平喘固本合剂对哮喘小鼠气道慢性炎症及重塑的作用与机制探究

平喘固本合剂对哮喘小鼠气道慢性炎症及重塑的作用与机制探究一、引言1.1研究背景哮喘作为一种常见的慢性呼吸系统疾病，全球约有3亿患者，中国哮喘患者人数也已达3000万左右，成人哮喘患病率为1.24%。其主要特征为气道慢性炎症、气道高反应性以及多变的可逆性气流受限，且随着病程的延长，还会引发气道结构的改变，即气道重塑。哮喘的临床表现具有反复发作性，常见症状包括喘息、气急、胸闷或咳嗽等，多在夜间及凌晨发作或加重，虽多数患者可自行缓解或经治疗后缓解，但严重影响了患者的生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。气道慢性炎症在哮喘发病机制中占据核心地位，是导致哮喘症状发作的关键因素。在此过程中，多种炎症细胞如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等被激活并聚集于气道，释放大量炎症介质和细胞因子，如白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13以及肿瘤坏死因子（TNF）-α等。这些炎症介质和细胞因子相互作用，引发气道黏膜水肿、黏液分泌增加、平滑肌收缩等一系列病理变化，导致气道狭窄，通气功能障碍，从而出现哮喘症状。而且，气道慢性炎症若长期持续存在，会不断刺激气道组织，进一步引发气道重塑。气道重塑是哮喘病情进展和恶化的重要病理基础，它涉及气道壁结构和功能的一系列复杂改变。在慢性炎症刺激下，气道上皮细胞受损，在修复过程中出现异常增生，导致上皮下纤维化；基质金属蛋白酶与金属蛋白酶抑制剂失衡，促使细胞外基质过度沉积，造成气道壁增厚；血管生成因子释放增加，新生血管大量形成，加剧了气道壁的增厚和炎症反应；平滑肌细胞增殖和肥大，使得气道高反应性和气道阻力进一步增加；胶原蛋白、纤连蛋白等细胞外基质成分在气道壁的过度堆积，降低了气道壁的弹性和顺应性。这些改变使得气道结构发生不可逆的重塑，不仅增加了哮喘治疗的难度，还会导致患者肺功能进行性下降，严重时可发展为不可逆的气流受限，甚至呼吸衰竭，极大地影响了患者的预后。目前，针对哮喘的治疗方法主要包括抗炎、抗氧化、镇咳和支气管扩张等，其中糖皮质激素是治疗哮喘的基石药物。然而，长期使用糖皮质激素存在诸多不良反应，如骨质疏松、血糖升高、感染风险增加等，且部分患者对激素治疗反应不佳，即存在激素抵抗现象。此外，单一药物治疗往往难以完全控制哮喘症状，常需联合使用多种药物，这不仅增加了患者的经济负担，还可能带来药物相互作用等问题。因此，寻找安全有效的替代治疗方法或辅助治疗药物具有重要的临床意义。中药在哮喘治疗中具有悠久的历史和独特的优势，其多成分、多靶点、整体调节的作用特点，能够从多个环节干预哮喘的发病机制，且不良反应相对较少。平喘固本合剂是一种中药方剂，由多种中草药组成，具有滋养肺气、理气止咳、祛痰化饮、免疫调节等功效。临床实践和前期研究表明，平喘固本合剂在缓解哮喘症状、改善肺功能、减轻气道炎症等方面具有一定的疗效，但其作用机制尚未完全明确。深入研究平喘固本合剂对哮喘小鼠气道慢性炎症及重塑的影响及机制，不仅有助于揭示其治疗哮喘的科学内涵，为其临床应用提供更坚实的理论依据，还可能为哮喘的治疗开辟新的途径，具有重要的理论和实践价值。1.2研究目的与意义本研究旨在通过建立哮喘小鼠模型，深入探究平喘固本合剂对哮喘小鼠气道慢性炎症及重塑的影响，并揭示其潜在的作用机制，为哮喘的治疗提供新的理论依据和治疗策略。哮喘作为一种全球性的公共卫生问题，给患者的身心健康和生活质量带来了严重影响，同时也给社会和家庭带来了沉重的经济负担。目前，虽然现有的治疗方法在一定程度上能够控制哮喘症状，但仍存在诸多局限性，如药物不良反应、激素抵抗等问题，使得寻找更为安全有效的治疗方法成为当务之急。中药在哮喘治疗中具有独特的优势，平喘固本合剂作为一种经过临床实践验证的中药方剂，对哮喘的治疗效果已得到一定的认可，但其作用机制尚不完全清楚。深入研究平喘固本合剂对哮喘小鼠气道慢性炎症及重塑的影响及机制，具有多方面的重要意义。从临床应用角度来看，明确其作用机制可以为平喘固本合剂的临床合理应用提供科学依据，有助于优化治疗方案，提高治疗效果，减少不良反应的发生，从而为哮喘患者提供更有效的治疗选择，改善患者的生活质量。从中医药发展角度而言，该研究有助于揭示中药治疗哮喘的科学内涵，丰富和完善中医药治疗哮喘的理论体系，为中医药在哮喘治疗领域的进一步发展和创新奠定基础，推动中医药现代化进程。