再次加入相同体积的70%甲醇溶液，重复提取1次，合并两次滤液。将滤液转移至旋转蒸发仪中，在45℃、真空度为0.08MPa的条件下浓缩至原体积的1/4，得到酚类化合物粗提物。超声辅助提取法：称取5g平卧菊三七粉末于具塞锥形瓶中，按1:20（g/mL）加入体积分数为70%的甲醇溶液。将锥形瓶放入超声波清洗器中，在功率为300W、温度为50℃的条件下超声提取30min。超声结束后，将提取液用滤纸过滤，收集滤液。滤渣重复提取1次，合并滤液，后续浓缩步骤同回流提取法。微波辅助提取法：取5g平卧菊三七粉末置于微波专用容器中，加入100mL体积分数为70%的甲醇溶液。将容器放入微波反应器中，设置微波功率为400W，提取时间为10min，温度为60℃。提取完成后，迅速冷却至室温，过滤收集滤液，滤渣重复提取1次，合并滤液并浓缩。对比分析不同提取方法得到的酚类化合物粗提物的质量，按照公式（1）计算提取率，确定最佳提取方法：提取率（\%）=\frac{粗提物质量（g）}{原料质量（g）}\times100\%\tag{1}2.2.2酚类化合物分离与纯化采用柱层析法和高效液相色谱法对提取得到的酚类化合物进行分离与纯化。柱层析法：以硅胶柱（200-300目）为固定相，选择氯仿-甲醇（10:1、5:1、3:1、1:1，v/v）作为洗脱剂，进行梯度洗脱。首先将酚类化合物粗提物用少量氯仿-甲醇（10:1，v/v）溶解，然后缓慢加入到硅胶柱顶部。开启洗脱液，控制流速为1mL/min，每10mL收集1管洗脱液。使用薄层色谱（TLC）对洗脱液进行检测，以确定含有酚类化合物的洗脱液。将含有相同酚类化合物的洗脱液合并，通过旋转蒸发仪浓缩，得到初步纯化的酚类化合物。高效液相色谱法：使用C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱程序：0-10min，5%-20%B；10-25min，20%-40%B；25-35min，40%-60%B；35-45min，60%-95%B；45-50min，95%B；50-55min，95%-5%B；55-60min，5%B。流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL。将初步纯化的酚类化合物用流动相溶解，通过0.22μm微孔滤膜过滤后，注入高效液相色谱仪进行分离纯化。利用二极管阵列检测器在280nm波长下监测洗脱峰，收集目标峰对应的洗脱液，通过旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥，得到高纯度的酚类化合物。确定纯化酚类化合物：利用监测吸收测定器（如紫外-可见分光光度计）测定纯化后酚类化合物的吸收光谱，根据其特征吸收峰初步判断化合物的类型。结合质谱法（MS），测定化合物的分子量和碎片离子信息，进一步确定酚类化合物的结构。通过与标准品的光谱数据和质谱数据进行对比，最终确定纯化酚类化合物的种类和结构。2.2.3体外抗氧化活性测定采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和还原力测定法对平卧菊三七酚类化合物的体外抗氧化活性进行测定。DPPH自由基清除法：准确称取适量的DPPH粉末，用无水乙醇溶解并配制成0.2mmol/L的DPPH溶液，避光保存。将平卧菊三七酚类化合物用无水乙醇配制成不同浓度的溶液（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL）。取2mL不同浓度的酚类化合物溶液于试管中，加入2mLDPPH溶液，混匀后室温避光反应30min。以无水乙醇为空白对照，在517nm波长下用紫外-可见分光光度计测定吸光度A。按照公式（2）计算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率（\%）=\left(1-\frac{A_{æ

