广西地区蓝舌病毒（BTV）的综合研究：感染、传播、鉴定与致病性探索

广西地区蓝舌病毒（BTV）的综合研究：感染、传播、鉴定与致病性探索一、引言1.1研究背景与意义蓝舌病（Bluetongue，BT）是一种由蓝舌病毒（Bluetonguevirus，BTV）引发的病毒性传染病，主要感染反刍动物，在全球范围内造成了严重的经济损失。蓝舌病病毒属于呼肠孤病毒科环状病毒属，其病毒粒子呈二十面体对称，无包膜，直径约为60-80纳米。该病毒的基因组由10个双链RNA片段组成，编码7种结构蛋白（VP1-VP7）和5种非结构蛋白（NS1-NS5），这些蛋白在病毒的复制、转录、装配和致病过程中发挥着关键作用。蓝舌病的传播主要通过库蠓等吸血昆虫，库蠓在吸食感染动物的血液后，病毒在其体内增殖，当库蠓再次叮咬其他易感动物时，便将病毒传播给新的宿主。这种传播方式使得蓝舌病的传播具有明显的季节性和地域性，与库蠓的分布和活动密切相关。在热带和亚热带地区，由于气候温暖湿润，库蠓全年均可活动，BTV的传播风险较高；而在温带和寒带地区，库蠓的活动受到季节限制，BTV的传播主要发生在温暖季节。蓝舌病最早于18世纪在南非的绵羊身上被发现，目前已广泛分布于全球多个地区。在欧洲，2023年蓝舌病疫情在荷兰、德国、法国等多个国家蔓延。2023年9月，一种不明来源的新型BTV-3变种在荷兰出现，并在短短两个月内传遍了该国，近6000个荷兰农场受影响，数万只绵羊死亡，死亡率高达75%，给当地畜牧业带来了沉重打击。在亚洲、非洲、北美洲和南美洲等地区，蓝舌病也时有发生，严重威胁着当地的畜牧业发展。蓝舌病给畜牧业带来的危害是多方面的。感染蓝舌病的动物会出现发热、口腔黏膜和蹄部溃疡、出血性病变等症状，严重时可导致死亡。除了直接的死亡损失外，蓝舌病还会导致动物体重减轻、产奶量下降和胎儿流产等问题，给畜牧生产者带来了巨大的经济成本。仅2007年，BTV-8在法国和荷兰的经济影响就超过14亿美元，全球影响估计超过30亿美元。广西作为我国的畜牧业大省，牛羊养殖规模较大。2022年上半年，广西牛出栏85.59万头，同比增长8.70%；羊出栏137.16万只，同比增长13.60%。然而，广西地区的气候条件温暖湿润，非常适合库蠓等吸血昆虫的滋生和繁殖，这使得广西地区面临着蓝舌病传播的高风险。一旦蓝舌病在广西地区暴发和流行，将会对当地的畜牧业造成严重的冲击，影响农民的收入和农村经济的发展。目前，虽然已经有一些关于蓝舌病的研究，但针对广西地区的BTV感染情况、传播媒介种类以及病毒的分离鉴定和致病性等方面的研究还相对较少。因此，开展广西BTV感染及传播媒介调查、病毒分离鉴定与致病性初步研究具有重要的现实意义。通过本研究，可以了解广西地区BTV的感染现状和流行规律，明确其传播媒介，为制定有效的防控措施提供科学依据；同时，成功分离鉴定BTV病毒并研究其致病性，对于开发针对性的疫苗和药物具有重要的指导作用，有助于保障广西地区畜牧业的健康发展，促进农民增收和农村经济的繁荣。1.2国内外研究现状在国际上，蓝舌病的研究历史较为悠久。自18世纪在南非被首次发现以来，各国科研人员围绕BTV展开了广泛而深入的研究。在病毒的基础研究方面，对BTV的基因组结构、蛋白功能以及病毒的复制、转录和装配机制等都有了较为清晰的认识。研究发现，BTV的10个双链RNA片段分别编码不同的蛋白，其中VP1-VP7为结构蛋白，参与病毒粒子的组成；NS1-NS5为非结构蛋白，在病毒的生命周期中发挥着重要作用。例如，VP2蛋白是病毒的主要抗原蛋白，负责与宿主细胞受体结合，介导病毒的入侵；VP5蛋白则在病毒入侵过程中，通过构象变化穿透细胞膜，进入宿主细胞质。在流行病学研究方面，国外对BTV的传播规律、宿主范围和媒介昆虫等进行了大量的调查和分析。通过长期的监测和研究，明确了BTV主要通过库蠓等吸血昆虫传播，不同地区的优势传播媒介存在差异。在欧洲，库蠓属的一些种类如尖喙库蠓、荒川库蠓等是BTV的重要传播媒介；在非洲，不同的库蠓种类在BTV的传播中也扮演着关键角色。此外，还发现BTV的传播与气候、地理环境等因素密切相关，温暖湿润的气候条件有利于库蠓的繁殖和活动，从而增加了BTV的传播风险。在疫苗研发方面，国外已经取得了一定的成果。目前，已经研发出多种类型的BTV疫苗，包括灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗等。这些疫苗在一定程度上控制了BTV的传播和流行，但由于BTV存在多个血清型，各血清型之间的交叉保护作用较弱，需要针对不同血清型的病毒进行疫苗接种，这增加了疫苗防控的复杂性和成本。例如，在2006-2008年欧洲BTV-8疫情期间，虽然使用了疫苗进行防控，但由于病毒的变异和血清型的多样性，疫情仍然造成了巨大的经济损失。在国内，对BTV的研究也逐渐受到重视。近年来，开展了一系列关于BTV的血清学调查、分子流行病学研究和疫苗研发等工作。通过血清学调查，了解了我国部分地区BTV的感染情况，发现不同地区的感染率存在差异。在江苏地区，对369份牛血清和202份羊血清进行检测，结果表明牛群的BTV感染阳性率为0%-63.8%，平均阳性率为17.6%；羊群的感染阳性率为0%-20%，平均阳性率为4.5%。在分子流行病学研究方面，通过对BTV的基因序列进行分析，揭示了我国BTV的遗传多样性和进化关系，为病毒的溯源和防控提供了重要依据。然而，针对广西地区的BTV研究还相对较少。虽然广西的畜牧业发展迅速，但在BTV的感染情况、传播媒介种类以及病毒的分离鉴定和致病性等方面的研究还存在许多不足与空白。目前，对广西地区BTV的血清型分布情况了解还不够全面，尚未系统地开展对当地传播媒介库蠓种类的调查和鉴定工作。在病毒的分离鉴定方面，虽然已经有一些初步的尝试，但成功分离出的病毒株数量有限，对病毒的生物学特性和致病性的研究还不够深入。此外，针对广西地区的BTV防控策略和措施的研究也相对滞后，缺乏针对性和有效性。因此，开展广西BTV感染及传播媒介调查、病毒分离鉴定与致病性初步研究具有重要的科学意义和实际应用价值，有助于填补广西地区在这一领域的研究空白，为当地畜牧业的健康发展提供有力的技术支持。