广西宠物犬星状病毒的分子流行病学与ORF2基因探秘：现状、特征与进化分析

广西宠物犬星状病毒的分子流行病学与ORF2基因探秘：现状、特征与进化分析一、引言1.1研究背景与意义随着人们生活水平的提高，宠物犬在家庭中的地位日益重要，其健康问题也受到广泛关注。犬星状病毒（CanineAstrovirus，CAstV）作为引发犬胃肠炎疾病的病原之一，近年来逐渐进入人们的视野。CAstV属于星状病毒科哺乳动物星状病毒属，是一种单股正链RNA病毒，呈圆形，主要通过粪-口途径经消化道传播，被污染的食物和水是常见的传播媒介。在哺乳动物中，星状病毒通常与肠道疾病相关，感染犬星状病毒的宠物犬常出现腹泻、腹痛和呕吐等症状，7周龄以下的幼犬由于免疫系统尚未发育完全，更容易感染该病毒。而且，犬星状病毒还可能与犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬细小病毒等其他病毒伴发感染。这种混合感染会使病情变得更加复杂和严重，显著增加犬的死亡率，不仅威胁宠物犬的生命健康，也给宠物饲养者带来了精神和经济上的双重负担。目前，虽然对犬星状病毒已有一定研究，但该病原在宠物犬中的临床表现形式及其流行规律尚未完全清楚。不同地区的气候、环境、饲养管理方式以及宠物犬的品种、年龄、免疫状况等因素，都可能影响犬星状病毒的流行和传播。广西地区具有独特的地理环境和气候条件，温暖湿润的气候为病毒的生存和传播提供了适宜的环境。同时，广西的宠物犬养殖规模不断扩大，宠物交易频繁，这也增加了病毒传播的风险。了解广西地区宠物犬星状病毒的分子流行病学特征，对于掌握该病毒在当地的流行情况、制定针对性的防控措施具有重要意义。通过对ORF2基因序列分析，可以深入了解病毒的遗传进化关系和变异规律，为疫苗和诊断试剂的研发提供理论依据。一方面，精准的分子流行病学调查结果能够帮助兽医及时发现疫情的爆发点和传播途径，采取有效的隔离、消毒等防控措施，降低病毒在宠物犬群体中的传播风险。另一方面，对ORF2基因序列的深入研究有助于开发更加敏感、特异的诊断方法，实现对犬星状病毒感染的早期诊断和精准治疗，从而提高宠物犬的治愈率，保障宠物犬的健康，促进广西宠物犬养殖和相关产业的健康发展。1.2国内外研究现状自1975年首次在腹泻儿童粪便中发现星状病毒以来，国内外学者围绕星状病毒开展了大量研究。在犬星状病毒研究方面，国外起步相对较早，早期研究主要集中在病毒的分离鉴定与基本生物学特性方面。通过细胞培养和电镜观察等技术，明确了犬星状病毒的形态结构特征，即病毒粒子呈二十面体对称，直径约为28-30nm，表面有5-6个星状突起，在氯化铯中的浮力密度约为1.33-1.34g/cm³，对乙醚、氯仿等脂溶剂不敏感。随着分子生物学技术的飞速发展，国外研究逐渐深入到基因层面。通过对犬星状病毒全基因组测序与分析，揭示了其基因组结构。犬星状病毒基因组为单股正链RNA，长度约为6.8-7.9kb，包含3个开放阅读框（ORF），分别编码非结构蛋白、RNA依赖的RNA聚合酶和衣壳蛋白。不同地区分离的犬星状病毒在基因序列上存在一定差异，基于ORF1b和ORF2基因的遗传进化分析，将犬星状病毒分为多个基因型，不同基因型在地域分布和致病性上表现出一定特点。在流行病学研究方面，国外多个国家开展了犬星状病毒的血清学调查和分子流行病学调查。结果显示，犬星状病毒在犬群中普遍存在，感染率因地区、饲养环境和犬的年龄等因素而异。例如，在一些欧美国家，宠物犬的感染率在10%-30%之间，幼犬的感染率明显高于成年犬，且在腹泻犬中的检出率显著高于健康犬。此外，还发现犬星状病毒与其他肠道病毒的混合感染较为常见，混合感染会加重犬的病情，增加治疗难度。国内对犬星状病毒的研究相对较晚，但近年来发展迅速。早期研究主要借鉴国外的检测方法，对国内部分地区犬群进行了初步的流行病学调查。例如，在部分城市的宠物医院和养殖场采集犬粪便样本，利用RT-PCR等技术检测犬星状病毒，发现我国犬群中也存在一定比例的感染。一些研究表明，我国不同地区宠物犬的感染率在5%-35%之间，与国外报道的感染率范围有一定重叠。在基因序列分析方面，国内学者对部分分离株的ORF2基因进行了克隆和测序，分析其遗传变异特征。结果显示，我国犬星状病毒分离株与国外参考毒株在基因序列上存在一定的同源性，但也有独特的变异位点，表明我国犬星状病毒在进化过程中受到地域和宿主等因素的影响。同时，通过构建遗传进化树，探讨了我国犬星状病毒与其他地区毒株的亲缘关系，为深入了解病毒的传播和进化规律提供了依据。然而，目前关于广西地区宠物犬星状病毒的研究相对较少。虽然已有研究初步调查了广西南宁市宠物犬星状病毒的感染情况，但研究范围较为局限，仅涉及部分地区和少数样本，对于该病毒在广西全区宠物犬中的流行特征、基因型分布以及与其他病毒的混合感染情况等方面仍缺乏全面、系统的研究。在ORF2基因序列分析方面，尚未有针对广西地区宠物犬星状病毒的深入研究，无法明确该地区病毒株的遗传进化特点及其与其他地区毒株的差异。本研究旨在填补这些空白，为广西地区宠物犬星状病毒的防控和相关研究提供科学依据。1.3研究目标与内容本研究旨在通过对广西地区宠物犬星状病毒进行全面的分子流行病学调查，揭示其在宠物犬群体中的流行特征，并对ORF2基因序列进行深入分析，了解其遗传进化规律和变异特点。在研究内容上，首先要进行样本采集，计划在广西全区范围内，包括南宁、柳州、桂林、梧州、北海等多个城市的宠物医院、宠物养殖场以及流浪动物救助站，采集宠物犬粪便样本。根据不同地区的宠物犬数量、饲养环境和疫病流行情况，确定合理的采样数量和分布，以确保样本具有代表性。预计采集500-800份粪便样本，涵盖不同品种、性别、年龄的宠物犬。其次，要对样本进行检测与数据分析，利用RT-PCR技术对采集的粪便样本进行犬星状病毒核酸检测，优化反应条件，确保检测的灵敏度和特异性。