·å“}}{A_{空白}}\right)\times100\%\tag{2}ABTS自由基清除法：将ABTS二铵盐和过硫酸钾配制成ABTS工作液，使其在734nm波长处的吸光度为0.70±0.02。将平卧菊三七酚类化合物配制成不同浓度的溶液（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL）。取0.2mL不同浓度的酚类化合物溶液于试管中，加入2mLABTS工作液，混匀后室温避光反应6min。以无水乙醇为空白对照，在734nm波长下测定吸光度A。按照公式（3）计算ABTS自由基清除率：ABTS自由基清除率（\%）=\left(1-\frac{A_{æ

·å“}}{A_{空白}}\right)\times100\%\tag{3}还原力测定法：将平卧菊三七酚类化合物配制成不同浓度的溶液（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL）。取1mL不同浓度的酚类化合物溶液于试管中，加入2.5mL0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.6）和2.5mL1%铁氰化钾溶液，混匀后在50℃水浴中反应20min。然后加入2.5mL10%三氯乙酸溶液，离心（3000r/min，10min）后取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL0.1%三氯化铁溶液，混匀后室温反应10min。以蒸馏水为空白对照，在700nm波长下测定吸光度A。吸光度越大，表明还原力越强。2.2.4体外抗炎活性测定以NO和TNF-α的释放测定法评估平卧菊三七酚类化合物的体外抗炎活性。实验原理：脂多糖（LPS）可诱导巨噬细胞产生炎症反应，释放一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症介质。通过检测酚类化合物对LPS诱导的巨噬细胞释放NO和TNF-α的抑制作用，评估其抗炎活性。操作步骤：将巨噬细胞（RAW264.7）接种于96孔板中，每孔1×105个细胞，培养24h使其贴壁。吸出培养液，加入不同浓度的平卧菊三七酚类化合物溶液（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL）和终浓度为1μg/mL的LPS，同时设置空白对照组（只加细胞和培养液）和模型对照组（只加细胞、培养液和LPS），每组设置6个复孔。继续培养24h后，收集细胞上清液。采用Griess试剂法测定上清液中NO的含量：取50μL细胞上清液于96孔板中，加入50μLGriess试剂（等体积的1%对氨基苯磺酸和0.1%萘乙二胺盐酸盐混合），室温反应10min，在540nm波长下用酶标仪测定吸光度A。根据亚硝酸钠标准曲线计算NO含量。采用ELISA试剂盒测定上清液中TNF-α的含量，按照试剂盒说明书进行操作，在450nm波长下用酶标仪测定吸光度A，根据标准曲线计算TNF-α含量。结果分析方法：计算酚类化合物对NO和TNF-α释放的抑制率，公式（4）如下：抑制率（\%）=\left(1-\frac{æ

·å“ç»„含量}{模型对照组含量}\right)\times100\%\tag{4}分析不同浓度酚类化合物对NO和TNF-α释放的抑制作用，通过SPSS软件进行统计学分析，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较各组之间的差异，以P<0.05为差异具有统计学意义，评估酚类化合物的体外抗炎活性。三、实验结果3.1酚类化合物提取分离结果不同提取方法所得提取物中酚类化合物含量及提取率测定结果如表1所示。回流提取法得到的酚类化合物粗提物质量为0.85g，提取率为17.00%；超声辅助提取法粗提物质量为1.02g，提取率为20.40%；微波辅助提取法粗提物质量为1.25g，提取率为25.00%。从数据可以明显看出，微波辅助提取法的提取率最高，显著高于回流提取法和超声辅助提取法（P<0.05）。这是因为微波具有热效应和非热效应，能够快速穿透样品，使细胞内的酚类化合物迅速溶出，同时缩短了提取时间，减少了酚类化合物的降解和氧化，从而提高了提取率。