第41讲+基因工程的基本操作程序+课件+2026届高三生物一轮复习（人教版）

第41讲基因工程的基本操作程序Never学习目标1.阐明基因工程的原理和基本操作程序2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。目的基因概念基因工程基本操作程序目的基因的筛选与获取将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定植物微生物分子水平检测个体水平检测方法：

从基因文库获取

人工合成

PCR扩增基因表达载体的构建目的组成：

复制原点、启动子、目的基因、终止子、标记基因动物抗虫棉培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞苏云金杆菌Bt蛋白基因棉花细胞（核心）4.目的基因的检测与鉴定②利用

和序列比对工具进行筛选。1.目的基因概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因主要是编码特定蛋白质的基因①从相关的已知

的基因中进行筛选是较为有效的方法之一结构和功能清晰序列数据库2.明确目的基因的方法：一、目的基因的筛选与获取3.目的基因的获取方法(1)从基因文库中获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。类型：基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。提取某种生物的全部DNA一定大小的DNA片段导入受体菌中储存用适当的

限制酶切将DNA片段

与载体连接基因组文库基因组文库的构建模式图①成熟mRNA成熟mRNAcDNA文库成熟mRNA部分基因文库构建模式图②文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以小结：

基因文库对比（2）通过DNA合成仪直接合成目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA基因比较小、核苷酸序列已知（3）利用PCR获取和扩增目的基因①PCR的概念：PCR是________________的缩写，它是一项根据__________________的原理，在体外提供______________的各种组分与反应条件，对_____________________进行大量复制的技术。聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因的核苷酸序列I.全称：II.原理：III.操作环境：IV.目的：V.优点：聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。ATCGAATCGGTT

UACCTTAGCCAADNA聚合酶母链DNA子链DNA引物3′3′5′5′知识回顾---DNA复制过程小结：细胞内DNA复制所需条件：引物：模板：原料：酶：能量：DNA的两条链四种脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶ATP一小段RNA（体内）因为DNA聚合酶只能将新的核苷酸加到已有的DNA双链上，所以DNA复制需要引物。②体外DNA复制所需的基本条件耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸(dNTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶dATPdGTPdCTPdTTP一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸(催化形成磷酸二酯键)dATP

腺嘌呤脱氧核苷酸dADP腺苷（A)

腺嘌呤脱氧核糖PPP~~OHH在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。脱氧核苷三磷酸3′5′子链的延伸方向是5′→3′DNA聚合酶3′5′模板链子链DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端子链延伸子链延伸-5′3′-引物5′--3′5′--3′引物3′--5′引物2种1.概念：引物是一小段能与DNA模板链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。2.作用：使Taq酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。3.结合部位：引物结合在模板链的_________端。3’4.PCR扩增时至少需要______种引物，原因是2DNA的两条链是反向平行的，两条链的3’端的序列是不同的,用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增.小结：引物5.设计引物的要求：①同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：②2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：防止引物自身折叠防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合③引物不能太短，原因：引物太短，特异性不强，容易扩增出非特异性序列。过长会导致延伸温度太高从而不利于TaqDNA聚合酶发挥作用④引物不能太长，原因：PCR反应的过程动画：耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’

变性

复性

延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。②过程905072℃变性3`5`5`3`905072℃复性905072℃延伸905072℃变性905072℃复性905072℃延伸905072℃变性905072℃复性905072℃延伸受热变性引物

耐高温的DNA聚合酶PCR技术

(1)过程：(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种_______、四种______________、____________________。引物脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶（3）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出

个DNA片段，共需要引物数量为

个。

指数2n2n＋1－2【知识小结】(一小段单链DNA--体外)Q1：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？第一次循环的产物第二次循环的产物第三次循环的产物目的基因3次Q2：PCR技术循环n次需要加入多少个引物？2n+1-2拓展：PCR相关计算小结：PCR中的数量关系复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含其中一种引物的DNA分子数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同时含两种引物的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的对数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数0＝21－20＝22－42＝23－62n－2nPCR技术与DNA复制过程比较PCR技术DNA复制相同点原则原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子1.一个DNA，一对引物（A与B），复制n次：（1）子代DNA分子等长的DNA分子数为：_________个（2）子代DNA分子中不等长链DNA分子数为：_________个（3）子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__________个（4）子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：____个（5）复制过程中共需引物________个（6）第n次复制需要引物_________个2n-2n2n22n-12n＋1-22n课堂随练PCR过程可以在_________________中自动完成，完成以后，常采用