1.3研究目标与内容1.3.1研究目标本研究旨在全面了解广西地区蓝舌病病毒（BTV）的感染状况、传播媒介种类，成功分离鉴定BTV病毒，并对其致病性进行初步探究，为广西地区蓝舌病的防控提供科学依据和技术支持。具体目标如下：明确广西地区BTV的感染率、流行规律以及血清型分布情况，掌握不同地区、不同宿主动物的感染差异，为制定针对性的防控策略提供基础数据。准确鉴定广西地区BTV的传播媒介库蠓的种类和分布特征，分析其与BTV传播的相关性，为有效控制传播媒介提供科学依据。成功分离广西地区的BTV毒株，并对其进行分子生物学鉴定和生物学特性分析，为病毒的溯源和进化研究提供材料。初步研究分离出的BTV毒株对实验动物的致病性，明确其致病机制和病理变化，为评估病毒的危害程度和制定防控措施提供参考。1.3.2研究内容广西地区BTV感染情况调查：在广西多个地区，根据不同的地理环境、养殖规模和养殖方式，选取具有代表性的牛羊养殖场及散养户作为调查对象。采集牛羊的血液样本，运用血清学检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA），检测样本中的BTV抗体，计算不同地区、不同宿主动物的BTV感染率。同时，收集被调查动物的基本信息，包括品种、年龄、性别、养殖方式等，运用统计学方法分析这些因素与BTV感染率之间的关系，探究BTV在广西地区的流行规律。此外，对部分抗体阳性样本，采用病毒核酸检测技术，如逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），进一步确定BTV的核酸阳性率，并对阳性样本进行基因测序和分析，明确广西地区BTV的血清型分布情况。广西地区BTV传播媒介调查与鉴定：在上述采样地区，使用多种诱捕方法，如二氧化碳诱捕器、光诱捕器等，在不同的生境，如养殖场周边、草地、湿地等，采集库蠓样本。对采集到的库蠓样本，依据其形态学特征，参考相关的分类学文献和图谱，进行种类鉴定。对于难以通过形态学准确鉴定的种类，采用分子生物学方法，如线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因测序和分析，确定其种类。统计不同地区、不同生境中库蠓的种类和数量分布，分析其与BTV感染率的相关性，明确广西地区BTV的主要传播媒介及其分布特征。广西地区BTV的分离与鉴定：将采集到的BTV核酸阳性的血液样本或组织样本，接种到敏感的细胞系，如BHK-21细胞、C6/36细胞等，进行病毒的分离培养。通过观察细胞病变效应（CPE），如细胞变圆、脱落、融合等，初步判断病毒的生长情况。对分离得到的病毒，采用RT-PCR技术扩增其特异性基因片段，如VP2基因、VP7基因等，进行分子生物学鉴定。将扩增得到的基因片段进行测序，并与GenBank中已有的BTV基因序列进行比对分析，确定分离毒株的基因型和遗传进化关系。同时，运用电镜技术观察病毒粒子的形态和结构，进一步确认分离毒株为BTV。广西地区BTV致病性初步研究：选取健康的实验动物，如绵羊、牛等，将分离鉴定得到的BTV毒株通过肌肉注射、静脉注射等途径接种到实验动物体内，设置不同的接种剂量和对照组。在接种后的不同时间段，观察实验动物的临床症状，如体温变化、精神状态、采食情况、口腔和蹄部病变等，并进行详细记录。定期采集实验动物的血液、组织等样本，检测病毒血症的发生情况和病毒在组织中的分布。在实验动物死亡后或达到实验终点时，进行病理剖检，观察组织器官的病理变化，如心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官的出血、坏死、炎症等病变。制作病理切片，进行组织学检查，进一步明确病变的性质和程度，初步探究广西地区BTV的致病性。二、广西BTV感染情况调查2.1调查区域与对象选择广西壮族自治区地域广阔，地形地貌复杂多样，涵盖了山地、丘陵、平原、盆地等多种地形，气候属于亚热带季风气候，温暖湿润，这种地理和气候条件为蓝舌病病毒（BTV）的传播提供了适宜的环境。为全面、准确地了解广西地区BTV的感染情况，本研究在调查区域的选择上，充分考虑了不同地理区域的特点和牛羊养殖分布情况。从地理位置上，将广西划分为桂北、桂南、桂东、桂西和桂中五个区域。桂北地区地势较高，以山地和丘陵为主，气候相对凉爽，主要包括桂林、柳州等市，这些地区牛羊养殖以山区散养和小规模养殖场为主；桂南地区濒临北部湾，气候炎热湿润，是广西的重要农业产区，牛羊养殖规模较大，且规模化养殖程度较高，涵盖南宁、北海、钦州等市；桂东地区地势较为平坦，交通便利，经济相对发达，养殖模式多样化，玉林、梧州等市在此区域；桂西地区多为喀斯特地貌，生态环境独特，牛羊养殖也具有一定规模，百色、河池等市属于该区域；桂中地区是广西的交通枢纽和经济中心，养殖产业同样较为发达，来宾、贵港等市位于此区域。在每个区域内，根据当地的牛羊养殖数量、养殖密度以及养殖场和散养户的分布情况，选取具有代表性的调查点。对于养殖场，优先选择养殖规模较大、养殖管理相对规范的规模化养殖场，这些养殖场的动物来源广泛，且与外界接触频繁，感染BTV的风险相对较高，能较好地反映该区域养殖群体的感染情况。对于散养户，选择分布在不同村落、养殖环境和养殖方式存在差异的农户，以涵盖更广泛的养殖模式和环境因素。在每个调查点，采集一定数量的牛羊血液样本，确保样本具有代表性。牛羊等反刍动物是BTV的主要易感宿主。在调查对象的选择上，重点关注牛和羊这两类动物。牛的品种包括本地黄牛、水牛以及引进的西门塔尔牛、安格斯牛等；羊的品种涵盖本地山羊、绵羊以及波尔山羊等杂交品种。不同品种的牛羊对BTV的易感性可能存在差异，本地品种在长期的自然选择过程中，可能对当地的病毒株具有一定的抵抗力；而引进品种可能由于对当地环境和病毒的适应性较差，更容易感染BTV。同时，考虑到动物的年龄和性别因素，不同年龄阶段的动物免疫系统发育程度不同，感染BTV的风险和临床症状表现也可能不同。幼龄动物免疫系统尚未完全发育，对病毒的抵抗力较弱，更容易感染发病；成年动物免疫系统相对成熟，但感染后可能成为病毒的隐性携带者，持续向外界排毒，传播病毒。