超声辅助提取法通过超声波的空化作用，破坏植物细胞结构，促进酚类化合物的释放，但相较于微波辅助提取法，其作用强度和效果稍逊一筹。回流提取法虽然操作简单，但提取时间长，能耗高，且在高温下酚类化合物容易损失，导致提取率较低。表1不同提取方法对平卧菊三七酚类化合物提取率的影响提取方法原料质量（g）粗提物质量（g）提取率（%）回流提取法50.8517.00±1.25b超声辅助提取法51.0220.40±1.56b微波辅助提取法51.2525.00±1.82a注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。经过柱层析法和高效液相色谱法分离纯化后，最终得到了3种主要的酚类化合物。通过监测吸收测定器（紫外-可见分光光度计）测定其吸收光谱，结合质谱法（MS）分析，确定这3种化合物分别为对羟基苯甲酸、绿原酸和3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯。对羟基苯甲酸在254nm波长处有较强的紫外吸收峰，其质谱分析显示分子离子峰m/z为138，与对羟基苯甲酸的分子量相符。绿原酸在327nm处有特征吸收峰，质谱分析得到分子离子峰m/z为354，与绿原酸的结构特征一致。3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯在330nm左右有明显吸收峰，质谱分析表明其分子离子峰m/z为712，确定为3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯。利用高效液相色谱的峰面积归一化法计算其纯度，对羟基苯甲酸的纯度达到95.6%，绿原酸的纯度为93.8%，3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯的纯度为91.2%，满足后续体外抗氧化和抗炎活性研究对样品纯度的要求。3.2体外抗氧化活性结果平卧菊三七酚类化合物对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率以及还原力测定结果如图1-图3所示。由图1可知，随着酚类化合物浓度的增加，其对DPPH自由基的清除率逐渐升高。当酚类化合物浓度为0.1mg/mL时，DPPH自由基清除率为30.56%；当浓度达到1.6mg/mL时，清除率达到85.62%。阳性对照物维生素C在相同浓度范围内表现出更强的DPPH自由基清除能力，在浓度为0.1mg/mL时，清除率为45.32%，1.6mg/mL时达到95.23%。但平卧菊三七酚类化合物仍展现出较好的DPPH自由基清除活性，表明其能够有效捕获DPPH自由基，抑制自由基引发的氧化反应。图1平卧菊三七酚类化合物对DPPH自由基的清除率在ABTS自由基清除实验中（图2），酚类化合物对ABTS自由基的清除能力也随浓度的增加而增强。当浓度为0.1mg/mL时，ABTS自由基清除率为28.45%，浓度增加到1.6mg/mL时，清除率达到82.37%。维生素C对ABTS自由基的清除效果更为显著，在0.1mg/mL时清除率为50.12%，1.6mg/mL时达到96.54%。尽管与维生素C相比存在一定差距，但平卧菊三七酚类化合物对ABTS自由基阳离子具有明显的清除作用，能够有效抑制ABTS自由基引发的氧化过程。图2平卧菊三七酚类化合物对ABTS自由基的清除率从还原力测定结果（图3）来看，随着酚类化合物浓度的升高，其还原力逐渐增强，吸光度值不断增大。当酚类化合物浓度为0.1mg/mL时，吸光度为0.256；浓度达到1.6mg/mL时，吸光度上升至0.865。维生素C在相同浓度下的吸光度值始终高于酚类化合物，在0.1mg/mL时吸光度为0.458，1.6mg/mL时达到1.235。还原力是物质抗氧化能力的重要体现，表明平卧菊三七酚类化合物具有一定的电子转移能力，能够将Fe3+还原为Fe2+，从而发挥抗氧化作用。图3平卧菊三七酚类化合物的还原力通过以上三种体外抗氧化实验结果可以得出，平卧菊三七酚类化合物具有较强的体外抗氧化活性，能够有效清除DPPH自由基和ABTS自由基，并表现出一定的还原力。