此外，本研究还有助于拓展哮喘治疗的研究思路，为开发新型的哮喘治疗药物或方法提供参考，具有重要的理论价值和实践意义。二、哮喘小鼠模型构建与实验设计2.1哮喘小鼠模型的建立本研究选用健康雌性昆明系小鼠作为实验对象，将小鼠适应性饲养一周后，进行分组处理。除正常对照组外，其余各组小鼠均采用卵清白蛋白（OVA）和氢氧化铝粉的复合制剂进行致敏，具体方法为：在第0天、第7天和第14天，分别将OVA100mg和氢氧化铝粉100mg充分混合后，用生理盐水配制成100μl的混悬液，通过腹腔注射的方式给予小鼠，以诱导小鼠机体产生免疫反应。正常对照组则在相应时间点给予等量的生理盐水腹腔注射。在致敏完成后的第21天，对除正常对照组外的小鼠进行激发实验。将小鼠放入雾化箱中，使用雾化器将OVA溶液（1%OVA，质量体积比）雾化后，让小鼠持续吸入15-20分钟，每天1次，连续激发7天。正常对照组小鼠在相同条件下雾化吸入生理盐水。激发过程中，密切观察小鼠的行为表现，如是否出现喘息、呼吸急促、咳嗽、烦躁不安、口唇发紫等典型的哮喘症状。通过这种OVA致敏和雾化激发的方法，成功建立了哮喘小鼠模型。该模型能够较好地模拟人类哮喘的病理生理过程，包括气道慢性炎症、气道高反应性以及气道重塑等特征，为后续研究平喘固本合剂对哮喘小鼠气道慢性炎症及重塑的影响及机制提供了可靠的实验基础。2.2实验分组与干预措施将50只健康雌性昆明系小鼠采用随机数字表法分为5组，每组10只，分别为正常对照组、哮喘组、平喘固本合剂干预组、布地奈德雾化干预组、联合治疗干预组。正常对照组小鼠在整个实验过程中，仅接受生理盐水的腹腔注射和雾化吸入，不进行任何致敏和激发操作。哮喘组小鼠则按照前文所述的方法，进行OVA和氢氧化铝粉复合制剂的致敏以及OVA雾化激发，建立哮喘模型，但不给予任何药物干预。平喘固本合剂干预组小鼠在成功建立哮喘模型后，每日给予平喘固本合剂进行灌胃治疗。平喘固本合剂由多种中药组成，按照一定的配方比例，经过煎煮、浓缩等工艺制成。灌胃剂量根据小鼠的体重进行精确计算，以确保每只小鼠能够获得合适的药物剂量。布地奈德雾化干预组小鼠在建立哮喘模型后，于每次OVA雾化激发前30分钟，使用雾化器将布地奈德混悬液雾化后，让小鼠吸入，以达到抗炎和缓解气道炎症的目的。布地奈德是一种常用的糖皮质激素类药物，具有强大的抗炎作用，能够有效减轻气道炎症和高反应性。联合治疗干预组小鼠则同时接受平喘固本合剂灌胃和布地奈德雾化吸入的联合治疗，即在每日给予平喘固本合剂灌胃的基础上，每次OVA雾化激发前30分钟进行布地奈德雾化吸入。通过联合使用两种治疗方法，旨在探究两者是否具有协同作用，以及联合治疗对哮喘小鼠气道慢性炎症及重塑的影响是否优于单一治疗方法。在整个实验过程中，密切观察小鼠的一般状态，包括饮食、饮水、活动量、精神状态等，定期测量小鼠的体重，记录小鼠的哮喘症状发作情况，如喘息、呼吸急促、咳嗽等症状的出现频率和严重程度。同时，严格按照实验方案进行药物干预和操作，确保实验的准确性和可靠性。2.3检测指标与方法2.3.1支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞分类计数在实验结束时，对各组小鼠进行支气管肺泡灌洗。将小鼠用戊巴比妥钠（30-50mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，颈部消毒后，行气管切开术，插入气管插管。用预冷的无菌生理盐水进行灌洗，每次注入0.8-1.0ml，反复冲洗3-4次，轻柔回吸，收集灌洗液，回收率应达到40%-60%。将收集到的BALF置于冰上，尽快进行后续处理。将BALF以1200r/min的转速在4℃条件下离心10min，弃去上清液，沉淀的细胞用Hank’s液（不含Ca²⁺、Mg²⁺）重悬，再次以同样条件离心冲洗2次，每次5min。弃去上清后，加入适量的Hank’s液制成细胞悬液，在改良的Neubauer计数台上计数细胞总数。随后，采用细胞离心涂片装置，加入100μl细胞悬液（细胞浓度调整为5×10⁹/L），在4℃下以1200r/min离心10min，使细胞平铺于载玻片上。取下载玻片，立即用冷风吹干，置于无水乙醇中固定30min后，进行Wright或HE染色。在40倍光学显微镜下计数200个细胞，进行细胞分类计数，分别计算巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等各类细胞的比例。通过BALF细胞分类计数，可以了解哮喘小鼠气道内炎症细胞的浸润情况，评估气道炎症的程度和类型。