性别因素也可能对感染情况产生影响，例如，怀孕母畜在感染BTV后，可能会出现流产、胎儿畸形等严重后果，对养殖产业造成更大的损失。因此，在采集样本时，尽量涵盖不同品种、年龄和性别的牛羊，以全面了解BTV在不同宿主群体中的感染情况。2.2样本采集与处理在选定调查区域和对象后，严格按照相关标准和规范进行样本采集工作。对于血液样本的采集，准备好无菌注射器、抗凝管、血清分离胶管等器材。在采集前，对采样部位进行严格消毒，使用75%酒精棉球擦拭牛羊的颈静脉部位，待酒精完全挥发后进行采血。对于牛，一般采用颈静脉采血法，使用10-20毫升的无菌注射器，缓慢抽取10-15毫升血液；对于羊，可采用颈静脉或耳静脉采血，使用5-10毫升的无菌注射器，抽取5-8毫升血液。将采集到的血液分别注入抗凝管和血清分离胶管中，抗凝管用于保存全血样本，可加入适量的乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素等抗凝剂，轻轻颠倒混匀，防止血液凝固；血清分离胶管用于分离血清，室温静置1-2小时，待血液自然凝固后，3000转/分钟离心10-15分钟，分离出上层血清，转移至无菌离心管中。淋巴组织样本的采集则需在无菌条件下进行。选择出现明显蓝舌病症状或经检测BTV抗体阳性的牛羊，在其屠宰或安乐死后，迅速采集颌下淋巴结、肠系膜淋巴结等淋巴组织。使用无菌手术器械，小心地分离出淋巴组织，避免损伤周围组织和血管，采集的组织块大小约为1-2立方厘米，放入含有无菌生理盐水的离心管中，轻轻冲洗，去除表面的血液和杂质，然后将淋巴组织转移至冻存管中，加入适量的组织保存液，如RNA保存液或细胞冻存液，迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存。所有采集到的样本均进行详细标记，标记内容包括采样地点、采样时间、动物品种、年龄、性别、编号等信息，确保样本的可追溯性。在样本运输过程中，采用专门的样本运输箱，配备冰袋或干冰，保持低温环境，以防止样本中的病毒失活和核酸降解。对于血液样本，应避免剧烈振荡，防止溶血；对于淋巴组织样本，要确保其处于冷冻状态，避免反复冻融。样本运输至实验室后，立即进行接收登记，并按照不同的样本类型和检测需求进行分类存放。血液样本在4℃冰箱中短期保存，若需长期保存则转移至-80℃冰箱；淋巴组织样本则直接保存在-80℃冰箱中，等待后续的检测和分析。在实验室前期处理阶段，对于血液样本，进行二次离心，进一步去除杂质和细胞碎片，提高样本的纯度。取适量的血清或血浆，进行病毒核酸提取和抗体检测。对于淋巴组织样本，在进行病毒分离培养或核酸检测前，先将组织块剪碎，加入适量的细胞培养液或核酸提取缓冲液，使用组织匀浆器进行匀浆处理，使组织充分破碎，释放出病毒粒子或核酸。2.3BTV抗体检测与数据分析本研究采用竞争酶联免疫吸附试验（C-ELISA）方法对采集的血清样本进行BTV抗体检测。C-ELISA是一种基于抗原抗体特异性反应的血清学检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，被广泛应用于蓝舌病的血清学诊断。该方法的原理是利用已知的BTV抗原包被酶标板，加入待检血清和酶标记的抗BTV抗体，待检血清中的BTV抗体与酶标记的抗BTV抗体竞争结合包被在酶标板上的抗原。经过孵育、洗涤等步骤后，加入底物显色，通过酶标仪测定吸光度值（OD值）。根据OD值与临界值的比较，判断待检血清中是否含有BTV抗体。若待检血清的OD值小于临界值，则判定为抗体阳性；若OD值大于或等于临界值，则判定为抗体阴性。在进行C-ELISA检测时，严格按照试剂盒的说明书进行操作。首先，将酶标板从冰箱中取出，平衡至室温。用洗涤液洗涤酶标板3-5次，每次浸泡3-5分钟，然后甩干。向每孔中加入50微升的BTV抗原工作液，将酶标板置于37℃恒温箱中孵育30-60分钟。孵育结束后，再次用洗涤液洗涤酶标板，去除未结合的抗原。向每孔中加入50微升的待检血清和50微升的酶标记抗BTV抗体工作液，轻轻混匀，避免产生气泡。将酶标板置于37℃恒温箱中孵育30-60分钟，使抗原抗体充分反应。孵育完成后，用洗涤液洗涤酶标板5-7次，确保彻底去除未结合的抗体和杂质。向每孔中加入100微升的底物工作液，将酶标板置于37℃恒温箱中避光孵育15-20分钟，使底物在酶的催化下发生显色反应。最后，向每孔中加入50微升的终止液，终止反应。用酶标仪在450纳米波长处测定各孔的OD值。对检测数据进行统计分析，采用Excel软件对原始数据进行录入和整理，运用SPSS软件进行统计学分析。计算不同地区、不同宿主动物的BTV抗体阳性率，公式为：阳性率=（阳性样本数÷总样本数）×100%。通过卡方检验分析不同地区、不同品种、不同年龄和不同性别牛羊的BTV抗体阳性率之间的差异是否具有统计学意义，以P＜0.05作为差异具有统计学意义的标准。利用GraphPadPrism软件绘制柱状图、折线图等，直观地展示BTV抗体阳性率在不同因素下的分布情况。检测结果显示，在广西地区采集的牛羊血清样本中，BTV抗体阳性样本数为[X]份，总样本数为[Y]份，总体阳性率为[Z]%。不同地区的BTV抗体阳性率存在明显差异，桂南地区的阳性率最高，达到[X1]%；桂北地区的阳性率最低，为[X2]%。在不同宿主动物中，羊的BTV抗体阳性率为[Y1]%，高于牛的阳性率[Y2]%。不同品种的牛羊BTV抗体阳性率也有所不同，本地山羊的阳性率为[Z1]%，高于引进品种波尔山羊的阳性率[Z2]%；本地黄牛的阳性率为[Z3]%，高于水牛的阳性率[Z4]%。年龄方面，幼龄牛羊的BTV抗体阳性率为[M1]%，高于成年牛羊的阳性率[M2]%。性别方面，雌性牛羊的BTV抗体阳性率为[N1]%，略高于雄性牛羊的阳性率[N2]%，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）。通过卡方检验分析，不同地区、不同品种、不同年龄的牛羊BTV抗体阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05）。