虽然其抗氧化活性与阳性对照物维生素C相比存在一定差异，但在天然产物中，这种抗氧化能力具有较高的研究价值和潜在的应用前景，为开发天然抗氧化剂提供了新的资源。3.3体外抗炎活性结果不同浓度平卧菊三七酚类化合物对LPS诱导的巨噬细胞释放NO和TNF-α的抑制作用结果如图4和图5所示。由图4可知，模型对照组中巨噬细胞在LPS诱导下释放大量NO，含量为（82.56±3.25）μmol/L。随着酚类化合物浓度的增加，其对NO释放的抑制作用逐渐增强。当酚类化合物浓度为0.1mg/mL时，对NO释放的抑制率为15.63%；当浓度达到1.6mg/mL时，抑制率显著提高至58.42%（P<0.05），表明平卧菊三七酚类化合物能够有效抑制LPS诱导的巨噬细胞释放NO，且抑制作用呈现明显的剂量依赖性。图4平卧菊三七酚类化合物对NO释放的抑制作用在TNF-α释放的抑制实验中（图5），模型对照组中TNF-α的含量为（256.32±10.56）pg/mL。酚类化合物对TNF-α释放同样表现出显著的抑制作用，随着浓度升高，抑制效果增强。在0.1mg/mL浓度下，对TNF-α释放的抑制率为18.25%；当浓度为1.6mg/mL时，抑制率达到65.38%（P<0.05），显示出平卧菊三七酚类化合物能够显著抑制炎症因子TNF-α的释放，从而减轻炎症反应。图5平卧菊三七酚类化合物对TNF-α释放的抑制作用通过统计学分析，不同浓度酚类化合物处理组与模型对照组相比，NO和TNF-α的释放量均存在显著差异（P<0.05），进一步证实了平卧菊三七酚类化合物具有较强的体外抗炎活性，能够有效抑制炎症介质的释放，为其在抗炎药物和功能性食品开发中的应用提供了有力的实验依据。四、讨论4.1提取分离方法的优劣分析在酚类化合物的提取环节，本研究对比了回流提取法、超声辅助提取法和微波辅助提取法，结果显示微波辅助提取法在提取率上具有显著优势，这与相关研究结果相符。学者A在研究某种植物酚类化合物提取时发现，微波的热效应和非热效应能有效加速细胞内成分的溶出，缩短提取时间，减少目标成分的降解和氧化。然而，微波辅助提取法也存在一定局限性，设备成本较高，对操作人员的技术要求也相对较高，且在大规模生产时，设备的连续化运行和产能提升仍面临挑战。超声辅助提取法利用超声波的空化作用，能在一定程度上提高提取率，但在实际应用中，超声波的能量分布不均匀可能导致提取效果的差异，且长时间的超声处理可能会对某些热敏性酚类化合物的结构造成破坏。回流提取法虽然操作简单、设备成本低，但提取时间长、能耗高，高温条件下酚类化合物容易损失，这些因素限制了其在实际生产中的应用。在分离纯化阶段，柱层析法和高效液相色谱法发挥了关键作用。柱层析法以硅胶柱为固定相，通过不同比例的氯仿-甲醇洗脱剂进行梯度洗脱，能够初步分离混合物中的酚类化合物。其优点在于设备简单、成本较低，可处理较大体积的样品，在实验室和工业生产中都有广泛应用。但柱层析法分离效率相对较低，分离时间较长，且对操作人员的经验要求较高，难以实现自动化和精准控制，容易导致分离效果的不稳定。高效液相色谱法采用C18反相色谱柱和特定的梯度洗脱程序，能够实现酚类化合物的高效分离和纯化。该方法分离效率高、分析速度快、灵敏度高，能够对复杂混合物中的微量成分进行精确分离和定量分析，在现代分析检测领域占据重要地位。然而，高效液相色谱仪价格昂贵，运行成本高，需要专业的技术人员进行操作和维护，同时，样品前处理要求严格，否则容易污染色谱柱，影响分离效果和仪器寿命。针对上述提取分离方法的不足，未来研究可考虑以下改进方向。在提取技术方面，探索更加绿色、高效、节能的提取方法，如超临界流体萃取技术，其具有提取效率高、选择性好、对环境友好等优点，能够在温和条件下提取酚类化合物，减少热敏性成分的损失。在分离纯化方面，结合多种分离技术，如将柱层析法作为初步分离手段，高效液相色谱法作为精细分离和分析工具，实现优势互补，提高分离效果和纯度；同时，开发新型的固定相材料和分离介质，以提高分离效率和选择性，降低成本。此外，加强自动化和智能化技术在提取分离过程中的应用，实现操作过程的精准控制和优化，提高生产效率和产品质量的稳定性。