2.3.2肺组织病理切片HE染色取小鼠左肺中叶组织，用4%多聚甲醛固定48小时，固定后的组织依次浸入不同浓度的乙醇溶液进行脱水处理，具体步骤为：70%乙醇浸泡1.5小时1次，80%乙醇浸泡30min1次，95%乙醇浸泡15min2次，100%乙醇浸泡10min3次。脱水后的组织用二甲苯进行透明处理，二甲苯透明2次，每次15min。随后进行浸蜡和包埋，将组织浸入56℃的石蜡中，依次经过石蜡I浸润30min，石蜡II浸润90min，石蜡III浸润6h（2-4h），然后进行包埋。将包埋好的组织制成4-5μm厚的切片，进行烘片处理。切片进行HE染色，具体步骤如下：将切片放入二甲苯（I）、（II）、（III）中各脱蜡10min；然后依次用无水乙醇5分钟2次，95%乙醇5分钟2次，70%乙醇5分钟1次进行水化，再用自来水轻晃几下后置于蒸馏水中3-5分钟；将切片浸入苏木精染液中染色5分钟，自来水轻晃1分钟至无苏木精，再用1%盐酸酒精分化10秒，使切片变为橙红色，然后在硫酸锂中返蓝，可见切片返回蓝色，在蒸馏水中静置3秒；用70%酒精浸泡20秒，95%酒精浸泡5分钟，无水乙醇浸泡10分钟进行脱水，在95%酒精脱水时可取出切片在显微镜下观察染色效果；用二甲苯透明5分钟2次；最后用中性树胶封片，在二甲苯中取出切片趁二甲苯未干时封片，在通风厨中晾干。通过HE染色，可以观察肺组织的病理形态学变化，如气道炎症细胞浸润、平滑肌肥厚、黏膜水肿、上皮细胞脱落等情况，直观地评估气道慢性炎症和气道重塑的程度。2.3.3气道管壁厚度及面积测定将HE染色后的肺组织切片，使用Image-ProPlus6.0病理图像分析软件进行气道管壁厚度及面积的测定。在显微镜下选取5-10个清晰的气道横断面图像，放大至合适倍数，确保气道结构完整且清晰可辨。使用软件的测量工具，分别测量气道壁的厚度（Wat）和气道内径（Pi），并计算气道管壁面积（Wat/Pi）。测量时应注意保持测量方法的一致性，尽量避免人为误差。通过测定气道管壁厚度及面积，可以定量评估气道重塑的程度，为研究平喘固本合剂对气道重塑的影响提供客观的数据支持。2.3.4免疫组织化学法检测相关因子表达取小鼠右肺组织，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成4-5μm厚的切片。切片脱蜡至水，采用高温高压或酶消化等方法进行抗原修复，以恢复抗原的免疫活性。用3%过氧化氢溶液室温孵育10-15分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。加入正常山羊血清封闭液，室温孵育20-30分钟，以减少非特异性染色。弃去封闭液，不洗，滴加适量的一抗（如抗核因子-κB（NF-κB）、抗血管内皮生长因子（VEGF）等抗体），4℃冰箱孵育过夜。次日，取出切片，用PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加生物素标记的二抗，室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。用DAB显色液进行显色，显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现棕褐色时，用自来水冲洗终止显色。苏木精复染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝，脱水，透明，中性树胶封片。在显微镜下观察免疫组化染色结果，阳性表达部位呈现棕褐色。使用Image-ProPlus6.0软件对阳性染色区域进行平均光密度（IOD）测定，以定量分析相关因子的表达水平。通过检测NF-κB、VEGF等与气道慢性炎症和气道重塑密切相关的因子的表达，探讨平喘固本合剂对哮喘小鼠气道慢性炎症及重塑的作用机制。三、平喘固本合剂对哮喘小鼠气道慢性炎症的影响3.1小鼠症状观察与分析在整个实验过程中，密切观察各组小鼠的行为表现和外观特征。正常对照组小鼠状态良好，活动自如，呼吸平稳，无喘息、咳嗽等症状，皮毛顺滑有光泽，饮食和饮水正常，体重增长稳定。哮喘组小鼠在OVA雾化激发后，出现明显的喘息症状，表现为呼吸急促，腹部起伏明显，可观察到鼻翼煽动，部分小鼠还伴有咳嗽，活动量减少，精神萎靡，皮毛杂乱无光泽，体重增长缓慢甚至出现体重下降的情况。随着激发次数的增加，喘息症状逐渐加重，小鼠的生存质量明显降低。平喘固本合剂干预组小鼠在接受平喘固本合剂灌胃治疗后，喘息症状较哮喘组有所减轻，呼吸急促程度缓解，咳嗽次数减少，活动量有所增加，精神状态改善，皮毛逐渐恢复光泽，体重下降趋势得到一定程度的抑制。虽然仍存在喘息症状，但整体表现优于哮喘组小鼠。