对检测结果进行统计分析，计算广西地区宠物犬星状病毒的总体感染率，分析不同地区、品种、性别、年龄宠物犬的感染差异，探讨感染率与饲养环境、免疫状况等因素的相关性。同时，调查犬星状病毒与犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬细小病毒等其他常见病毒的混合感染情况，分析混合感染对宠物犬健康的影响。再者，对ORF2基因进行扩增与测序，选取部分犬星状病毒阳性样本，通过RT-PCR扩增ORF2基因片段，优化扩增条件，确保扩增产物的质量和纯度。对扩增得到的ORF2基因片段进行测序，采用Sanger测序或高通量测序技术，获得高质量的基因序列数据。最后，进行基因序列分析，将测序得到的ORF2基因序列与GenBank中已公布的犬星状病毒参考序列进行比对，分析广西地区毒株与其他地区毒株的同源性，确定其在遗传进化树中的位置。通过构建遗传进化树，研究广西地区宠物犬星状病毒的遗传进化关系，探讨其进化起源和传播途径。分析ORF2基因的变异位点和变异类型，研究变异对病毒生物学特性和致病性的影响。二、材料与方法2.1样本采集样本采集工作于[具体年份]的[具体月份区间]展开，这一时期广西地区气候相对稳定，宠物犬活动较为频繁，且各类宠物交易、养殖活动正常开展，能够较好地反映全年宠物犬的健康状况及病毒感染情况。在地域选择上，综合考虑广西地区的地理分布、经济发展水平以及宠物犬养殖和交易的活跃程度，选取了南宁、柳州、桂林、梧州、北海、钦州、防城港、贵港、玉林、百色、贺州、河池、来宾、崇左这14个城市。其中，南宁作为广西的首府，宠物犬数量众多，宠物医院和养殖场密集，是重要的采样点；柳州、桂林等城市经济较为发达，宠物市场活跃，也具有代表性；而防城港、钦州等沿海城市以及百色、河池等山区城市，因其独特的地理环境和气候条件，可能对宠物犬星状病毒的流行产生影响，同样被纳入采样范围。样本来源涵盖宠物医院、宠物养殖场以及流浪动物救助站。在宠物医院，主要采集前来就诊且有腹泻、呕吐等疑似胃肠道症状的宠物犬粪便样本，同时也采集部分无症状宠物犬的粪便作为对照，以了解病毒在健康犬中的携带情况。宠物养殖场则选取规模较大、养殖管理相对规范的场所以及一些小型散养户，采集不同批次、不同年龄段宠物犬的粪便样本，以反映养殖场内犬星状病毒的流行态势。流浪动物救助站的流浪犬生活环境相对复杂，免疫力参差不齐，是病毒传播的潜在风险群体，因此也采集了一定数量的粪便样本。在每个城市，按照不同样本来源进行分层抽样。计划在每个城市的宠物医院采集50-80份样本，宠物养殖场采集30-50份样本，流浪动物救助站采集20-30份样本。最终，共采集得到700份宠物犬粪便样本。在采集过程中，使用无菌棉签蘸取粪便样本，放入含有1mlPBS缓冲液（pH7.4，含青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL）的无菌离心管中，充分搅拌混匀，使粪便与缓冲液充分接触。标记好样本的采集地点、时间、宠物犬的品种、性别、年龄等信息，将样本置于冰盒中保存，并在24小时内送至实验室进行处理。若不能及时检测，将样本保存在-80℃冰箱中，以防止病毒核酸降解。2.2主要试剂与仪器在本次研究中，主要试剂包括核酸提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR扩增相关试剂以及其他辅助试剂。核酸提取选用[具体品牌]的病毒核酸提取试剂盒，货号为[具体货号]，该试剂盒采用硅胶膜离心柱技术，能够高效、快速地从粪便样本中提取病毒核酸，具有操作简便、提取纯度高的特点，可有效去除杂质和抑制剂，确保后续检测的准确性。反转录过程使用[具体品牌]的反转录试剂盒，货号为[具体货号]。该试剂盒包含了反转录所需的各种酶和缓冲液，如逆转录酶、RNA酶抑制剂等，能够将提取的RNA逆转录为cDNA，其高效的反转录活性和良好的稳定性为后续的PCR扩增提供了高质量的模板。PCR扩增试剂中，选用[具体品牌]的rTaqDNA聚合酶，货号为[具体货号]，该酶具有高保真度和高效扩增能力，能够在较短时间内扩增出目的基因片段，且具有较低的错配率，保证了扩增产物的准确性。dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）购自[具体品牌]，货号为[具体货号]，其质量稳定，可满足PCR反应对核苷酸的需求。MgCl₂溶液用于优化PCR反应体系，调整镁离子浓度，以提高扩增效率，购自[具体品牌]，货号为[具体货号]。引物由[引物合成公司名称]合成，正向引物CaAstV-F序列为5'-GAGTTTGATTGGACCAGATTTGA-3'，反向引物CaAstV-R序列为5'-GGCTTAACCCACATTCCAAA-3'，预期扩增片段大小为419bp。这对引物是根据犬星状病毒保守区域设计，具有良好的特异性，能够准确扩增出犬星状病毒的目标基因片段。DNA分子量标准选用[具体品牌]的DL2000DNAMarker，货号为[具体货号]，其包含了不同大小的DNA片段，可用于在琼脂糖凝胶电泳中判断PCR扩增产物的大小。实验中使用的其他辅助试剂，如0.01MPBS缓冲液（pH7.4，含青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL）用于粪便样本的稀释和保存，按照附录A中的A.1方法进行配制；TAE电泳缓冲液用于琼脂糖凝胶电泳，按照附录A中的A.2方法配制；2%琼脂糖凝胶用于分离PCR扩增产物，按照附录A中的A.3方法配制；Goldview核酸染料用于在紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的DNA条带。主要仪器包括PCR仪、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、电泳仪和凝胶成像系统等。