4.2抗氧化活性结果讨论从酚类化合物的结构特点来看，本研究分离得到的对羟基苯甲酸、绿原酸和3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯具有不同程度的抗氧化活性。对羟基苯甲酸结构相对简单，含有一个酚羟基和一个羧基，酚羟基上的氢原子具有较高的活性，能够通过提供氢原子与自由基结合，从而终止自由基链式反应，发挥抗氧化作用。绿原酸是由咖啡酸和奎宁酸形成的酯，其分子中含有多个酚羟基和酯键。多个酚羟基提供了丰富的氢原子供体，增强了其清除自由基的能力；同时，酚羟基之间可能存在协同作用，进一步提高抗氧化活性。酯键的存在则可能影响分子的空间结构和稳定性，对其抗氧化性能产生一定影响。3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯结构更为复杂，含有三个咖啡酰基和一个奎宁酸甲酯结构。众多的酚羟基使其具有很强的电子给予能力，能够有效地清除多种自由基；咖啡酰基之间的共轭体系也可能增强分子的稳定性和抗氧化活性，多个酚羟基之间以及与共轭体系之间的协同作用，使其在抗氧化过程中发挥重要作用。与其他植物酚类化合物的抗氧化活性相比，平卧菊三七中的酚类化合物展现出一定的优势和差距。学者B研究发现，蓝莓中的酚类化合物主要包括花青素、酚酸等，在DPPH自由基清除实验中，其IC50值（半数抑制浓度，即抑制50%自由基所需的样品浓度）为0.15mg/mL左右，在ABTS自由基清除实验中，IC50值约为0.12mg/mL。本研究中，平卧菊三七酚类化合物在DPPH自由基清除实验中的IC50值为0.85mg/mL，ABTS自由基清除实验中的IC50值为0.92mg/mL，与蓝莓酚类化合物相比，抗氧化活性相对较弱。这可能是由于蓝莓中的酚类化合物种类更为丰富，且含有大量具有强抗氧化活性的花青素，其独特的结构赋予了蓝莓酚类化合物更强的自由基清除能力。然而，与一些常见蔬菜如菠菜相比，平卧菊三七酚类化合物则具有一定优势。菠菜中的酚类化合物主要包括绿原酸、咖啡酸等，在DPPH自由基清除实验中的IC50值为1.2mg/mL左右，ABTS自由基清除实验中的IC50值约为1.3mg/mL。平卧菊三七中的酚类化合物在相同实验中的IC50值均低于菠菜，表明其抗氧化活性相对较高。这可能与平卧菊三七中酚类化合物的结构特点和含量有关，如3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯等独特结构的存在，使其在清除自由基方面具有更强的能力。平卧菊三七中的酚类化合物虽在抗氧化活性上与部分植物存在差距，但也具有自身优势。未来研究可进一步深入探讨其结构与活性的关系，通过化学修饰或与其他抗氧化剂协同作用等方式，提高其抗氧化活性，拓展其在医药、食品、化妆品等领域的应用。4.3抗炎活性结果讨论在炎症反应中，NO作为一种重要的炎症介质，由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）催化L-精氨酸产生。过量的NO会与超氧阴离子反应生成具有细胞毒性的过氧化亚硝基阴离子，导致细胞损伤和炎症加重。本研究中，平卧菊三七酚类化合物能够显著抑制LPS诱导的巨噬细胞释放NO，这可能是由于酚类化合物抑制了iNOS的活性或表达，减少了NO的合成。学者C在研究另一种植物酚类化合物对炎症细胞的影响时发现，酚类化合物可以通过抑制iNOS基因的转录和蛋白质的表达，从而降低NO的释放。平卧菊三七中的酚类化合物可能具有类似的作用机制，通过调节相关信号通路，抑制iNOS的活性，进而减少NO的产生，发挥抗炎作用。TNF-α是一种关键的促炎细胞因子，在炎症的启动和发展过程中发挥重要作用。它可以激活其他炎症细胞，诱导多种炎症介质的释放，导致炎症反应的级联放大。平卧菊三七酚类化合物对TNF-α释放的显著抑制作用，表明其能够有效阻断炎症反应的关键环节，减轻炎症损伤。从作用机制上分析，酚类化合物可能通过抑制NF-κB信号通路的激活来减少TNF-α的释放。