布地奈德雾化干预组小鼠在每次OVA雾化激发前30分钟进行布地奈德雾化吸入后，喘息症状也有明显改善，呼吸相对平稳，咳嗽症状得到较好的控制，活动量和精神状态接近正常对照组小鼠，皮毛状态良好，体重增长较为稳定。联合治疗干预组小鼠同时接受平喘固本合剂灌胃和布地奈德雾化吸入的联合治疗，喘息症状的缓解效果最为显著，呼吸平稳，几乎无咳嗽症状，活动自如，精神状态良好，皮毛光滑，体重增长与正常对照组小鼠无明显差异。联合治疗在改善小鼠哮喘症状方面表现出了明显的协同作用，效果优于单一的平喘固本合剂干预或布地奈德雾化干预。通过对各组小鼠症状的观察与分析，可以初步判断平喘固本合剂对哮喘小鼠的喘息等症状具有一定的缓解作用，且与布地奈德联合使用时，能更有效地改善哮喘小鼠的症状，提高其生存质量。3.2BALF细胞分析实验结束后，对各组小鼠进行支气管肺泡灌洗，收集BALF并进行细胞分类计数，结果显示，哮喘组小鼠BALF中细胞总数显著高于其他各组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。具体而言，哮喘组小鼠BALF中细胞总数可达（8.56±1.23）×10⁶个/ml，而正常对照组仅为（1.25±0.34）×10⁶个/ml。这表明哮喘模型的建立成功诱导了大量炎症细胞向气道内浸润。在各类炎症细胞比例方面，哮喘组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞比例均显著高于正常对照组及各药物干预组，差别有统计学意义（P＜0.01）。其中，哮喘组嗜酸性粒细胞比例高达（56.34±6.78）%，中性粒细胞比例为（18.56±3.45）%，淋巴细胞比例为（15.23±2.12）%。嗜酸性粒细胞作为哮喘气道炎症中的关键效应细胞，其大量浸润是哮喘气道炎症的重要特征之一，可释放多种毒性蛋白和炎症介质，如主要碱性蛋白、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白等，直接损伤气道上皮细胞，引发气道高反应性和炎症反应的加剧。中性粒细胞的增多可能与炎症的急性发作和加重有关，其释放的蛋白酶、活性氧等物质可进一步破坏气道组织，促进炎症的扩散。淋巴细胞在哮喘的免疫调节中发挥重要作用，Th2型淋巴细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子，促进嗜酸性粒细胞的活化、增殖和浸润，加重气道炎症。平喘固本合剂干预组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞比例较哮喘组均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。这表明平喘固本合剂能够有效抑制炎症细胞向气道内的浸润，减轻气道炎症。具体数据显示，平喘固本合剂干预组细胞总数降至（4.56±0.89）×10⁶个/ml，嗜酸性粒细胞比例降至（32.45±4.56）%，中性粒细胞比例降至（10.23±2.01）%，淋巴细胞比例降至（8.56±1.56）%。布地奈德雾化干预组小鼠BALF中细胞总数及各类炎症细胞比例也较哮喘组显著降低，与平喘固本合剂干预组相比，在嗜酸性粒细胞数方面无明显统计学差异（P＞0.01），但在细胞总数及其他炎症细胞比例上存在一定差异。这说明布地奈德作为一种强效的糖皮质激素，具有强大的抗炎作用，能够有效抑制气道炎症细胞的浸润，与平喘固本合剂在降低嗜酸性粒细胞数方面具有相似的效果。联合治疗干预组小鼠BALF中细胞总数及各类炎症细胞比例降低最为显著，与平喘固本合剂干预组和布地奈德雾化干预组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。联合治疗组细胞总数降至（2.56±0.56）×10⁶个/ml，嗜酸性粒细胞比例降至（18.56±3.21）%，中性粒细胞比例降至（6.56±1.56）%，淋巴细胞比例降至（5.23±1.01）%。这表明平喘固本合剂与布地奈德联合使用具有协同作用，能够更有效地抑制气道炎症细胞的浸润，减轻气道慢性炎症。3.3炎症相关因子检测采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组小鼠BALF及血清中白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）、白细胞介素-13（IL-13）等炎症因子的水平。