微生物学基本实验方法和诊断

一、细菌形态学检查·

(一)显微镜：临床微生物学检查常用普通光学

显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜。(二)细菌染色标本检查1.常用染料用于细菌染色的染料多为人工合成

的含苯环的化合物。染料分子带有染色基团和助色基团。染色基团使

染料呈现一定的颜色，使细菌着色；助色基团使

染料分子与细菌结合，这样细菌才能着色。助色

基团所含的化学结构决定了染料的酸碱性。常用染料●(1)碱性染料：碱性染料电离后，染料的助色基团带正电荷，可使带负电荷的细菌染上颜色。碱

性染料常为氯化物、硫酸盐、醋酸盐或草酸盐。染色基团一助色基团一酸根——→染色基团一

助色基团++酸根一由于细菌常处于中性或弱碱性环境，细菌等电点

为pH2-5,因此细菌带负电荷，细菌染色常用的

染料是碱性染料。常用的碱性染料是碱性苯胺染

料，如美兰、碱性复红和结晶紫。常用染料·

(2)酸性染料：酸性染料电离后，助色基团带

负电荷，因此不能使带负电荷的细菌染上颜色，

不常用于细菌染色。如果使细菌悬液的pH降至等电

点

(pH2-5)以下，细菌带正电荷，则可使细

菌染上颜色。酸性染料常为与Na+、K+、Ca²+、NH₄+结合的盐类。染色基团一助色基团一

染色基团一助

色基团

-

+Na+常用的酸性染料如伊红、酸性复红、刚果红等。常用染料●(3)中性染料：又称复合染料，是碱性染料与酸性染料结合形成的复合物

,如姬姆萨染料(伊红天青)、瑞氏染料(伊红美兰)。细菌染色不用此

种染料，衣原体染色可用此种染料。2.常用染色方法(1)单染色法：单用一种碱性染料使细菌着色，常用美

兰染色。用于观察细菌的形态、大小及排列。(2)复合染色法(鉴别染色法):用两种碱性染

料使细菌先后染色，即一种染料作为复染剂，并在初染

后用脱色剂脱色，然后再复染，以区别细菌的着色性(

细菌着上哪种颜色),从而鉴别细菌。复合染色法常用

来观察细菌的形态、大小、排列和着色性。临床常用的复合染色法有革兰染色法和抗酸染色法。革兰染色法

紫色一革兰阳性菌红色一革兰阴性菌抗酸染色法

红色一抗酸性细菌兰色一非抗酸性细菌(三)不染色标本检查·1.悬滴法用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜观察细菌的形

态和运动方式·2.压滴法用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜观察细菌的形

态和运动方式二

、细菌的人工培养及生化试验●(一)培养基1.培养基的概念：人工配制的适合细菌生长繁殖需要的营养基质。培养基

必须具备细菌生长繁殖所需要的营养物质和适宜的pH(一般pH7.2—7.4)0培养基的种类一按用途分类●(1)基础培养基：含有细菌生长繁殖所需要的基本营养

成分，主要用于营养要求不高的细菌的生长。临床常用

牛肉浸汤、普通琼脂平板、普通琼脂斜面和普通琼脂半

固

体

。(2)普通培养基：在基础培养基中加入葡萄糖、血液(

兔脱纤维蛋白血、羊脱纤维蛋白血)、血清(兔血清、牛血清、马血清等)、生长因子(维生素B族一酵母浸膏

,X

因子一氯化高铁血红素、V

因子一辅酶I和辅助IⅡ等)

等特殊营养物质，即为营养培养基。主要用于营养要求

较高的细菌的生长。临床常用葡萄糖肉汤、血清肉汤、

血琼脂平板、巧克力琼脂平板。临床最常用的是血琼脂

平

板

。培养基的种类一按用途分类·

(3)鉴别培养基：在培养基中加入特定的底物

和指示剂，即为鉴别培养基。鉴别培养基用来作

细菌的生化试验，以便鉴定细菌，因此这类培养

基是临床细菌检验常的培养基。如糖发酵培养基

、克氏双糖铁培养基

(KIA)

、动力一吲哚一尿素(MIU)

培养基等。培养基的种类一按用途分类●(4)选择培养基：在培养基中加入某种化学物质或

抗生素，以抑制某些细菌种类生长，有助于需要的

细菌种类生长。此类培养基主要用于从含菌种类(

主要是正常菌群)较多的标本(如粪便)中分离培

养专性病原菌。如胆盐培养基、SS琼脂、麦康凯琼

脂、中国兰琼脂、伊红一美兰琼脂用于从粪便中分

离培养志贺菌和沙门菌；庆大霉素琼脂、碱性琼脂

用于从粪便中分离培养霍乱弧菌。(5)特殊培养基：包括培养细菌L型的培养基，培

养厌氧菌的厌氧培养基。这类培养基用于培养营养

要求和生长条件较特殊的细菌。培养基的种类一按物理性状分类●

(1)液体培养基：常用于增菌培养和做生化试验。(2)固体培养基：在液体培养基中加入1.5-2.0%琼

脂，高压热溶后冷凝即为固体培养基。琼脂平板：常用于细菌的分离培养、鉴定、纯

化和药敏试验。琼脂斜面：常用于菌种短期保存(3)半固体培养基：在液体培养基中加入0.2-0.5%

琼脂，高压热溶后冷凝即为半固体培养基。主要用

于细菌的动力试验和菌种保存。(二)标本(或细菌)接种方法●

P106.

根据标本的性质、培养目的和所使用培养基的种类(物理性状)选

用适宜的接种方法。具体的方法在实验室中讲授和操作。细菌培养方法(一)·1、普通培养法：利用细菌培养箱，箱内温度调到37℃,箱内

为大气，含氧量在22%左右，将已接种的培养基置于箱内培养

18-24h

或数天，观察有无细菌生长现象。2

、二氧化碳培养法培养的环境中CO₂含量5-10%,温度35-37℃

。常用的方法有以下三种：(1)二氧化碳孵育箱法(2)烛缸法：用磨口标本缸或玻璃干燥器，缸盖缘或缸口涂

以凡士林，将已接种的培养皿放入缸内，并在缸内点燃蜡烛，

盖严缸盖，待蜡烛火焰熄灭后，缸内CO₂含量约为5-10%,将烛

缸放入37°₃

与3.5mlHCL的比例并在密闭容器后进行化学反应，

使容器内CO₂含量约为5-10%,将烛缸放入37℃细菌培养箱内进

行培养。细菌L型检查--培养及鉴定·1.标本采集、保存和接种、培养(1)组织、体液、渗出液：无菌技术采集后，

一部份标本放入无菌20%蔗糖溶液以保持高渗透压环境，

一部份标本放入无菌生理盐水中作为对照标本。用常规方法接

种培养基，高渗保存的标本接种细菌L型固体培养基，对

照标本接种常用的非高渗培养基(血平板)。37℃培养

1-4天，逐日低倍镜观察有无L型菌落。(2)血液、骨髓：无菌技术采集后，一部份标本放入高

渗增菌液中，一部份标本放入等渗增菌液中，37℃培养

1-7天，此后，分别划线接种于细菌L型平板和血平板，37℃培养1-4天，逐日低倍镜观察有无L型菌落。L型菌落有三种类型：①油煎蛋样菌落；②颗粒型菌落；③丝状菌落。鲎试验·鲎试验的方法比较多，目前比较常用是凝胶法(经

典方法)、比浊法或动力学比浊法、显色基质法(

用合成的显色底物代替天然底物凝固蛋白原