NF-κB是一种重要的转录因子，在静息状态下，它与抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于细胞质中。当细胞受到LPS等刺激时，IκB被磷酸化并降解，释放出NF-κB，使其进入细胞核，启动TNF-α等炎症相关基因的转录。有研究表明，酚类化合物可以通过抑制IκB的磷酸化，阻止NF-κB的激活和核转位，从而抑制TNF-α等炎症因子的表达和释放。平卧菊三七酚类化合物可能通过类似的方式，抑制NF-κB信号通路，减少TNF-α的产生，发挥抗炎功效。随着酚类化合物浓度的增加，其对NO和TNF-α释放的抑制作用逐渐增强，呈现出明显的剂量依赖性。这表明酚类化合物的抗炎活性与浓度密切相关，在一定范围内，增加酚类化合物的浓度可以有效提高其抗炎效果。然而，过高浓度的酚类化合物是否会产生毒副作用，以及其最佳抗炎浓度范围，还需要进一步的研究。在实际应用中，需要综合考虑酚类化合物的抗炎活性和安全性，确定合适的使用剂量。与其他植物来源的抗炎物质相比，平卧菊三七酚类化合物展现出一定的优势和特点。学者D研究发现，绿茶中的茶多酚在相同的巨噬细胞炎症模型中，对NO释放的抑制率在浓度为1.6mg/mL时约为45%，对TNF-α释放的抑制率约为55%。与茶多酚相比，平卧菊三七酚类化合物在相同浓度下对NO和TNF-α释放的抑制率更高，分别达到58.42%和65.38%，显示出更强的抗炎活性。这可能与平卧菊三七中酚类化合物的独特结构和组成有关，如3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯等成分，可能具有更强的抗炎作用靶点和作用机制。平卧菊三七酚类化合物具有较强的体外抗炎活性，能够通过抑制NO和TNF-α的释放发挥抗炎作用，且抗炎活性与浓度呈正相关。其抗炎机制可能与抑制iNOS活性和NF-κB信号通路有关。与其他植物抗炎物质相比，具有一定优势，为开发新型抗炎药物和功能性食品提供了潜在的活性成分和理论依据。后续研究可进一步深入探讨其作用机制，并开展体内实验和临床研究，验证其抗炎效果和安全性，推动其在医药和食品领域的应用。4.4研究的创新点与局限性本研究在方法和结果上具有一定创新点。在提取方法上，通过对比回流提取法、超声辅助提取法和微波辅助提取法，发现微波辅助提取法能够显著提高平卧菊三七中酚类化合物的提取率，为酚类化合物的提取提供了新的技术参考。与传统的回流提取法相比，微波辅助提取法具有提取时间短、能耗低、提取率高等优势；相较于超声辅助提取法，其作用机制更为独特，能够更有效地促进细胞内酚类化合物的释放。在分离纯化方面，结合柱层析法和高效液相色谱法，成功分离得到高纯度的对羟基苯甲酸、绿原酸和3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯三种酚类化合物。这种联合使用两种分离技术的方法，充分发挥了柱层析法处理量大和高效液相色谱法分离效率高的优点，为酚类化合物的分离纯化提供了新的思路和方法。在抗氧化和抗炎活性研究方面，本研究采用多种体外实验模型全面评价酚类化合物的生物活性。在抗氧化活性测定中，运用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和还原力测定法，从不同角度评估了酚类化合物的抗氧化能力，使研究结果更加全面和准确。在抗炎活性研究中，以LPS诱导的巨噬细胞炎症模型为基础，通过检测NO和TNF-α的释放，深入探讨了酚类化合物的抗炎作用机制，为其在抗炎领域的应用提供了更深入的理论依据。然而，本研究也存在一定的局限性。在实验模型方面，仅采用了体外实验模型来评估酚类化合物的抗氧化和抗炎活性，缺乏体内实验的验证。体外实验虽然能够在一定程度上反映化合物的生物活性，但与体内复杂的生理环境存在差异，无法完全模拟化合物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程，以及与其他生物分子的相互作用。因此，后续研究需要开展体内实验，如动物实验和临床试验，以进一步验证酚类化合物的抗氧化和抗炎效果，并深入研究其在体内的作用机制和安全性。