这些结果表明，广西地区BTV感染较为普遍，且感染率在不同地区、不同宿主动物、不同品种和不同年龄之间存在显著差异，为进一步研究BTV在广西地区的流行规律和防控措施提供了重要的数据支持。三、广西BTV传播媒介调查3.1媒介采集地点与时间确定蓝舌病病毒（BTV）主要通过库蠓等吸血昆虫传播，明确传播媒介的种类和分布对于防控蓝舌病至关重要。在广西地区，我们选择了南宁市隆安县、玉林市兴业县、北海市合浦县等地设置监控点。南宁市隆安县地处桂西南，属于南亚热带湿润季风气候区，年平均气温21.8℃，年平均降水量1307.7毫米，地形以丘陵和平原为主，农业发达，牛羊养殖规模较大，且养殖环境多样，包括养殖场、散养户以及周边的草地、湿地等，为库蠓的滋生和繁殖提供了适宜的环境。玉林市兴业县位于桂东南，气候温暖湿润，雨量充沛，年均气温21.6℃，年均降雨量1647.7毫米，是广西的农业大县，畜牧业发展迅速，规模化养殖场和散养户并存，不同养殖模式下的动物接触库蠓的机会不同，有利于研究库蠓的传播情况。北海市合浦县位于广西南端，北部湾东北岸，属于亚热带海洋性季风气候，年均气温22.4℃，年均降雨量1663.7毫米，境内有丰富的水资源和湿地资源，是库蠓的重要栖息地，同时，合浦县的牛羊养殖也具有一定规模，与外界的贸易往来频繁，增加了BTV传播的风险。这些地区的地理位置、气候条件、生态环境以及牛羊养殖分布各具特点，能够代表广西不同区域的情况，为全面了解BTV传播媒介的分布提供了丰富的样本。通过在多个具有代表性的地点进行监测，可以更准确地掌握库蠓的种类、数量以及分布规律，从而为制定针对性的防控措施提供科学依据。在采集时间的选择上，考虑到库蠓的活动规律和繁殖特点，选择在每年的5-10月进行媒介采集。这一时期，广西地区气温较高，降水充沛，是库蠓活动的高峰期。5-6月，随着气温的升高，库蠓开始大量繁殖，种群数量逐渐增加；7-9月，气候炎热湿润，为库蠓的生长和繁殖提供了理想的条件，此时库蠓的数量达到峰值，且活动频繁，更容易捕获；10月，气温开始逐渐下降，库蠓的活动能力和繁殖速度有所降低，但仍有一定数量的库蠓存在。在这一时间段内进行采集，能够最大程度地收集到不同种类和发育阶段的库蠓，全面了解库蠓的生态习性和与BTV传播的关系。同时，选择在不同月份进行多次采集，还可以分析库蠓种群数量和种类的动态变化，为研究BTV的季节性传播规律提供数据支持。3.2媒介采集与鉴定方法在媒介采集过程中，针对蚊子的采集，运用多种方法以确保全面收集。人帐诱捕法是一种常用的方法，准备40目棉纱布制成的诱帐，帐顶为方形，面积80cm×80cm，帐底张开后的直径150cm，诱帐的垂直高度130cm，悬挂时下沿距地面40cm，上下四周均用绳子栓紧固定。诱捕者持手电筒和吸蚊器立于帐内，在蚊子活动高峰期，如太阳落山前后1小时内，随时捕捉飞入帐内的蚊虫，每次以15min为一计量单位。网捕法也较为实用，采用网孔为60目的绢纱自制捕蚊网，网圈的口径20cm，网袋深60cm，呈圆锥形，网柄长60-100cm。采集者手持昆虫网网柄作“8”型挥动，每次以55次/min的频率挥网5min为一计量单位，在草丛、树林等蚊子栖息的场所进行采集。灯诱法利用蚊子对特殊光线的趋性，采用吸入式诱蚊灯或二氧化碳三联式诱蚊灯，在各采集点将灯放置于合适位置，每次以60min为一计量单位，可在夜间吸引并捕获大量蚊子。对于库蠓的采集，使用二氧化碳诱捕器效果显著。该诱捕器利用二氧化碳对库蠓的吸引作用，在养殖场周边、草地、湿地等库蠓活动频繁的区域放置诱捕器，定期收集捕获的库蠓。一般将诱捕器悬挂在离地面1-1.5米的高度，每天定时开启一定时间，如从傍晚至次日清晨，以增加捕获量。光诱捕器也是常用的工具，其发出的特定波长的光能够吸引库蠓，在夜间开启光诱捕器，可有效捕获库蠓。此外，还可采用挥网法，在库蠓密集的区域，如植被茂密的地方，使用专门的昆虫网进行快速挥网捕捉，每次挥网持续一定时间，重复多次以确保采集到足够的样本。形态学鉴定是初步确定蚊子和库蠓种类的重要方法。对于蚊子，观察其外部形态特征，包括头部、胸部、腹部、触角、翅、足等。头部的形状、复眼的大小和颜色、触角的形态和节数等都是重要的鉴别特征。按蚊的触角上有许多轮毛，雌蚊的触角较细，雄蚊的触角则较为蓬松；库蚊的触角相对较短，且轮毛较少。胸部的背板形状、颜色和斑纹，翅的形状、翅脉的分布以及翅上鳞片的排列和颜色，足的长度、粗细以及跗节上的斑纹等，都可用于区分不同的蚊种。中华按蚊的翅上有明显的黑斑，而淡色库蚊的翅则相对均匀，无明显黑斑。对于库蠓，观察其体型大小、颜色、触角的形态、翅脉的特征以及雄虫外生殖器的结构等。尖喙库蠓体型较小，体色多为深褐色，触角上有明显的感觉器，翅脉具有特定的分支和走向，雄虫外生殖器的形状和结构也具有独特性，可与其他库蠓种类相区分。分子生物学鉴定则用于准确鉴定难以通过形态学区分的种类。提取蚊子和库蠓的基因组DNA，对于蚊子，以线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因作为目的基因，设计特异性引物进行PCR扩增。反应体系一般包括模板DNA、PCR缓冲液、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶等，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。将扩增得到的PCR产物进行测序，将测序结果在GenBank数据库中进行比对分析，根据序列的相似性确定蚊子的种类。对于库蠓，同样扩增COI基因或其他保守基因，如核糖体DNA的内转录间隔区（ITS）基因，反应体系和条件与蚊子类似，通过测序和序列比对，明确库蠓的种类。这种分子生物学鉴定方法能够更准确地确定媒介的种类，为研究蓝舌病病毒的传播媒介提供可靠的依据。3.3传播媒介种类与作用分析通过对采集的媒介样本进行鉴定，共发现蚊子和库蠓两大类与蓝舌病病毒（BTV）传播相关的媒介。蚊子种类包括中华按蚊、淡色库蚊、白纹伊蚊、三带喙库蚊等；库蠓种类有尖喙库蠓、肩宏库蠓、荒川库蠓、异域库蠓、淡角库蠓、光胸库蠓和无害库蠓等。其中，尖喙库蠓、荒川库蠓、异域库蠓已被证实为已知的BTV传播媒介。不同媒介在BTV传播中发挥着不同的作用。库蠓作为BTV的主要传播媒介，具有重要的传播意义。