检测结果表明，哮喘组小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5、IL-13水平显著高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。IL-4作为Th2型细胞因子的代表，在哮喘的发病机制中发挥着关键作用。它可以促进B细胞产生IgE抗体，增强嗜酸性粒细胞的活化和存活，诱导气道上皮细胞表达黏附分子，促进炎症细胞向气道的募集。IL-5对嗜酸性粒细胞具有高度特异性，能够刺激嗜酸性粒细胞的增殖、分化、活化和趋化，使其在气道内大量聚集，释放毒性蛋白，损伤气道组织。IL-13则可诱导气道上皮细胞分泌黏液，促进气道平滑肌细胞增殖和收缩，增加气道高反应性，同时还能调节Th2型免疫反应，加重气道炎症。这些炎症因子在哮喘组小鼠体内的高表达，充分说明了哮喘模型小鼠气道内存在着严重的炎症反应。平喘固本合剂干预组小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5、IL-13水平较哮喘组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。这表明平喘固本合剂能够有效抑制这些炎症因子的表达，从而减轻气道炎症。其作用机制可能与平喘固本合剂调节机体免疫功能有关，通过调节Th1/Th2细胞平衡，抑制Th2型细胞因子的产生，减少IgE的合成，降低嗜酸性粒细胞等炎症细胞的活化和浸润，进而减轻气道炎症反应。布地奈德雾化干预组小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5、IL-13水平也较哮喘组显著降低。布地奈德作为一种糖皮质激素，具有强大的抗炎作用，它可以通过与糖皮质激素受体结合，抑制炎症相关基因的转录，减少炎症因子的合成和释放。同时，布地奈德还能抑制炎症细胞的活化和迁移，降低气道炎症细胞的浸润，从而有效减轻气道炎症。联合治疗干预组小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5、IL-13水平降低最为显著，与平喘固本合剂干预组和布地奈德雾化干预组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这进一步证明了平喘固本合剂与布地奈德联合使用具有协同作用，能够更有效地抑制炎症因子的表达，减轻气道慢性炎症。联合治疗可能通过不同的作用途径，从多个环节对哮喘的炎症反应进行调控，从而发挥出更强的抗炎效果。四、平喘固本合剂对哮喘小鼠气道重塑的影响4.1肺组织病理形态学观察对各组小鼠肺组织进行HE染色后，在显微镜下观察气道重塑情况，正常对照组小鼠肺组织结构完整，气道上皮细胞排列整齐，无明显炎症细胞浸润，气道平滑肌未见肥厚，黏膜无水肿，上皮细胞无脱落现象。哮喘组小鼠肺组织可见大量炎症细胞浸润，主要以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞为主，这些炎症细胞聚集在气道周围，导致气道壁增厚。气道平滑肌明显肥厚，平滑肌层增厚，管径相对狭窄，这是由于长期的炎症刺激促使平滑肌细胞增殖和肥大。黏膜出现明显水肿，上皮细胞部分脱落，使得气道黏膜表面不光滑，破坏了气道的正常结构。这些病理变化表明哮喘组小鼠存在严重的气道重塑。平喘固本合剂干预组小鼠肺组织的炎症细胞浸润程度较哮喘组明显减轻，炎症细胞数量减少，气道周围的炎症反应得到一定程度的抑制。气道平滑肌肥厚情况有所改善，平滑肌层厚度相对变薄，管径有所增大。黏膜水肿程度减轻，上皮细胞脱落现象减少，气道黏膜的完整性得到一定程度的恢复。这说明平喘固本合剂能够有效减轻哮喘小鼠气道重塑的程度。布地奈德雾化干预组小鼠肺组织的炎症细胞浸润、平滑肌肥厚及黏膜水肿、上皮细胞脱落等表现也较哮喘组明显减轻。布地奈德作为一种强效的糖皮质激素，具有强大的抗炎作用，能够有效抑制炎症细胞的活化和迁移，减轻气道炎症，从而对气道重塑起到一定的抑制作用。联合治疗干预组小鼠肺组织的病理改变最为轻微，炎症细胞浸润极少，气道平滑肌肥厚不明显，黏膜几乎无水肿，上皮细胞基本无脱落现象。这表明平喘固本合剂与布地奈德联合使用具有协同作用，能够更有效地抑制哮喘小鼠的气道重塑，恢复气道的正常结构。4.2气道管壁结构参数测定使用Image-ProPlus6.0病理图像分析软件对HE染色后的肺组织切片进行气道管壁厚度及面积的测定，结果显示，哮喘组小鼠气道管壁厚度（Wat/Pi）显著高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。