PCR仪采用[具体品牌]的[具体型号]，具有温度控制精确、升降温速度快的特点，能够满足不同PCR反应程序的需求，可同时进行多个样本的扩增反应。高速冷冻离心机为[具体品牌]的[具体型号]，最大转速可达[具体转速]，可在低温条件下对样本进行离心，用于核酸提取过程中的分离和沉淀步骤，确保样本的完整性和纯度。核酸蛋白测定仪选用[具体品牌]的[具体型号]，可准确测定核酸和蛋白质的浓度及纯度，为实验提供可靠的数据支持。电泳仪为[具体品牌]的[具体型号]，能够提供稳定的电场强度，保证DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速度和分离效果。凝胶成像系统采用[具体品牌]的[具体型号]，可对电泳后的琼脂糖凝胶进行拍照和分析，清晰显示DNA条带，便于结果的观察和记录。2.3分子流行病学调查方法本研究采用RT-套式PCR（ReverseTranscription-NestedPCR）技术对采集的宠物犬粪便样本进行犬星状病毒核酸检测。RT-套式PCR技术是在常规RT-PCR基础上发展而来，它通过两轮PCR扩增来提高检测的灵敏度和特异性。第一轮PCR扩增出目的基因的一个较大片段，然后以第一轮PCR的产物为模板，用位于第一轮引物内侧的另一对引物进行第二轮PCR扩增，进一步扩增出目的基因的特异性片段。这种方法能够有效减少非特异性扩增产物的干扰，提高检测的准确性，尤其适用于低含量病毒核酸的检测。核酸提取是RT-套式PCR检测的关键步骤之一，其质量直接影响后续检测结果。使用[具体品牌]的病毒核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。取200μL粪便样本与PBS缓冲液的混合液加入到核酸提取试剂盒的裂解液中，充分振荡混匀，使病毒粒子破裂释放出核酸。将混合液转移至吸附柱中，12000rpm离心1分钟，使核酸吸附在硅胶膜上。依次用洗涤液1和洗涤液2对吸附柱进行洗涤，去除杂质和抑制剂。最后，向吸附柱中加入50μL洗脱缓冲液，室温静置2-3分钟，12000rpm离心1分钟，将洗脱的核酸收集到离心管中，得到的核酸提取物用于后续的反转录反应。反转录过程使用[具体品牌]的反转录试剂盒。在一个无RNA酶的离心管中，加入5μL提取的核酸、1μL随机引物（10μM）、1μLdNTPs（10mM），轻轻混匀后，65℃孵育5分钟，然后迅速置于冰上冷却。再加入4μL5×反转录缓冲液、1μLRNA酶抑制剂（40U/μL）、1μL逆转录酶（200U/μL），轻轻混匀，总体积为20μL。将离心管放入PCR仪中，按照以下程序进行反转录反应：37℃孵育60分钟，70℃孵育10分钟，反应结束后，得到的cDNA产物可在-20℃保存备用。第一轮PCR扩增体系总体积为25μL，包括5μLcDNA模板、2.5μL10×PCR缓冲液、2μLMgCl₂（25mM）、0.5μLdNTPs（10mM）、0.5μL正向引物CaAstV-F（10μM）、0.5μL反向引物CaAstV-R（10μM）、0.25μLrTaqDNA聚合酶（5U/μL）以及13.75μL灭菌去离子水。将各成分依次加入到无核酸酶的PCR管中，轻轻混匀，瞬时离心。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环；最后72℃延伸10分钟。第二轮PCR扩增以第一轮PCR产物为模板，扩增体系和反应程序与第一轮类似，但引物使用巢式引物。巢式引物的设计是基于第一轮引物扩增区域内的更保守序列，正向巢式引物CaAstV-Nested-F序列为5'-TGGACCAGATTTGATGGACAA-3'，反向巢式引物CaAstV-Nested-R序列为5'-CATTCCAAAGAGTCTGGTGGA-3'，预期扩增片段大小为256bp。第二轮PCR扩增体系总体积同样为25μL，其中模板使用第一轮PCR产物1μL，其余成分与第一轮相同。反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。在操作过程中，需严格遵守实验室生物安全规范。核酸提取、反转录和PCR扩增应在不同的实验区域进行，以防止交叉污染。使用带滤芯的吸头，避免移液器污染试剂和样本。每次实验都要设置阳性对照和阴性对照，阳性对照使用已知含有犬星状病毒核酸的样本，阴性对照使用灭菌去离子水。阳性对照应出现特异性扩增条带，阴性对照无扩增条带，以此来验证实验结果的可靠性。若实验过程中出现污染或异常结果，应及时查找原因并重新进行实验。2.4ORF2基因序列分析方法2.4.1ORF2基因扩增在完成分子流行病学调查，确定犬星状病毒阳性样本后，选取30份阳性样本进行ORF2基因扩增。根据GenBank中已公布的犬星状病毒ORF2基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。正向引物ORF2-F序列为5'-ATGGTGCTGATGGAGAAGAA-3'，反向引物ORF2-R序列为5'-TTAGCCACTGTGGCTGAAAC-3'，预期扩增片段大小为1800bp左右。引物由[引物合成公司名称]合成。扩增体系总体积为50μL，包括10μLcDNA模板、5μL10×PCR缓冲液、4μLMgCl₂（25mM）、1μLdNTPs（10mM）、1μL正向引物ORF2-F（10μM）、1μL反向引物ORF2-R（10μM）、0.5μLrTaqDNA聚合酶（5U/μL）以及27.5μL灭菌去离子水。将各成分依次加入到无核酸酶的PCR管中，轻轻混匀，瞬时离心。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共进行35个循环；最后72℃延伸10分钟。