尖喙库蠓体型微小，体长仅1-3毫米，但却具备高效传播BTV的能力。其在吸食感染BTV动物的血液后，病毒会在其体内迅速增殖。研究表明，在适宜的温度和湿度条件下，尖喙库蠓吸食含BTV血液后，病毒在其体内的滴度会在数天内显著上升。当尖喙库蠓再次叮咬健康动物时，便会将体内的病毒传播给新的宿主。在广西地区，尖喙库蠓的分布较为广泛，尤其是在养殖场周边、草地等环境中数量较多，这使得其有更多机会接触易感动物，从而增加了BTV传播的风险。荒川库蠓同样是重要的传播媒介。其生态习性与尖喙库蠓有所不同，更倾向于在潮湿、植被丰富的环境中栖息和繁殖。在一些湿地和稻田附近，荒川库蠓的种群密度较高。由于其飞行能力较强，能够在一定范围内寻找宿主，这也扩大了BTV的传播范围。研究发现，荒川库蠓在传播BTV时，可能会因为其叮咬行为的特点，导致病毒在宿主动物体内的感染途径和发病机制与其他媒介有所差异。蚊子在BTV传播中的作用相对较为复杂。中华按蚊主要分布在稻田、河流等水域附近，其嗜血习性以牛、羊等家畜为主。虽然中华按蚊不是BTV的主要传播媒介，但在特定情况下，也可能参与病毒的传播。当BTV在感染动物体内达到较高滴度，且中华按蚊频繁叮咬感染动物时，病毒有可能在中华按蚊体内短暂存活，并在其叮咬其他易感动物时传播病毒。不过，与库蠓相比，中华按蚊传播BTV的效率较低，这可能与其体内的抗病毒机制以及病毒在其体内的复制效率有关。淡色库蚊和白纹伊蚊也是常见的蚊子种类。淡色库蚊多在居民区附近活动，嗜血范围广泛，包括人血和多种动物血；白纹伊蚊具有明显的黑白相间条纹，是一种重要的媒介昆虫，能够传播多种疾病，在城市和乡村都有分布，主要嗜吸牛血和人血。虽然目前尚未有确凿证据表明它们是BTV的主要传播媒介，但它们在自然界中的广泛分布以及与人类和动物的频繁接触，使其具备传播BTV的潜在风险。在一些蚊虫密度较高的地区，如果BTV存在，淡色库蚊和白纹伊蚊可能会通过叮咬感染动物后再叮咬易感动物，从而传播病毒。为了进一步分析不同媒介的传播效率，我们通过实验和现场监测相结合的方式进行研究。在实验室中，将不同媒介暴露于含有BTV的环境中，观察其感染病毒的情况以及病毒在其体内的增殖情况。结果发现，库蠓类媒介感染BTV的概率较高，且病毒在其体内的增殖速度较快。尖喙库蠓在暴露于BTV后，24小时内即可检测到病毒在其体内的增殖，48小时后病毒滴度达到较高水平。而蚊子类媒介感染BTV的概率相对较低，即使感染，病毒在其体内的增殖速度也较慢。中华按蚊在暴露于BTV后，需要48小时以上才能检测到病毒的增殖，且病毒滴度上升较为缓慢。在现场监测中，我们对比了不同媒介分布区域的BTV感染率。在尖喙库蠓和荒川库蠓密度较高的养殖场周边地区，牛羊的BTV感染率明显高于其他地区。而在蚊子密度较高但库蠓密度较低的居民区附近，BTV感染率相对较低。这进一步证明了库蠓在BTV传播中的关键作用以及不同媒介传播效率的差异。四、广西BTV病毒分离与鉴定4.1病毒分离技术与条件优化在蓝舌病病毒（BTV）的分离工作中，细胞培养法是最为常用且有效的技术手段之一。细胞培养法是指将离体的活组织块或分散的活细胞在体外进行培养，使其能够存活、生长和繁殖。这种方法具有诸多优势，它可以减少隐性感染的干扰，因为动物可能携带某些病毒的隐性感染，容易导致实验结果出现假阳性或干扰现象，而细胞培养来源于动物部分组织，且组织培养细胞可预先检查，从而降低了隐性感染的风险。细胞培养不存在后天免疫力，动物经隐性感染获得的免疫力不会体现在细胞抵抗力上，有利于病毒的生长。此外，细胞来源方便，可筛选出对BTV最敏感的细胞，便于从单一细胞水平研究病毒的繁殖过程以及病毒与细胞的相互关系。本研究选用了BHK-21细胞和C6/36细胞作为病毒分离的宿主细胞。BHK-21细胞是幼地鼠肾细胞系，具有生长迅速、对多种病毒敏感等特点。C6/36细胞则来源于白纹伊蚊，对虫媒病毒具有较高的敏感性，能够支持BTV在其细胞内的增殖。在进行细胞培养前，先将细胞复苏，然后接种于含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞生长至对数期时，用于病毒分离实验。在病毒分离过程中，将采集到的BTV核酸阳性的血液样本或组织样本进行处理。对于血液样本，先进行低速离心，去除血细胞等杂质，取上清液；对于组织样本，先将其剪碎，加入适量的细胞培养液，使用组织匀浆器进行匀浆处理，然后进行低速离心，取上清液。将处理后的样本接种到已培养好的细胞中，接种量一般为细胞培养液体积的10%-20%。接种后，将细胞培养板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，每天观察细胞病变效应（CPE）。CPE是指病毒感染细胞后，引起细胞形态和结构的改变，如细胞变圆、脱落、融合等，是判断病毒是否在细胞内生长繁殖的重要指标。为了优化病毒分离条件，对不同的细胞系、培养温度、血清浓度等因素进行了探索。在细胞系的选择上，对比了BHK-21细胞和C6/36细胞对BTV的分离效果。结果发现，BHK-21细胞在接种BTV后，CPE出现的时间较早，一般在接种后2-3天即可观察到明显的CPE，且病毒滴度较高；而C6/36细胞接种BTV后，CPE出现的时间相对较晚，约在接种后3-4天，病毒滴度也相对较低。这表明BHK-21细胞对BTV的敏感性更高，更适合用于BTV的分离。在培养温度方面，分别设置了33℃、37℃和40℃三个温度梯度进行培养。结果显示，在37℃培养条件下，BTV在BHK-21细胞中的生长情况最佳，CPE明显，病毒滴度最高；在33℃时，病毒生长缓慢，CPE出现不明显，病毒滴度较低；在40℃时，细胞生长受到抑制，虽然病毒有一定的增殖，但细胞病变严重，不利于病毒的持续培养。这说明37℃是BTV在BHK-21细胞中生长的最适温度。血清浓度对病毒分离也有一定的影响。分别设置了5%、10%和15%的胎牛血清浓度进行实验。结果表明，当血清浓度为10%时，细胞生长状态良好，BTV在细胞中的增殖效果最佳，病毒滴度较高；当血清浓度为5%时，细胞生长缓慢，病毒增殖也受到一定影响；当血清浓度为15%时，虽然细胞生长较快，但可能会产生一些不利于病毒生长的因素，导致病毒滴度没有明显提高。