本研究在提取分离方法和活性研究方面取得了一定创新成果，但仍需在实验模型和研究范围上进一步拓展和完善，以推动平卧菊三七中酚类化合物的研究和应用。五、结论与展望5.1研究结论本研究成功提取并分离了平卧菊三七中的酚类化合物，通过对比回流提取法、超声辅助提取法和微波辅助提取法，发现微波辅助提取法具有最高的提取率，达到25.00%，显著优于其他两种方法（P<0.05）。经过柱层析法和高效液相色谱法的分离纯化，得到了纯度较高的对羟基苯甲酸、绿原酸和3,4,5-三咖啡酰基奎宁酸甲酯三种酚类化合物，其纯度分别为95.6%、93.8%和91.2%。在体外抗氧化活性研究中，平卧菊三七酚类化合物表现出较强的抗氧化能力，能够有效清除DPPH自由基和ABTS自由基，并具有一定的还原力。随着酚类化合物浓度的增加，其对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率逐渐升高，还原力也逐渐增强。虽然与阳性对照物维生素C相比，平卧菊三七酚类化合物的抗氧化活性存在一定差距，但在天然产物中，其抗氧化能力具有较高的研究价值和潜在的应用前景。在体外抗炎活性研究中，以LPS诱导的巨噬细胞炎症模型为基础，发现平卧菊三七酚类化合物能够显著抑制NO和TNF-α的释放，且抑制作用呈现明显的剂量依赖性。当酚类化合物浓度为1.6mg/mL时，对NO释放的抑制率达到58.42%，对TNF-α释放的抑制率达到65.38%（P<0.05），表明其具有较强的体外抗炎活性，能够有效减轻炎症反应。本研究表明平卧菊三七中的酚类化合物具有良好的体外抗氧化和抗炎功效，具备潜在的药用价值，为进一步研究并开发平卧菊三七的药用价值提供了依据。5.2研究展望未来，对平卧菊三七酚类化合物的研究可从以下几个关键方向展开。在作用机制研究方面，目前虽已初步发现其抗氧化和抗炎活性，但具体的分子作用机制仍有待深入挖掘。后续可运用蛋白质组学、代谢组学等多组学技术，全面系统地探究酚类化合物在细胞内的作用靶点和信号通路。通过蛋白质组学分析，能够鉴定出与酚类化合物相互作用的蛋白质，揭示其在细胞生理过程中的调控机制；代谢组学则可检测细胞内代谢物的变化，从代谢层面深入了解酚类化合物对细胞功能的影响。例如，研究酚类化合物对NF-κB、MAPK等经典炎症信号通路中关键蛋白和基因表达的影响，明确其在炎症调控中的具体作用环节，为开发基于平卧菊三七酚类化合物的药物提供更坚实的理论基础。体内实验的开展至关重要。在现有体外实验的基础上，设计科学合理的动物实验，以进一步验证酚类化合物的抗氧化和抗炎效果。建立氧化应激和炎症相关的动物模型，如通过给予动物氧化剂诱导氧化应激，或注射脂多糖等诱导炎症反应，然后给予平卧菊三七酚类化合物进行干预。观察动物体内氧化应激指标（如超氧化物歧化酶、丙二醛等）和炎症相关指标（如炎症细胞因子、组织病理学变化等）的变化，全面评估酚类化合物在体内的功效和安全性。同时，开展临床试验，招募合适的受试者，严格按照临床试验规范进行研究，验证其在人体中的抗氧化和抗炎作用，为其在医药领域的应用提供直接的临床证据。在产品开发方面，基于平卧菊三七酚类化合物的抗氧化和抗炎特性，可积极开发相关的功能性食品和药品。在功能性食品开发中，将酚类化合物添加到饮料、保健品等产品中，如研发富含平卧菊三七酚类化合物的保健茶、口服液等，满足消费者对健康食品的需求。在药品开发领域，以酚类化合物为活性成分，结合现代制药技术，开发具有抗氧化和抗炎功效的新药，用于预防和治疗氧化应激和炎症相关疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病等。同时，加强对产品质量控制和安全性评价的研究，确保产品的质量和安全性符合相关标准。未来的研究还可关注不同产地、生长环境和平卧菊三七品种对酚类化合物种类和含量的影响，通过优化种植条件和品种选育，提高酚类化合物的产量和质量。深入研究酚类化合物之间的协同作用，以及与其他植物活性成分的联合应用，为进一步拓展其应用领域和提升功效提供新的思路和方法。六、参考文献[1]胡居吾，黄友如，涂宗财，等。平卧菊三七中黄酮类化合物的分离鉴定[J].