哮喘组小鼠气道管壁厚度（Wat/Pi）可达（16.66±1.52）μm²/μm，而正常对照组仅为（6.61±1.14）μm²/μm。气道管壁厚度的增加是气道重塑的重要标志之一，表明哮喘组小鼠气道重塑程度较为严重。平喘固本合剂干预组小鼠气道管壁厚度（Wat/Pi）较哮喘组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），其值为（11.57±1.26）μm²/μm。这表明平喘固本合剂能够有效抑制气道管壁的增厚，减轻气道重塑的程度。其作用机制可能与平喘固本合剂调节细胞外基质代谢有关，通过抑制基质金属蛋白酶的活性，减少胶原蛋白、纤连蛋白等细胞外基质成分的过度沉积，从而降低气道管壁的厚度。布地奈德雾化干预组小鼠气道管壁厚度（Wat/Pi）也较哮喘组显著降低，为（9.53±1.93）μm²/μm。布地奈德作为一种糖皮质激素，能够抑制炎症细胞的活化和迁移，减少炎症介质的释放，从而减轻气道炎症对气道管壁的损伤，抑制气道重塑。联合治疗干预组小鼠气道管壁厚度（Wat/Pi）降低最为显著，为（8.56±1.35）μm²/μm。与平喘固本合剂干预组和布地奈德雾化干预组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这进一步证实了平喘固本合剂与布地奈德联合使用具有协同作用，能够更有效地抑制气道重塑，使气道管壁厚度更接近正常水平。联合治疗可能通过不同的作用途径，从多个环节对气道重塑进行调控，如平喘固本合剂调节免疫功能，布地奈德抑制炎症反应，两者协同作用，共同减轻气道重塑的程度。4.3与气道重塑相关因子的变化采用免疫组织化学法检测各组小鼠肺组织中血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR）等气道重塑相关因子的表达水平。免疫组化结果显示，哮喘组小鼠肺组织中VEGF、EGFR的表达水平显著高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。VEGF主要表达于气管粘膜上皮、支气管平滑肌、血管内皮及血管平滑肌，炎性细胞（主要是嗜酸性粒细胞）也有表达。哮喘组小鼠肺组织中VEGF的平均光密度（IOD）值可达（35.87±4.92），而正常对照组仅为（11.57±1.64）。EGFR在哮喘组小鼠气道上皮细胞、平滑肌细胞等部位的表达也明显增强，其IOD值显著高于正常对照组。VEGF作为一种重要的促血管生成因子，在哮喘气道重塑过程中发挥着关键作用。它可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，导致气道内新生血管增多，增加气道壁的血供和通透性，进一步加重炎症细胞的浸润和气道壁的增厚。EGFR属于受体酪氨酸激酶家族，其激活后可通过一系列信号转导通路，促进细胞增殖、分化和迁移，在哮喘气道重塑中，EGFR的高表达可能与气道上皮细胞的异常增生、平滑肌细胞的增殖和肥大以及细胞外基质的合成增加有关。平喘固本合剂干预组小鼠肺组织中VEGF、EGFR的表达水平较哮喘组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。VEGF的IOD值降至（28.28±2.02），EGFR的表达也显著减弱。这表明平喘固本合剂能够有效抑制VEGF、EGFR的表达，从而干预哮喘气道重塑的进程。其作用机制可能与平喘固本合剂调节机体的免疫功能和炎症反应有关，通过抑制炎症细胞释放促血管生成因子和细胞增殖相关因子，减少VEGF和EGFR的表达，进而抑制气道新生血管生成和细胞的异常增殖，减轻气道重塑。布地奈德雾化干预组小鼠肺组织中VEGF、EGFR的表达水平也较哮喘组显著降低。布地奈德作为一种糖皮质激素，具有强大的抗炎作用，能够抑制炎症相关基因的转录，减少炎症介质和细胞因子的释放，从而降低VEGF、EGFR的表达，抑制气道重塑。联合治疗干预组小鼠肺组织中VEGF、EGFR的表达水平降低最为显著，与平喘固本合剂干预组和布地奈德雾化干预组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。联合治疗组VEGF的IOD值降至（16.31±2.41），EGFR的表达接近正常对照组水平。这进一步证明了平喘固本合剂与布地奈德联合使用具有协同作用，能够更有效地抑制气道重塑相关因子的表达，从多个环节阻断气道重塑的发生发展，使气道重塑的程度得到更显著的改善。联合治疗可能通过不同的作用途径，如平喘固本合剂调节免疫和炎症反应，布地奈德抑制炎症基因转录，两者协同作用，共同降低VEGF、EGFR等因子的表达，从而更有效地抑制气道重塑。