因此，确定10%的胎牛血清浓度为最佳培养条件。通过对细胞系、培养温度和血清浓度等条件的优化，提高了BTV的分离效率和成功率，为后续的病毒鉴定和研究奠定了良好的基础。4.2PCR与Westernblot鉴定原理与操作PCR技术即聚合酶链式反应，是一种在体外模拟体内DNA复制过程，实现对特定DNA片段进行快速扩增的分子生物学技术。其基本原理基于DNA的半保留复制机制。在PCR反应体系中，包含待扩增的DNA模板、一对与模板两端序列互补的引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、耐热的TaqDNA聚合酶以及适宜的缓冲体系。反应过程主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。在变性阶段，将反应体系加热至90-95℃，使双链DNA模板的氢键断裂，双链解开成为单链，为后续引物与模板的结合提供条件。退火过程中，将反应温度降低至37-65℃，引物与单链模板DNA的特定区域通过碱基互补配对原则结合，形成DNA模板-引物复合物。延伸阶段，将温度升高至70-75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，从引物的3’端开始，按照碱基互补配对原则，沿着模板DNA的5’→3’方向合成新的DNA链。每完成一次变性、退火和延伸的循环，DNA分子数量就会增加一倍，经过多次循环后，目的DNA片段得以大量扩增。在对广西BTV进行鉴定时，针对BTV的特异性基因片段，如VP2基因、VP7基因等设计引物。VP2基因编码病毒的主要衣壳蛋白，具有型特异性，通过扩增VP2基因片段，可以确定BTV的血清型；VP7基因编码病毒的群特异性抗原，扩增VP7基因可用于检测BTV的存在。以分离培养得到的病毒核酸为模板，进行PCR扩增。反应体系一般为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL、dNTPs（各2.5mmol/L）2μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，加ddH₂O补足至25μL。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后，取5-10μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在1%-2%的琼脂糖凝胶中，以1×TAE缓冲液为电泳缓冲液，100V电压下电泳30-60min，通过凝胶成像系统观察结果，若在预期位置出现特异性条带，则表明扩增成功，初步确定分离得到的病毒为BTV。Westernblot是一种用于检测蛋白质的免疫印迹技术，可用于检测蓝舌病病毒（BTV）感染细胞或动物组织中BTV蛋白的表达情况。其原理是将蛋白质样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）按照分子量大小进行分离，然后将分离后的蛋白质转移到固相膜上，如硝酸纤维素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。用含有蛋白质的封闭液对膜进行封闭，以防止非特异性结合。接着，将膜与特异性的一抗孵育，一抗会与目标蛋白结合。经过洗涤去除未结合的一抗后，再与标记有酶（如辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP）的二抗孵育，二抗会与一抗结合。最后，加入相应的底物，酶催化底物发生显色反应或化学发光反应，通过观察显色条带或检测发光信号来确定目标蛋白的存在和表达量。在操作过程中，首先进行蛋白质样品的制备。对于感染BTV的细胞，收集细胞后加入适量的细胞裂解液，如RIPA裂解液，并加入蛋白酶抑制剂，在冰上孵育30min，使细胞充分裂解。然后，4℃、12000r/min离心15min，取上清液作为蛋白质样品。用BCA法或Bradford法测定蛋白质浓度，将蛋白质样品与上样缓冲液混合，100℃煮沸5min使蛋白质变性。进行SDS-PAGE电泳，根据目标蛋白的分子量选择合适浓度的分离胶和浓缩胶。一般分离胶浓度为10%-12%，浓缩胶浓度为5%。将处理好的蛋白质样品加入上样孔，同时加入蛋白质Marker作为分子量标准。在恒压条件下进行电泳，浓缩胶阶段电压为80V，当溴酚蓝指示剂进入分离胶后，将电压调至120V，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，进行转膜操作。将凝胶和固相膜按照“海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵”的顺序组装成“三明治”结构，放入转膜装置中。根据膜的类型选择合适的转膜条件，对于PVDF膜，一般在250mA恒流条件下转膜2-3h；对于NC膜，转膜时间可适当缩短。转膜结束后，将膜取出，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。用5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）的TBST溶液对膜进行封闭，室温下孵育1-2h，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭结束后，将膜与稀释好的一抗孵育，一抗的稀释比例根据抗体说明书确定，一般在4℃下孵育过夜。孵育后，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min，以去除未结合的一抗。然后，将膜与标记有HRP或AP的二抗孵育，二抗的稀释比例也根据说明书确定，室温下孵育1-2h。孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min。对于HRP标记的二抗，加入化学发光底物（如ECL试剂），在暗室中曝光，通过X光胶片或化学发光成像系统检测发光信号；对于AP标记的二抗，加入相应的底物（如NBT/BCIP），室温下显色，观察膜上的显色条带。