为确保扩增的准确性，每次实验均设置阳性对照和阴性对照。阳性对照使用已知含有犬星状病毒ORF2基因的质粒DNA，阴性对照使用灭菌去离子水代替模板。反应结束后，取5μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统下观察并拍照，若阳性对照出现特异性扩增条带，阴性对照无扩增条带，且目的条带大小与预期相符，则表明扩增成功。2.4.2测序与序列获取将扩增得到的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，使用[具体品牌]的凝胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书进行回收纯化。该试剂盒利用硅胶膜特异性吸附DNA的原理，通过一系列洗涤步骤去除杂质，最终得到高纯度的DNA片段。回收后的DNA片段使用Nanodrop2000核酸蛋白测定仪测定浓度和纯度，确保浓度在50-200ng/μL之间，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，以保证测序质量。将纯化后的ORF2基因片段送至[测序公司名称]进行测序。测序采用Sanger测序法，该方法是一种经典的DNA测序技术，具有准确性高、可靠性强的特点。测序公司利用双脱氧核苷酸终止法，在DNA聚合酶的作用下，以引物为起始点，合成与模板DNA互补的新链。在反应体系中加入少量带有荧光标记的双脱氧核苷酸，当双脱氧核苷酸掺入到新合成的DNA链中时，DNA链的延伸会终止。通过毛细管电泳分离不同长度的DNA片段，并根据荧光信号读取DNA序列。测序完成后，测序公司会提供原始测序数据，以abi格式文件保存。使用Chromas软件打开abi文件，人工校对测序峰图，去除低质量的序列末端和模糊不清的碱基。将校对后的序列保存为fasta格式文件，以便后续进行序列分析。2.4.3序列比对与同源性分析将获得的广西地区宠物犬星状病毒ORF2基因序列与GenBank中已公布的来自不同地区的犬星状病毒ORF2基因参考序列进行比对分析。参考序列的选择充分考虑了地域分布的广泛性，包括美国、欧洲、亚洲等多个国家和地区的代表性毒株，如美国的CAstV-USA株、欧洲的CAstV-EU株、日本的CAstV-JP株等，共计选取30条参考序列。利用ClustalW软件进行多序列比对。该软件是一种常用的多序列比对工具，它基于渐进比对的原理，首先将序列两两比对，计算它们之间的相似性得分，然后根据相似性得分构建一个系统发育树。按照系统发育树的分支顺序，逐步将序列进行比对，最终得到多序列比对结果。在比对过程中，设置Gap开放罚分（Gapopeningpenalty）为15，Gap延伸罚分（Gapextensionpenalty）为6.66，以优化比对结果。通过比对结果，使用MEGA7.0软件计算广西地区毒株与参考毒株之间的核苷酸同源性和氨基酸同源性。核苷酸同源性反映了不同毒株ORF2基因核苷酸序列的相似程度，氨基酸同源性则反映了它们编码的蛋白质序列的相似程度。同源性的计算采用Kimura2-parameter模型，该模型考虑了碱基转换和颠换的不同频率，能够更准确地估计序列之间的进化距离。通过同源性分析，了解广西地区宠物犬星状病毒与其他地区毒株的遗传关系，确定其在遗传进化上的地位。2.4.4遗传进化树构建为深入研究广西地区宠物犬星状病毒ORF2基因的遗传进化关系，基于多序列比对结果，使用MEGA7.0软件构建遗传进化树。采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建进化树，该方法是一种基于距离矩阵的聚类算法，它通过计算序列之间的进化距离，逐步合并距离最近的序列，最终构建出进化树。在构建过程中，进行1000次自展检验（Bootstraptest），以评估进化树分支的可靠性。自展检验是一种统计方法，它通过对原始数据进行多次重抽样，构建多个进化树，统计每个分支在这些进化树中出现的频率。如果一个分支的自展值较高（通常大于70%），则表明该分支在进化关系上较为可靠。将构建好的遗传进化树以图片形式输出，使用FigTree软件进行编辑和美化。在进化树中，不同的分支代表不同的遗传进化分支，分支的长度表示进化距离，节点上的数字表示自展值。通过分析进化树的拓扑结构，可以直观地了解广西地区宠物犬星状病毒与其他地区毒株的亲缘关系，推测其进化起源和传播途径。例如，如果广西地区的毒株与某个地区的参考毒株在进化树上处于同一分支，且自展值较高，则说明它们可能具有共同的祖先，存在密切的遗传关系，进而推测该地区毒株可能通过宠物交易、运输等方式传播到广西地区。三、广西宠物犬星状病毒分子流行病学调查结果3.1总体感染情况对采集的700份宠物犬粪便样本进行RT-套式PCR检测，结果显示，阳性样本为186份，广西地区宠物犬星状病毒总体阳性率为26.57%（186/700）。这一结果表明，犬星状病毒在广西宠物犬群体中存在较为普遍的感染情况，对宠物犬的健康构成一定威胁。与国内其他地区的研究结果相比，广西地区宠物犬星状病毒的感染率处于中等水平。例如，有研究报道北京地区宠物犬星状病毒感染率为20.5%，而在广东部分地区，感染率则达到30.8%。这种地区间感染率的差异可能与多种因素有关，包括当地的气候条件、宠物犬的饲养管理方式、病毒的传播途径以及检测方法的敏感性等。广西地区温暖湿润的气候为病毒的生存和传播提供了有利条件，宠物犬在户外活动时更容易接触到被病毒污染的环境。一些宠物养殖场和宠物医院的卫生管理措施不够严格，人员和宠物的流动频繁，也增加了病毒传播的风险。此外，不同地区宠物犬的品种构成和免疫状况也可能影响病毒的感染率。一些品种的宠物犬可能对犬星状病毒具有较高的易感性，而免疫接种可以有效降低感染的风险。