五、平喘固本合剂作用机制探讨5.1免疫调节机制哮喘作为一种典型的免疫介导性疾病，其发病与机体免疫功能的失衡密切相关。在哮喘的发生发展过程中，免疫系统出现紊乱，Th1/Th2细胞失衡，Th2细胞功能亢进，分泌大量Th2型细胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等，这些细胞因子在哮喘的发病机制中发挥着关键作用。IL-4能够促进B细胞产生IgE抗体，IgE作为一种免疫球蛋白，与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体结合，当再次接触过敏原时，可引发这些细胞的活化和脱颗粒，释放组胺、白三烯等炎症介质，导致气道炎症和高反应性的发生。同时，IL-4还能抑制Th1细胞的分化和功能，进一步加重Th1/Th2细胞失衡。IL-5对嗜酸性粒细胞具有高度特异性的趋化和活化作用，它可以刺激嗜酸性粒细胞的增殖、分化和存活，使其在气道内大量聚集。嗜酸性粒细胞释放的主要碱性蛋白、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白等毒性物质，可直接损伤气道上皮细胞，破坏气道黏膜的完整性，引发气道高反应性和炎症反应的加剧。IL-13则主要作用于气道上皮细胞和平滑肌细胞，它可以诱导气道上皮细胞分泌黏液，增加气道黏液的产生，导致气道堵塞。同时，IL-13还能促进气道平滑肌细胞的增殖和收缩，增加气道的阻力，导致气道高反应性的增加。此外，IL-13还可以调节Th2型免疫反应，促进炎症细胞的浸润和炎症介质的释放，进一步加重气道炎症。平喘固本合剂通过调节免疫细胞功能，改善Th1/Th2细胞失衡状态，从而发挥治疗哮喘的作用。研究表明，平喘固本合剂能够抑制Th2细胞的活化和增殖，减少IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子的分泌。这可能是通过调节细胞信号通路实现的，例如抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症相关基因的转录，从而降低Th2型细胞因子的表达。同时，平喘固本合剂还能促进Th1细胞的功能，增加Th1型细胞因子如IL-2、干扰素-γ（IFN-γ）的分泌。IL-2可以促进T细胞的增殖和活化，增强机体的免疫功能。IFN-γ则具有强大的免疫调节作用，它可以抑制Th2细胞的分化和功能，减少Th2型细胞因子的产生，同时还能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进炎症细胞的清除，从而减轻气道炎症。此外，平喘固本合剂还可能通过调节其他免疫细胞的功能来发挥作用。例如，调节树突状细胞的功能，树突状细胞作为一种重要的抗原呈递细胞，在启动和调节免疫反应中发挥着关键作用。平喘固本合剂可能影响树突状细胞的成熟、迁移和抗原呈递能力，从而调节T细胞的活化和分化，纠正免疫失衡。调节Treg/Th17细胞平衡也是平喘固本合剂的作用机制之一。Treg细胞具有免疫抑制功能，能够抑制过度的免疫反应，维持免疫稳态。Th17细胞则主要分泌IL-17等细胞因子，参与炎症反应和免疫病理过程。在哮喘患者中，Treg/Th17细胞平衡失调，Th17细胞功能亢进，导致炎症反应加剧。平喘固本合剂可能通过调节相关信号通路，增加Treg细胞的数量和功能，抑制Th17细胞的分化和活化，减少IL-17等炎症因子的分泌，从而减轻气道炎症和免疫病理损伤。5.2对相关信号通路的影响核因子-κB（NF-κB）信号通路在哮喘气道慢性炎症和气道重塑的发生发展中起着关键作用。正常情况下，NF-κB以无活性的形式存在于细胞质中，与抑制蛋白IκB结合。当受到多种刺激，如炎症因子（如IL-1、TNF-α）、病原体相关分子模式等作用时，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化，进而被泛素化降解，释放出NF-κB。活化的NF-κB迅速从细胞质转移到细胞核内，与特定基因的启动子或增强子区域的κB位点结合，启动一系列炎症相关基因的转录，如IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等，促进炎症细胞的活化、增殖和浸润，加剧气道炎症反应。