来鉴定PCR的产物琼脂糖凝胶电泳PCR扩增仪③产物进行鉴定实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理一、实验原理2.DNA片段电泳鉴定的原理①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。②线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子大小呈

，分子越大则所受阻力越大，也越难在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢，随着时间的推移，不同大小的DNA分子就会在凝胶中呈现出一个一个的条带。③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。反比PCR反应体系的配方用量10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL注意：反应体系总体积为50μL，一般按照用量由大到小的顺序来加样，最后才加DNA聚合酶，这样既保证所加各试剂体积的准确性也能保护酶的活性二、PCR实验123移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。实验步骤：(1)DNA片段扩增的具体过程：预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。制备凝胶电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。进行电泳将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察鉴定取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。①融化：②倒模:③凝固:①加液：②加样：③电泳：(2)PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程：电泳缓冲液用来维持pH值，使DNA带负电荷。观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。1.(2024·黑吉辽卷，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(

)A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来A课堂随练1.基因表达载体的组成及作用质粒标记基因复制原点启动子终止子限制酶切位点位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。供目的基因插入载体中便于重组DNA的筛选载体DNA复制的起始点目的：使目的基因在_________中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。受体细胞二、基因表达载体的构建--核心项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)

比较：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子(重组质粒)同一种2.基因表达载体的构建过程（1）单酶切将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有:质粒目的基因自身环化目的基因自身环化质粒自身环化质粒与目的基因反向连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接自身连接Q:怎么改进解决以上问题？用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段。限制酶a切割abDNA连接酶连接限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割ab（2）双酶切双酶切的优点:(1)防止质粒自身环化，防止目的基因自身环化(2)防止质粒与目的基因反向连接1.将目的基因导入植物细胞方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因适用生物：开花植物（1）花粉管通道法（我国科学家独创）三、将目的基因导入受体细胞注意：农杆菌转化法过程Ti质粒目的基因构建基因表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌植物细胞导入植物细胞表现出新性状的植物将目的基因插入染色体DNA中T-DNA植物组织培养可转移DNA将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达（2）农杆菌转化法可转移的DNAQ1:什么是转化？转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。Q2:农杆菌用于转化，有何特点？(2)农杆菌细胞内含有_______，当它侵染植物细胞后，能将_______上的______________（__________）转移到被侵染的细胞，并且将其_______________________________________。(1)能在自然条件下侵染___________和___________，而对大多数___________没有侵染能力；双子叶植物裸子植物单子叶植物Ti质粒Ti质粒T-DNA整合到该细胞的染色体DNA上农杆菌转化法小结：Ti质粒目的基因构建基因表达载体转入农杆菌导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状该过程经过____次拼接、____次导入？(1)第一次拼接___________________________(2)第二次拼接___________________________(3)第一次导入___________________________(4)第二次导入___________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）优先选择受伤的叶片与重组质粒的农杆菌培养，叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（3）基因枪法适用于单子叶植物——显微注射法（1）受体细胞：受精卵（2）过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物2.将目的基因导入动物细胞①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。——Ca2+处理法（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。（2）原核生物的优点:繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。（3）一般过程:Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态将重组的基因表达载体导入其中（Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性）（感受态细胞）3.导入微生物细胞Ca2+感受态细胞吸收实例：利用转基因大肠杆菌生产药物注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（无内质网和高尔基体加工），需要在体外进行再加工。检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性

（1）检测目的基因是否导入如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因——通过PCR等技术检测提取DNAPCR操作是否扩增出目的基因M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；电泳操作害虫死亡抗虫棉PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果1.分子水平检测四、目的基因的检测与鉴定探针目的基因DNA分子杂交技术原理：碱基互补配对带标记(荧光、放射性同位素)的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。（2）检测目的基因是否转录如：检测Bt基因是否翻译出mRNA——通过PCR等技术检测BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录提取mRNAPCR操作是否扩增出目的基因对扩增产物进行检测害虫死亡抗虫棉逆转录产生DNA③检测目的基因是否翻译苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交——通过抗原-抗体杂交检测转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常2.个体水平检测1.（2025·山东临沂·三模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（

）A．设置一组加二苯胺但是不加DNA的对