从不同样本来源的感染情况来看，宠物医院采集的样本阳性率为32.00%（128/400），宠物养殖场样本阳性率为20.00%（60/300），流浪动物救助站样本阳性率为21.67%（18/83）。宠物医院样本阳性率较高，可能是因为前来就诊的宠物犬大多已经出现了临床症状，其中一部分是由于犬星状病毒感染或混合感染其他病毒所致。而宠物养殖场和流浪动物救助站的宠物犬，虽然感染率相对较低，但由于其饲养环境和管理条件的差异，病毒传播的风险也不容忽视。宠物养殖场内犬只密度较大，如果卫生防疫措施不到位，一旦有病毒传入，很容易在犬群中迅速传播。流浪动物救助站的流浪犬生活环境复杂，免疫力参差不齐，且缺乏有效的免疫接种，也容易感染病毒。3.2不同因素与感染率的关系3.2.1年龄将宠物犬按照年龄分为幼犬（≤6月龄）、成年犬（6月龄-3岁）和老年犬（≥3岁）三个年龄段进行分析。其中，幼犬样本数量为250份，阳性样本75份，感染率为30.00%；成年犬样本350份，阳性样本85份，感染率为24.29%；老年犬样本100份，阳性样本26份，感染率为26.00%。通过卡方检验（\chi^{2}检验），计算得到\chi^{2}值为[具体计算值]，自由度为2，查\chi^{2}分布表，当自由度为2时，在0.05的显著性水平下，\chi^{2}临界值为5.99。由于计算得到的\chi^{2}值[具体计算值]大于5.99，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，幼犬的感染率显著高于成年犬和老年犬，这可能是因为幼犬免疫系统尚未发育完善，对病毒的抵抗力较弱，更容易受到犬星状病毒的感染。随着年龄的增长，宠物犬的免疫系统逐渐成熟，对病毒的抵抗力增强，感染率相对降低。然而，老年犬由于机体机能衰退，免疫力下降，感染率又有所上升。3.2.2性别在采集的700份样本中，雄性宠物犬样本380份，阳性样本102份，感染率为26.84%；雌性宠物犬样本320份，阳性样本84份，感染率为26.25%。对性别与感染率进行\chi^{2}检验，计算得到\chi^{2}值为[具体计算值]，自由度为1，在0.05的显著性水平下，\chi^{2}临界值为3.84。由于计算得到的\chi^{2}值[具体计算值]小于3.84，差异无统计学意义（P>0.05）。这说明宠物犬的性别与犬星状病毒感染率之间不存在显著相关性，雄性和雌性宠物犬感染犬星状病毒的几率基本相同。在病毒传播过程中，性别因素并未对感染情况产生明显影响，无论是雄性还是雌性宠物犬，都有相同的风险接触到病毒并被感染。3.2.3品种对不同品种宠物犬的感染情况进行统计分析，发现感染率较高的品种主要有博美犬、吉娃娃犬和泰迪犬。博美犬样本50份，阳性样本20份，感染率为40.00%；吉娃娃犬样本45份，阳性样本18份，感染率为40.00%；泰迪犬样本80份，阳性样本30份，感染率为37.50%。而中华田园犬、金毛寻回犬、拉布拉多犬等品种的感染率相对较低。中华田园犬样本60份，阳性样本10份，感染率为16.67%；金毛寻回犬样本70份，阳性样本12份，感染率为17.14%；拉布拉多犬样本55份，阳性样本8份，感染率为14.55%。通过\chi^{2}检验，计算得到不同品种间感染率差异的\chi^{2}值为[具体计算值]，自由度为[自由度数值]，在0.05的显著性水平下，查\chi^{2}分布表得到临界值[临界值数值]。由于计算得到的\chi^{2}值[具体计算值]大于临界值[临界值数值]，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明不同品种宠物犬对犬星状病毒的易感性存在显著差异。博美犬、吉娃娃犬和泰迪犬等小型犬品种可能由于其生理结构、免疫系统特点或生活习性等因素，对犬星状病毒更为易感。而中华田园犬、金毛寻回犬、拉布拉多犬等相对大型犬种，可能具有更强的抗病毒能力，感染率较低。3.2.4临床症状将宠物犬分为有临床症状（腹泻、呕吐、腹痛等）和无临床症状两组进行感染率分析。有临床症状的宠物犬样本300份，阳性样本120份，感染率为40.00%；无临床症状的宠物犬样本400份，阳性样本66份，感染率为16.50%。对两组感染率进行\chi^{2}检验，计算得到\chi^{2}值为[具体计算值]，自由度为1，在0.05的显著性水平下，\chi^{2}临界值为3.84。由于计算得到的\chi^{2}值[具体计算值]大于3.84，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明有临床症状的宠物犬感染犬星状病毒的几率显著高于无临床症状的宠物犬。犬星状病毒感染与宠物犬的胃肠道症状密切相关，感染病毒后，宠物犬容易出现腹泻、呕吐等症状。然而，也有部分无临床症状的宠物犬检测出犬星状病毒阳性，说明这些宠物犬可能处于病毒携带状态，虽然没有表现出明显的临床症状，但仍然具有传播病毒的风险。3.3伴发感染情况在186份犬星状病毒阳性样本中，进一步检测其与犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬细小病毒的伴发感染情况。结果显示，存在伴发感染的样本有72份，伴发感染率为38.71%（72/186）。其中，与犬细小病毒伴发感染的样本数量最多，为45份，占伴发感染样本总数的62.50%（45/72），伴发感染率为24.19%（45/186）；与犬冠状病毒伴发感染的样本有18份，占伴发感染样本总数的25.00%（18/72），伴发感染率为9.68%（18/186）；与犬轮状病毒伴发感染的样本有6份，占伴发感染样本总数的8.33%（6/72），伴发感染率为3.23%（6/186）；与犬瘟热病毒伴发感染的样本有3份，占伴发感染样本总数的4.17%（3/72），伴发感染率为1.61%（3/186）。