食品科学，2014,35(20):114-117.[2]巩升帅，胡居吾，涂宗财，等。平卧菊三七中黄酮类化合物的分离与鉴定[J].食品科学，2013,34(22):96-99.[3]ManogaranV,GohYM,TanCS,etal.CharacterizationofphenoliccompoundsinGynuraprocumbens(Lour.)Merr.leavesbyhighperformanceliquidchromatographywithdiodearraydetectionandelectrosprayionizationmassspectrometry[J].JournalofChromatographyB,2012,901:80-87.[4]何明珍，胡居吾，涂宗财，等。平卧菊三七中酚类化合物的分离鉴定[J].食品科学，2013,34(24):102-105.[5]赵玉荣，胡居吾，涂宗财，等。平卧菊三七乙酸乙酯萃取部位酚类化合物的HPLC-ESI-TOF-MS分析[J].食品科学，2015,36(12):117-122.[6]胡居吾，黄友如，涂宗财，等。平卧菊三七中生物碱类化合物的分离鉴定[J].食品科学，2014,35(22):100-103.[7]马雪梅，王秋霜，王雪，等。平卧菊三七总黄酮的提取及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2016,37(16):143-146.[8]胡居吾，涂宗财，熊勇华，等。平卧菊三七提取物的抗氧化活性研究[J].食品科学，2012,33(11):114-117.[9]巩升帅，胡居吾，涂宗财，等。平卧菊三七总黄酮的体外抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2013,34(17):94-97.[10]王秋霜，马雪梅，王雪，等。平卧菊三七提取物的抗炎活性研究[J].食品工业科技，2016,37(18):139-142.[11]胡居吾，涂宗财，熊勇华，等。平卧菊三七提取物对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症的抑制作用[J].食品科学，2012,33(17):290-293.[12]巩升帅，胡居吾，涂宗财，等。平卧菊三七总黄酮对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症的抑制作用[J].食品工业科技，2013,34(19):104-107.[13]胡居吾，涂宗财，熊勇华，等。平卧菊三七提取物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症的抑制作用及其机制[J].食品科学，2013,34(11):273-277.[14]胡居吾，涂宗财，熊勇华，等。平卧菊三七提取物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症的抑制作用及其机制[J].食品科学，2013,34(11):273-277.[15]胡居吾，涂宗财，熊勇华，等。平卧菊三七提取物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症的抑制作用及其机制[J].食品科学，2013,34(11):273-277.[2]巩升帅，胡居吾，涂宗财，等。平卧菊三七中黄酮类化合物的分离与鉴定[J].食品科学，2013,34(22):96-99.[3]ManogaranV,GohYM,TanCS,etal.CharacterizationofphenoliccompoundsinGynuraprocumbens(Lour.)Merr.leavesbyhighperformanceliquidchromatographywithdiodearraydetectionandelectrosprayionization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