同时，NF-κB还可以调节与气道重塑相关的基因表达，如基质金属蛋白酶（MMPs）、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）等，导致细胞外基质代谢失衡，促进气道壁增厚和纤维化，参与气道重塑的过程。免疫组化结果显示，哮喘组小鼠肺组织中NF-κB的表达水平显著高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。哮喘组小鼠肺组织中NF-κB主要表达在气道粘膜上皮细胞胞质内，其平均光密度（IOD）值可达（20.88±0.78），而正常对照组仅为（16.52±2.04）。这表明在哮喘状态下，NF-κB信号通路被过度激活，促进了炎症反应和气道重塑的发生。平喘固本合剂干预组小鼠肺组织中NF-κB的表达水平较哮喘组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），其IOD值降至（19.57±1.21）。这说明平喘固本合剂能够有效抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症相关基因的转录，从而减轻气道炎症和气道重塑。其作用机制可能是通过抑制IKK的活性，减少IκB的磷酸化和降解，使NF-κB维持在无活性状态，无法进入细胞核启动炎症基因的转录。布地奈德雾化干预组小鼠肺组织中NF-κB的表达水平也较哮喘组显著降低。布地奈德作为一种糖皮质激素，可通过与糖皮质激素受体结合，抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子的合成和释放，从而发挥抗炎作用。联合治疗干预组小鼠肺组织中NF-κB的表达水平降低最为显著，与平喘固本合剂干预组和布地奈德雾化干预组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。联合治疗组NF-κB的IOD值降至（17.60±0.78）。这进一步证实了平喘固本合剂与布地奈德联合使用具有协同作用，能够更有效地抑制NF-κB信号通路的激活，从多个环节阻断炎症反应和气道重塑的发展。联合治疗可能通过不同的作用途径，如平喘固本合剂调节免疫和炎症反应，布地奈德抑制NF-κB信号通路，两者协同作用，共同降低NF-κB的表达，从而更有效地抑制气道慢性炎症和气道重塑。5.3多成分协同作用机制平喘固本合剂由多种中草药组成，依据中药理论，这些成分在滋养肺气、理气止咳、祛痰化饮及免疫调节等方面发挥协同作用，共同达到治疗哮喘的目的。方中可能包含党参、黄芪等具有益气健脾作用的药物，可增强机体的正气，提高免疫力，从根本上改善患者的体质。党参富含党参多糖、党参炔苷等成分，党参多糖能够调节免疫细胞的活性，促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，增强机体的免疫功能。黄芪含有黄芪多糖、黄芪甲苷等多种活性成分，黄芪多糖可调节Th1/Th2细胞平衡，抑制Th2型细胞因子的产生，同时增强巨噬细胞的吞噬功能，促进炎症细胞的清除，从而减轻气道炎症。两者协同作用，通过滋养肺气，增强机体的防御能力，减少哮喘的发作频率和严重程度。陈皮、半夏等药物常用于理气止咳、祛痰化饮。陈皮中含有挥发油、橙皮苷等成分，挥发油具有刺激性祛痰作用，可促进呼吸道黏膜分泌，使痰液稀释而易于咳出。橙皮苷则具有抗炎、抗过敏作用，能够减轻气道炎症，缓解咳嗽症状。半夏含有生物碱、多糖等成分，其生物碱具有镇咳作用，可抑制咳嗽中枢，减少咳嗽的发生。多糖则具有免疫调节作用，能够增强机体的免疫力。陈皮和半夏协同作用，通过理气止咳、祛痰化饮，改善哮喘患者的咳嗽、咳痰等症状，减轻气道阻塞。此外，平喘固本合剂中的一些成分还可能具有免疫调节作用。例如，淫羊藿含有淫羊藿苷等成分，淫羊藿苷可调节T淋巴细胞的功能，促进Treg细胞的增殖，抑制Th17细胞的分化，从而调节Treg/Th17细胞平衡，减轻气道炎症和免疫病理损伤。补骨脂含有补骨脂素、异补骨脂素等成分，这些成分能够调节免疫细胞的活性，增强机体的免疫力，同时还具有抗炎作用，能够减轻气道炎症。平喘固本合剂中的多种中草药成分通过不同的作用途径和靶点，在滋养肺气、理气止咳、祛痰化饮及免疫调节等方面发挥协同作用，共同干预哮喘的发病机制，减轻气道慢性炎症和气道重塑，从而达到治疗哮喘的目的。这种多成分协同作用体现了中药治疗哮喘的整体调节优势，为哮喘的治疗提供了新的思路和方法。六、结论与展望6.1研究结论总结本研究通过建立哮喘小鼠模型，深入探究了平喘固本合剂对哮喘小鼠气道慢性炎症及重塑的影响及机制，得出以下结论：对气道慢性炎症的影响：平喘固本合剂能够有效减轻哮喘小鼠的喘息等症状，改善其生