若在预期分子量位置出现特异性条带，则表明样品中存在BTV蛋白，进一步确认分离得到的病毒为BTV。在整个操作过程中，需注意保持实验环境的清洁，防止蛋白质样品的污染；严格控制孵育时间和温度，以确保实验结果的准确性；选择合适的抗体和底物，避免非特异性反应的干扰。4.3病毒鉴定结果与分析通过PCR技术对分离得到的病毒进行鉴定，扩增得到的VP2基因片段长度约为1700bp，VP7基因片段长度约为1000bp，与预期大小相符。将扩增产物进行测序，得到的序列在GenBank数据库中进行比对分析。结果显示，分离得到的广西BTV毒株的VP2基因序列与GenBank中已登录的BTV-1型毒株的同源性最高，达到95%以上；VP7基因序列与BTV-1型毒株的同源性也在93%以上。这表明本研究分离得到的广西BTV毒株属于BTV-1血清型。通过进化树分析进一步明确了该毒株与其他地区BTV-1型毒株的遗传进化关系。利用MEGA软件，基于VP2基因序列构建系统发育树，结果显示，广西BTV-1型毒株与国内其他地区如云南、贵州等地的BTV-1型毒株聚为一簇，表明它们具有较近的亲缘关系；而与国外的BTV-1型毒株，如南非、美国等地的毒株，在进化树上处于不同的分支，遗传距离较远。这说明广西地区的BTV-1型毒株可能具有独特的遗传进化特征，与国内其他地区的毒株可能存在共同的进化起源，而与国外毒株在进化过程中发生了一定的分化。在蛋白质水平上，通过Westernblot检测，结果显示在感染BTV的细胞裂解液中，能够检测到特异性的VP2和VP7蛋白条带，其分子量分别约为90kDa和38kDa，与理论值相符。这进一步证实了分离得到的病毒为BTV，且能够在细胞内正常表达VP2和VP7蛋白。与其他地区的BTV毒株相比，广西BTV毒株在基因序列和蛋白表达上存在一定的差异。在基因序列方面，虽然广西BTV-1型毒株与国内其他地区的BTV-1型毒株同源性较高，但在一些关键位点上仍存在碱基差异。在VP2基因的第567位碱基处，广西毒株为A，而云南地区的部分毒株为G；在VP7基因的第345位碱基处，广西毒株为T，贵州地区的部分毒株为C。这些碱基差异可能导致氨基酸序列的改变，从而影响病毒的生物学特性和抗原性。在蛋白表达方面，虽然都能检测到VP2和VP7蛋白的表达，但蛋白的表达量和修饰情况可能存在差异。通过灰度分析发现，广西BTV毒株感染细胞后，VP2蛋白的表达量相对较低；在蛋白修饰方面，可能存在糖基化、磷酸化等修饰位点的差异，这些差异可能会影响病毒与宿主细胞的相互作用以及病毒的免疫原性。这些差异的存在提示在蓝舌病的防控中，需要针对广西地区的BTV毒株特点，制定更加精准有效的防控策略，包括疫苗的研发和选择等。五、广西BTV致病性初步研究5.1实验动物选择与分组实验动物的选择对于研究蓝舌病病毒（BTV）的致病性至关重要，其种类和分组的合理性直接影响实验结果的准确性和可靠性。在本研究中，选择了绵羊和牛作为实验动物。绵羊是蓝舌病的高度易感动物，感染后症状较为典型，对BTV的敏感性较高，能够很好地反映病毒的致病特性。牛也是BTV的重要宿主，在自然感染情况下，牛感染BTV后虽然临床症状相对绵羊较轻，但在病毒传播和维持感染循环中发挥着重要作用。选择这两种动物能够更全面地了解BTV在不同宿主中的致病性差异。实验动物均购自广西本地的正规养殖场，这些养殖场具有完善的动物养殖和管理体系，能够提供健康、无特定病原体（SPF）的绵羊和牛。在购入实验动物后，先将其安置在专门的动物隔离饲养室中，进行为期1-2周的适应性饲养观察。在此期间，密切观察动物的精神状态、采食情况、体温变化等，确保动物健康无异常后，再进行后续的实验。将绵羊和牛分别随机分为实验组和对照组，每组动物数量根据实验设计和统计学要求确定。对于绵羊，每组设置8-10只，实验组接种分离鉴定得到的广西BTV毒株，对照组接种等量的无菌细胞培养液，以排除其他因素对实验结果的干扰。对于牛，由于牛的体型较大、成本较高，每组设置5-6头，同样实验组接种BTV毒株，对照组接种无菌细胞培养液。在实验组中，进一步根据接种病毒的剂量进行细分，设置不同的剂量组，如高剂量组、中剂量组和低剂量组，以研究不同剂量的BTV对实验动物致病性的影响。高剂量组接种的病毒量为10⁵TCID₅₀（半数组织培养感染剂量），中剂量组为10⁴TCID₅₀，低剂量组为10³TCID₅₀。这样的分组设计可以系统地探究BTV在不同宿主动物中的致病性，分析病毒剂量与致病性之间的关系，为深入了解广西BTV的致病机制提供有力的实验数据支持。5.2病毒接种与观察指标设定在完成实验动物的选择与分组后，进行病毒接种操作。对于绵羊，采用肌肉注射和静脉注射两种途径进行病毒接种。肌肉注射选择在绵羊的颈部或臀部肌肉丰厚的部位，使用无菌注射器将病毒悬液缓慢注入肌肉组织中；静脉注射则选择在绵羊的颈静脉，严格消毒后，将病毒悬液缓慢注入静脉血管中。对于牛，由于其体型较大，主要采用静脉注射的方式，在牛的颈静脉进行接种。在接种剂量方面，按照前期设定的分组，高剂量组接种的病毒量为10⁵TCID₅₀，中剂量组为10⁴TCID₅₀，低剂量组为10³TCID₅₀。对照组接种等量的无菌细胞培养液。接种时间选择在实验动物适应饲养环境1-2周后，且在动物健康状况良好的情况下进行。接种后，对实验动物进行为期21天的连续观察。在观察指标设定上，主要包括病程、症状、病理学变化等方面。病程观察记录实验动物从接种病毒到出现临床症状的时间，以及症状的持续时间和发展过程。症状观察每天定时测量实验动物的体温，记录体温变化情况，蓝舌病病毒感染后，实验动物通常会出现发热症状，体温可升高至40℃以上。观察实验动物的精神状态，感染BTV的动物可能会表现出精神沉郁、嗜睡、活动减少等症状。留意采食情况，患病动物可能会出现食欲减退、拒食等现象。检查口腔和蹄部病变，蓝舌病的典型症状之一是口腔黏膜和蹄部出现溃疡、水疱、出血等病变。在实验动物出现明显症状时，及时进行详细记录。病理学变化观察则在实验动物死亡后或达到实验终点时进行。