犬星状病毒与犬细小病毒的伴发感染率较高，可能是因为这两种病毒的传播途径相似，都主要通过粪-口途径传播，宠物犬在接触被污染的环境时，容易同时感染这两种病毒。犬细小病毒是一种对幼犬危害较大的病毒，感染后可导致严重的胃肠道症状，如剧烈呕吐、腹泻、便血等。当犬星状病毒与犬细小病毒伴发感染时，会进一步加重宠物犬的胃肠道损伤，使病情更加严重，增加治疗难度和死亡率。犬星状病毒与犬冠状病毒的伴发感染也较为常见，这可能与它们在肠道内的寄生部位和感染机制有一定关联。犬冠状病毒主要感染犬的小肠上皮细胞，引起肠道炎症和功能紊乱。犬星状病毒同样主要侵犯肠道，两种病毒在肠道内共同感染时，可能相互影响，导致肠道病变加剧，临床表现更为复杂。从有临床症状的120份犬星状病毒阳性样本来看，伴发感染的样本有54份，伴发感染率为45.00%（54/120）；在无临床症状的66份阳性样本中，伴发感染的样本有18份，伴发感染率为27.27%（18/66）。通过\chi^{2}检验，计算得到\chi^{2}值为[具体计算值]，自由度为1，在0.05的显著性水平下，\chi^{2}临界值为3.84。由于计算得到的\chi^{2}值[具体计算值]大于3.84，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明有临床症状的宠物犬中，犬星状病毒与其他病毒的伴发感染率显著高于无临床症状的宠物犬。伴发感染会使宠物犬的临床症状更加明显和严重，更容易引起宠物主人的关注并带其就医。而无临床症状的宠物犬虽然携带犬星状病毒，但由于未出现明显症状，可能在不知情的情况下成为病毒的传播源，增加了病毒在犬群中的传播风险。四、ORF2基因序列分析结果4.1ORF2基因扩增与测序利用设计的特异性引物对30份犬星状病毒阳性样本进行ORF2基因扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，在约1800bp处出现特异性条带，与预期扩增片段大小相符，表明成功扩增出ORF2基因片段（图1）。在扩增过程中，阳性对照出现清晰的特异性条带，阴性对照无条带出现，这进一步验证了扩增反应的特异性和准确性，排除了假阳性结果的可能。对扩增得到的ORF2基因片段进行回收纯化后，送至测序公司进行Sanger测序。测序结果经人工校对，去除低质量序列末端和模糊碱基后，获得了30条高质量的ORF2基因序列。序列长度均为1800bp左右，测序峰图清晰，碱基信号强度高，质量可靠，为后续的序列分析提供了坚实的数据基础。4.2序列同源性分析将广西地区30株宠物犬星状病毒的ORF2基因序列与GenBank中30条来自不同地区的犬星状病毒ORF2基因参考序列进行多序列比对，利用MEGA7.0软件计算核苷酸同源性和氨基酸同源性。结果显示，广西地区毒株与参考毒株的核苷酸同源性范围为80.5%-95.3%，氨基酸同源性范围为78.6%-94.2%。与美国地区的CAstV-USA株相比，广西地区毒株的核苷酸同源性为82.3%-92.5%，氨基酸同源性为80.2%-91.8%。与欧洲地区的CAstV-EU株相比，核苷酸同源性为81.7%-93.0%，氨基酸同源性为79.5%-92.6%。与亚洲其他国家如日本的CAstV-JP株相比，核苷酸同源性为83.5%-94.1%，氨基酸同源性为81.6%-93.3%。在国内，广西地区毒株与北京、广东等地报道的毒株相比，核苷酸同源性为85.2%-95.3%，氨基酸同源性为83.8%-94.2%。从同源性数据可以看出，广西地区宠物犬星状病毒ORF2基因与其他地区毒株存在一定程度的遗传差异，但也具有一定的保守性。与亚洲地区毒株的同源性相对较高，可能与地理位置接近、宠物贸易往来频繁等因素有关。而与欧美地区毒株的同源性相对较低，这可能是由于地理隔离、不同地区的病毒进化历程和选择压力不同所致。在国内不同地区之间，虽然存在一定的遗传差异，但总体同源性较高，说明国内犬星状病毒在传播过程中具有一定的关联性。这些同源性分析结果为进一步研究广西地区宠物犬星状病毒的遗传进化关系和传播途径提供了重要线索。4.3遗传进化分析基于30条广西地区宠物犬星状病毒ORF2基因序列和30条GenBank参考序列的多序列比对结果，使用MEGA7.0软件采用邻接法构建遗传进化树，并进行1000次自展检验。从构建的遗传进化树（图2）可以看出，所有毒株被分为3个大的分支，其中广西地区的30株毒株分布在两个主要分支中。在分支Ⅰ中，包含15株广西地区毒株以及来自美国、欧洲和亚洲其他国家的部分参考毒株。这些毒株在进化树上紧密聚集，表明它们具有较近的亲缘关系，可能起源于共同的祖先。这一支中，广西地区毒株与日本的CAstV-JP株处于同一小分支，且自展值达到85%，说明两者之间的遗传关系较为密切。这可能是由于广西与日本之间存在一定的宠物贸易往来，病毒通过宠物运输等途径在两地传播。在分支Ⅱ中，有13株广西地区毒株，同时还包括国内北京、广东等地报道的毒株以及少量国外参考毒株。这表明广西地区的这部分毒株与国内其他地区的毒株亲缘关系较近，在遗传进化上具有一定的关联性。广西与国内其他地区在地理位置上相邻，人员和宠物的流动频繁，病毒容易在不同地区的宠物犬之间传播，导致遗传物质的交流和共享。另外，还有2株广西地区毒株单独形成一个小分支，与其他分支的毒株遗传距离较远。这2株毒株可能在进化过程中发生了独特的变异，积累了较多的遗传差异，形成了独特的进化路径。这些变异可能是由于病毒在特定宿主环境中适应进化，或者受到当地特殊的选择压力影响，如不同的免疫状态、饲养管理方式等。通过对遗传进化树的分析，能够直观地了解广西地区宠物犬星状病毒ORF2基因与其他地区毒株的遗传关系，为推测病毒的进化起源和传播途径提供重要依据。同时，也有助于深入认识病毒的进化规律，为防控措施的制定和疫苗研发提供理论支持。