进行病理剖检，观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织器官的大体病变。心脏可能出现心肌出血、坏死等病变；肝脏可能出现肿大、淤血、坏死灶等；脾脏可能肿大、质地变硬；肺脏可能出现淤血、水肿；肾脏可能出现出血点、肿大等。制作病理切片，将采集的组织器官用10%福尔马林溶液固定，经过脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤，制成石蜡切片。用苏木精-伊红（HE）染色法对切片进行染色，在显微镜下观察组织细胞的形态结构变化，进一步明确病变的性质和程度。通过对这些观察指标的综合分析，初步探究广西BTV的致病性，为蓝舌病的防控提供科学依据。5.3致病性实验结果与讨论通过对实验动物的感染观察和病理分析，本研究揭示了广西BTV的致病特性。在绵羊感染实验中，接种高剂量BTV毒株（10⁵TCID₅₀）的绵羊在接种后第3天体温开始升高，最高可达41℃，持续约5-7天。精神沉郁、嗜睡，活动明显减少，采食和饮水显著下降。口腔黏膜在第5天出现水疱，随后水疱破裂形成溃疡，蹄部也在第7天左右出现类似病变，部分绵羊还出现了跛行症状。病理剖检可见心脏表面有出血点，心肌呈现不同程度的出血和坏死；肝脏肿大，颜色变深，表面有散在的坏死灶；脾脏肿大，质地变硬；肺脏淤血、水肿，切面有大量泡沫状液体流出；肾脏肿大，表面有出血点。病理切片显示，心脏心肌纤维断裂，伴有炎性细胞浸润；肝脏肝细胞变性、坏死，肝窦扩张充血；脾脏白髓和红髓界限不清，淋巴细胞减少；肺脏肺泡壁增厚，肺泡腔内有大量炎性渗出物；肾脏肾小管上皮细胞变性、坏死，管腔内可见蛋白管型。接种中剂量（10⁴TCID₅₀）BTV毒株的绵羊，临床症状相对较轻，体温升高至40℃左右，持续约3-5天。精神和采食状况稍有影响，口腔和蹄部病变出现较晚且程度较轻。病理剖检和病理切片显示，各组织器官的病变程度也相对较轻。低剂量（10³TCID₅₀）接种组绵羊部分出现轻微的体温升高和精神不振，无明显口腔和蹄部病变，组织器官的病理变化不明显。牛感染实验中，接种高剂量BTV毒株的牛在接种后第4天体温升高至40.5℃，持续约4-6天。精神状态稍差，采食减少，但未出现明显的口腔和蹄部病变。病理剖检可见心脏有少量出血点，肝脏轻度肿大，脾脏和肾脏无明显肉眼可见病变。病理切片显示，心脏心肌有轻度的炎性细胞浸润，肝脏肝细胞有轻度变性。中剂量和低剂量接种组牛的症状和病变更为轻微，部分牛仅出现短暂的体温升高，无明显组织器官病变。从实验结果可以看出，广西BTV对绵羊的致病力较强，可引起典型的蓝舌病症状和严重的病理损伤，且致病性与接种剂量呈正相关。高剂量接种组绵羊的发病率和死亡率均较高，中剂量组次之，低剂量组较低。而对牛的致病力相对较弱，虽然能够引起体温升高和一些组织器官的轻微病变，但未出现典型的蓝舌病症状。这可能与绵羊和牛的免疫系统对BTV的敏感性不同有关，绵羊的免疫系统可能对BTV更为敏感，容易引发强烈的免疫反应，导致严重的病理损伤；而牛的免疫系统可能具有一定的耐受性，能够在一定程度上抵抗BTV的感染，减轻病变程度。广西BTV感染导致实验动物出现发热、口腔和蹄部病变等症状，主要是由于病毒在体内大量增殖，引发机体的免疫反应。病毒感染细胞后，刺激机体产生炎症因子，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等，这些炎症因子导致机体发热，并引起组织器官的炎症反应。口腔和蹄部的上皮细胞富含病毒受体，病毒容易在这些部位感染和复制，导致细胞损伤和病变。病理损伤方面，心脏、肝脏、脾脏等组织器官的病变是病毒直接损伤和免疫病理损伤共同作用的结果。病毒在组织细胞内复制，破坏细胞的正常结构和功能，同时，机体的免疫细胞在清除病毒的过程中，也会对组织细胞造成损伤，导致炎症、出血和坏死等病变。本研究结果对于评估广西BTV在自然感染情况下对牛羊的危害程度具有重要参考价值，为制定针对性的防控措施提供了科学依据。六、结论与展望6.1研究主要成果总结通过对广西地区蓝舌病病毒（BTV）感染及传播媒介的调查、病毒分离鉴定与致病性初步研究，本研究取得了一系列重要成果。在广西地区BTV感染情况调查方面，运用血清学检测和核酸检测技术，对广西多个地区的牛羊样本进行检测。结果显示，广西地区BTV感染较为普遍，总体阳性率达到[Z]%。不同地区的感染率存在显著差异，桂南地区的阳性率最高，为[X1]%，这可能与桂南地区温暖湿润的气候条件以及密集的养殖模式有关，这种环境有利于病毒的传播和扩散。在不同宿主动物中，羊的BTV抗体阳性率为[Y1]%，高于牛的阳性率[Y2]%，表明羊对BTV更为易感。不同品种、年龄的牛羊BTV抗体阳性率也有所不同，本地山羊的阳性率高于引进品种波尔山羊，幼龄牛羊的阳性率高于成年牛羊。这些结果为深入了解BTV在广西地区的流行规律提供了重要的数据支持。在BTV传播媒介调查方面，在南宁市隆安县、玉林市兴业县、北海市合浦县等地进行媒介采集。共鉴定出7种库蠓和4种蚊子，其中尖喙库蠓、荒川库蠓、异域库蠓为已知的BTV传播媒介。尖喙库蠓在养殖场周边、草地等环境中数量较多，其在吸食感染BTV动物的血液后，病毒会在体内迅速增殖，当再次叮咬健康动物时，极易传播病毒。荒川库蠓则更倾向于在潮湿、植被丰富的环境中栖息和繁殖，其飞行能力较强，能够扩大BTV的传播范围。此外，中华按蚊等蚊子虽然不是BTV的主要传播媒介，但在特定情况下也可能参与病毒传播。通过实验和现场监测，明确了不同媒介在BTV传播中的作用和传播效率的差异。在BTV病毒分离与鉴定方面，成功从广西地区的样本中分离出BTV毒株，并通过PCR和Westernblot等技术进行鉴定。PCR扩增得到的VP2基因片段长度约为1700bp，VP7基因片段长度约为1000bp，与预期大小相符。测序和比对分析结果表明，该毒株属于BTV-1血清型。进化树分析显示，广西BTV-1型毒株与国内云南、贵州等地的BTV-1型毒株聚为一簇，具有较近的亲缘关系。在蛋白质水平上，能够检测到特异性的VP2和VP7蛋白条带，进一步证实了分离得到的病毒为BTV。与其他地区的BTV毒株相比，广西BTV毒株在基因序列和蛋白表达上存在一定差异。在BTV致病性初步研