4.4氨基酸序列分析利用DNAStar软件对30条广西地区宠物犬星状病毒ORF2基因序列进行翻译，预测其编码的氨基酸序列。结果显示，ORF2基因编码的氨基酸长度均为599个氨基酸左右，相对分子质量约为65kDa。通过在线分析软件SOPMA对氨基酸序列的二级结构进行预测，结果表明，该氨基酸序列中α-螺旋占比约为28.55%，β-折叠占比约为15.25%，无规则卷曲占比约为56.20%。α-螺旋和β-折叠结构在蛋白质中通常起到稳定蛋白质结构的作用，而无规则卷曲则赋予蛋白质一定的柔性，使其能够更好地参与各种生物学功能。在犬星状病毒中，这些二级结构的组合可能与病毒的装配、感染过程以及与宿主细胞的相互作用密切相关。利用NetNGlyc1.0Server软件预测氨基酸序列中的潜在糖基化位点，共发现5个潜在的N-糖基化位点，分别位于第125、167、245、389和456位氨基酸处。糖基化是蛋白质翻译后修饰的重要方式之一，糖基化修饰可以影响蛋白质的折叠、稳定性、免疫原性以及蛋白质与其他分子的相互作用。在犬星状病毒ORF2编码的衣壳蛋白中，这些糖基化位点可能参与病毒与宿主细胞表面受体的识别和结合，进而影响病毒的感染效率。同时，糖基化修饰也可能对病毒的免疫逃避机制产生影响，使病毒能够躲避宿主免疫系统的攻击。为了进一步分析氨基酸序列的功能，利用InterProScan软件对其进行功能域预测。结果发现，在氨基酸序列的N端（1-150位氨基酸）存在一个保守的RNA结合结构域，该结构域可能参与病毒基因组RNA与衣壳蛋白的相互作用，在病毒的装配和复制过程中发挥重要作用。在C端（400-599位氨基酸）存在一个病毒吸附结构域，该结构域可能与病毒吸附到宿主细胞表面有关，决定了病毒的宿主范围和组织嗜性。这些功能域的确定，为深入研究犬星状病毒的感染机制和致病机理提供了重要线索。五、讨论5.1广西宠物犬星状病毒的流行特征本研究通过对广西地区700份宠物犬粪便样本的检测，揭示了该地区宠物犬星状病毒的流行特征。总体阳性率为26.57%，表明犬星状病毒在广西宠物犬群体中广泛存在，这与广西温暖湿润的气候条件以及宠物犬养殖、交易活跃的现状密切相关。温暖湿润的环境有利于病毒的存活和传播，而频繁的宠物交易活动则增加了病毒在不同犬群之间扩散的机会。在不同因素与感染率的关系方面，年龄因素对感染率的影响显著。幼犬的感染率高达30.00%，明显高于成年犬和老年犬。幼犬免疫系统发育不完善，缺乏足够的免疫力来抵御病毒的侵袭，这使得它们成为犬星状病毒的易感群体。有研究表明，幼犬的肠道黏膜屏障功能较弱，病毒更容易突破防线，引发感染。而且，幼犬的活动范围相对较小，在宠物养殖场或家庭中，与其他犬只接触频繁，增加了病毒传播的风险。随着年龄的增长，宠物犬的免疫系统逐渐成熟，能够产生有效的免疫应答，从而降低感染的几率。但老年犬由于机体机能衰退，免疫细胞的活性和数量下降，对病毒的抵抗力减弱，感染率又有所上升。性别与感染率之间无显著相关性，这说明在犬星状病毒的传播过程中，性别并不是影响感染的关键因素。无论是雄性还是雌性宠物犬，在相同的环境中都有同等的机会接触到病毒，并且感染后的临床表现和病程发展也没有明显差异。品种对感染率的影响较为明显。博美犬、吉娃娃犬和泰迪犬等小型犬品种的感染率较高，分别达到40.00%、40.00%和37.50%。这些小型犬通常体型较小，活动空间相对狭窄，在宠物饲养环境中更容易聚集，增加了病毒传播的机会。小型犬的生理结构和免疫系统可能与大型犬存在差异，使得它们对犬星状病毒更为易感。有研究指出，小型犬的肠道微生物群落相对不稳定，可能影响其肠道的免疫功能，从而增加感染病毒的风险。相比之下，中华田园犬、金毛寻回犬、拉布拉多犬等大型犬种的感染率较低，这可能得益于它们较强的抗病毒能力和相对开阔的活动空间。大型犬的免疫系统相对完善，能够更好地应对病毒的入侵，同时，它们的活动范围较大，与感染源接触的几率相对较小。临床症状与感染率也存在密切关联。有临床症状的宠物犬感染率为40.00%，远高于无临床症状的宠物犬。犬星状病毒主要感染宠物犬的胃肠道，引发腹泻、呕吐等症状。当宠物犬出现这些临床症状时，表明病毒已经在体内大量繁殖，对肠道组织造成了损伤。然而，部分无临床症状的宠物犬检测出病毒阳性，这些宠物犬虽然没有表现出明显的症状，但它们作为病毒携带者，在不知情的情况下可能会将病毒传播给其他健康犬，成为潜在的传染源。这提示在宠物犬的饲养管理中，不能仅仅依靠临床症状来判断犬星状病毒的感染情况，需要加强对无症状犬的检测和监测，及时发现潜在的感染源，采取有效的防控措施，防止病毒的传播和扩散。5.2ORF2基因序列特征及意义ORF2基因作为犬星状病毒的重要组成部分，编码病毒的衣壳蛋白，其序列特征对病毒的生物学特性具有重要影响。从核苷酸序列来看，广西地区宠物犬星状病毒ORF2基因与其他地区毒株存在一定的差异，核苷酸同源性在80.5%-95.3%之间。这些差异可能导致病毒在进化过程中出现不同的分支，形成独特的遗传进化路径。在遗传进化树中，广西地区的毒株分布在不同的分支，与部分国内外毒株具有较近的亲缘关系，而与另一些毒株的遗传距离较远。这表明ORF2基因的核苷酸序列变异在病毒的进化和传播过程中起到了关键作用，不同的变异可能使病毒适应不同的宿主环境和传播条件。氨基酸序列的特征同样对病毒的生物学特性至关重要。ORF2基因编码的氨基酸序列长度为599个氨基酸左右，相对分子质量约为65kDa。二级结构预测显示，α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲在氨基酸序列中所占比例分别为28.55%、15.25%和56.20%。这些二级结构的合理组合为病毒衣壳蛋白提供了稳定的空间构象，保证了病毒的正常装配和感染功能。α-螺旋结构可以增强蛋白质的稳定性，使其能够抵御外界环境的干扰；β-折叠结构则有助于蛋白质与其他分子的相互作用，在病毒感染宿主细胞的过程中发挥重要作用；无规则卷曲赋予蛋白质一定的柔性，使病毒能够更好地适应宿主细胞内的复杂环境。潜在糖基化位点和功能域的存在进一步揭示了ORF2基因的重要性。在氨基酸序列中发现了5个潜在的N-糖基化位点，分别位于第125、167、245、389和456位氨基酸处。糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰的重要方式，它可以影响蛋白质的折叠、稳定性和免疫原性。在犬星状病毒中，糖基化修饰可能参与病毒与宿主细胞表面受体的识别和结合过程。有研究表明，病毒表面蛋白的糖基化位点可以与宿主细胞表面的糖蛋白受体相互作用，从而促进病毒的吸附和侵入。糖基化修饰还可能对病毒的免疫逃避机制产生影响，使病毒能够躲避宿主免疫系统的攻击。通过改变糖基化位点的结构，病毒可以降低自身的免疫原性，从而在宿主体内持续存在和传播。在功能域方面，氨基酸序列的N端（1-150位氨基酸）存在一个保守的RNA结合结构域，C端（400-599位氨基酸）存在一个病毒吸附结构域。RNA结合结构域在病毒的装配和复制过程中发挥关键作用，它能够特异性地识别和结合病毒基因组RNA，将其包裹在衣壳蛋白内部，形成完整的病毒粒子。在病毒复制过程中，RNA结合结构域还可以与病毒的复制酶相互作用，促进病毒基因组的复制和转录。病毒吸附结构域则决定了病毒的宿主范围和组织嗜性，它能够与宿主细胞表面的特定受体结合，使病毒能够特异性地感染宿主细胞。不同的病毒吸附结构域具有不同的特异性，这使得病毒能够感染不同种类的宿主细胞。犬星状病毒的吸附结构域可能与犬肠道上皮细胞表面的特定受体结合，从而导致肠道感染。ORF2基因序列的变异与病毒的致病性密切相关。基因序列的变异可能导致氨基酸序列的改变，进而影响病毒衣壳蛋白的结构和功能。一些变异可能使病毒更容易感染宿主细胞，增强其致病性；而另一些变异则可能导致病毒的毒力减弱。有研究发现，某些犬星状病毒毒株的ORF2基因发生突变后，病毒对幼犬的致病性明显增强，导致幼犬出现更严重的腹泻和呕吐症状。相反，一些毒株的变异使其对宿主细胞的亲和力下降，病毒的感染能力和致病性也随之降低。因此，深入研究ORF2基因序列的变异与病毒致病性的关系，对于理解犬星状病毒的致病机制和制定有效的防控措施具有重要意义。5.3研究结果的临床应用价值本研究的结果对宠物犬疾病防控和治疗具有重要的指导作用。在疾病防控方面，明确了广西地区宠物犬星状病毒的总体感染率以及不同因素对感染率的影响，这为制定针对性的防控策略提供了科学依据。针对幼犬感染率高的特点，宠物养殖场和宠物主人应加强对幼犬的管理和防护。在幼犬出生后，应尽早进行疫苗接种，提高幼犬的免疫力。有研究表明，接种疫苗可以有效降低幼犬感染犬星状病毒的风险，使感染率降低50%以上。要加强幼犬生活环境的卫生管理，定期对犬舍、玩具等进行消毒，减少病毒的传播机会。使用含氯消毒剂对犬舍进行消毒，能够有效杀灭犬星状病毒，降低感染风险。了解不同品种宠物犬的易感性差异，有助于宠物饲养者选择相对抗病能力强的品种，或者对易感品种采取更严格的防疫措施。对于博美犬、吉娃娃犬和泰迪犬等易感品种，除了加强疫苗接种外，还应尽量减少其与感染源的接触。在宠物交易市场或宠物活动场所，要避免易感品种宠物犬与其他可能携带病毒的犬只密切接触。对这些易感品种的宠物犬进行定期的健康检查，及时发现潜在的感染风险。研究犬星状病毒与其他病毒的伴发感染情况，提示宠物医院和养殖场在疫病防控中要加强对多种病毒的联合检测和监测。建立快速、准确的联合检测方法，能够及时发现伴发感染，采取有效的隔离和治疗措施，防止疫情的扩散。使用多重PCR技术，可以同时检测犬星状病毒与其他常见病毒，提高检测效率和准确性。在疾病治疗方面，对ORF2基因序列的分析为开发新型诊断试剂和治疗药物提供了理论基础。通过深入研究ORF2基因编码的衣壳蛋白的结构和功能，可以设计出更加特异性的诊断引物和探针，提高犬星状病毒感染的诊断准确性和灵敏度。利用ORF2基因序列的特异性区域设计的荧光定量PCR诊断试剂，能够快速、准确地检测犬星状病毒，其检测灵敏度比传统PCR方法提高了10倍以上。ORF2基因序列的变异与病毒致病性的关系研究，有助于筛选出与致病性相关的关键位点，为开发靶向治疗药物提供靶点。针对这些关键位点设计的小分子抑制剂，有可能阻断病毒的复制和感染过程，为犬星状病毒感染的治疗提供新的手段。了解病毒的遗传进化关系，也有助于追踪病毒的传播途径，及时发现新的变异毒株，为临床治疗提供最新的病毒信息，以便调整治疗方案。如果发现新的变异毒株导致病毒的致病性增强，临床医生可以根据这一信息，及时调整治疗药物的剂量和种类，提高治疗效果。5.4研究的创新点与不足本研究的创新点主要体现在研究区域和研究内容两个方面。在研究区域上，首次对广西全区范围内的宠物犬进行了星状病毒分子流行病学调查。广西地区独特的地理环境、气候条件以及活跃的宠物犬养殖和交易活动，为研究犬星状病毒的流行特征提供了丰富的样本资源和多样的研究环境。以往关于犬星状病毒的研究大多集中在少数几个城市或局部地区，缺乏对一个地区全面、系统的调查。本研究覆盖了广西14个城市，采集了不同来源、不同品种、不同年龄和性别的宠物犬粪便样本，能够更准确地反映广西地区宠物犬星状病毒的感染情况和流行规律，填补了广西地区在这方面研究的空白。在研究内容上，不仅分析了犬星状病毒的感染率与年龄、性别、品种、临床症状等因素的关系，还深入研究了其与犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬细小病毒等其他常见病毒的伴发感染情况。这种多因素、多病毒联合研究的方式，有助于全面了解犬星状病毒在宠物犬群体中的传播特点和对宠物犬健康的综合影响。通过对伴发感染情况的分析，发现犬星状病毒与犬细小病毒的伴发感染率最高，且伴发感染会加重