异种抗原介导的局部微环境重塑：小鼠S180肉瘤治疗新策略

异种抗原介导的局部微环境重塑：小鼠S180肉瘤治疗新策略一、引言1.1研究背景癌症，作为一种全身性慢性疾病，严重威胁着人类的健康。随着人口老龄化的加剧，其发病率和死亡率逐年上升。据国家癌症中心发布的数据显示，2022年我国癌症新发病例高达482.47万，世标发病率为201.61/10万；死亡病例也不容小觑，世标死亡率达96.47/10万。在全球范围内，2019年新发癌症患者估计2360万，癌症死亡病例数估计1000万，癌症死亡占全部死亡数的比例从2010年的15.7%上升到2019年的17.7%。肺癌、结直肠癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌等成为我国常见的恶性肿瘤，给患者家庭和社会带来了沉重的负担。目前，肿瘤的治疗手段多种多样，包括手术、化疗、放疗、生物治疗等。近年来，靶向治疗因其选择性好、对正常组织损伤少等优点备受关注。然而，肿瘤的发生是一个极为复杂的过程，涉及多基因突变，细胞信号传导更是形成了一个交错纵横的网络。仅针对一个信号通路的抑制或者针对一个基因的修复，往往难以达到有效控制肿瘤的目的。近年来的研究发现，肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着关键作用。肿瘤微环境是指肿瘤周围包括肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞（如树突状细胞、巨噬细胞等）共同构成的局部环境。作为肿瘤细胞的“避难所”，肿瘤微环境能够保护肿瘤细胞免受免疫细胞的识别和攻击，诱导免疫耐受。在肿瘤微环境中，存在着多种阻碍效应细胞活化的因素，如调节性T细胞数量增加，其可以与效应细胞竞争性结合白细胞介素2（IL-2），并能抑制CD4+T和CD8+T细胞对IL-2的转录与表达，干扰其活化与增殖；肿瘤相关巨噬细胞也会分泌免疫抑制因子，抑制T细胞的功能等。肿瘤微环境免疫抑制状态的解除成为了肿瘤免疫治疗成败的关键，也为肿瘤治疗提供了新的靶点。早在300多年前，临床报道就发现肿瘤患者局部遭受细菌或病毒感染时，肿瘤会明显消退。其原因可能是局部细菌感染引发的炎症反应在一定程度上解除了肿瘤微环境的免疫抑制状态，暴露了肿瘤抗原，促进效应细胞的活化，从而达到杀灭肿瘤的目的。受此启发，本研究提出一种新的肿瘤治疗模式，即利用异种抗原免疫序贯瘤内注射的方法治疗肿瘤。通过异种抗原免疫，可增强机体的非特异性免疫力，产生记忆性T细胞及抗体。随后进行异种抗原瘤内注射，在肿瘤局部引发免疫清除反应。一方面，局部注射的异种抗原成为一个人工靶点，吸引抗体及招募免疫细胞在肿瘤局部大量聚集；另一方面，肿瘤局部的免疫反应会产生大量的细胞因子及趋化因子，在肿瘤局部制造出一种炎症环境，打破免疫抑制状态，促进免疫效应细胞的成熟及活化，最终实现将机体针对异种抗原的排斥反应转化为对肿瘤的免疫应答。1.2研究目的与意义本研究旨在验证异种抗原免疫序贯瘤内注射治疗肿瘤的可行性，深入探讨其对肿瘤微环境的改善作用，为肿瘤治疗开辟新的路径。具体而言，通过严格的实验设计和多维度的数据分析，检验该治疗方法是否能有效抑制肿瘤生长，观察其对肿瘤浸润淋巴细胞各细胞亚群比例的影响，以及评估其对肿瘤微环境中细胞因子浓度的调节作用。肿瘤治疗一直是医学领域的重点和难点，传统治疗手段存在诸多局限性，新的治疗策略和方法亟待开发。本研究提出的异种抗原免疫序贯瘤内注射治疗模式，具有创新性和潜在的应用价值。从理论层面来看，该研究有助于深化对肿瘤免疫治疗机制的理解，进一步明确肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的关键作用，以及异种抗原如何通过调节肿瘤微环境来激活机体的抗肿瘤免疫应答，丰富和拓展肿瘤免疫学的理论体系。从实践意义出发，若该治疗方法被证实有效，将为临床肿瘤治疗提供一种全新的、安全有效的治疗手段。它有可能克服现有治疗方法的不足，提高肿瘤治疗的效果，延长患者的生存期，改善患者的生活质量。同时，这种基于免疫调节的治疗方法，相较于传统的化疗和放疗，可能具有更低的毒副作用，减少患者在治疗过程中的痛苦，为肿瘤患者带来新的希望。1.3研究创新点本研究在肿瘤治疗方法及微环境分析维度上具有显著创新。在治疗方法上，采用异种抗原免疫序贯瘤内注射的方式，与传统肿瘤治疗手段不同，该方法利用异种抗原激发机体非特异性免疫，产生记忆性T细胞及抗体，再通过瘤内注射在肿瘤局部引发免疫清除反应。局部注射的异种抗原成为人工靶点，吸引抗体及免疫细胞聚集，同时免疫反应产生的细胞因子及趋化因子在肿瘤局部制造炎症环境，打破免疫抑制状态，将机体针对异种抗原的排斥反应转化为对肿瘤的免疫应答，为肿瘤治疗提供了全新的思路和方法。在研究内容方面，本研究突破以往单一维度研究肿瘤微环境的局限，从多维度对肿瘤微环境进行分析。既关注肿瘤浸润淋巴细胞各细胞亚群比例的变化，又分析肿瘤微环境中细胞因子浓度的改变。通过全面分析肿瘤微环境的变化，能够更深入、系统地揭示异种抗原免疫序贯瘤内注射治疗肿瘤的作用机制，为后续研究和临床应用提供更丰富、准确的理论依据。二、小鼠S180肉瘤及肿瘤微环境概述2.1S180肉瘤特征S180肉瘤细胞最初源于小鼠腹水瘤，1959年被成功建系。其细胞形态呈现淋巴母细胞样，具有独特的半贴半悬生长特性。该细胞系保持了肉瘤的肿瘤原性，是肿瘤研究领域中极为重要的工具细胞，广泛应用于肿瘤发生机理的体内外研究。在体外，它常被用于肿瘤化疗药物的筛选试验，帮助科研人员评估各种药物对肿瘤细胞的抑制效果，为临床肿瘤治疗药物的开发提供重要的实验依据。在培养传代方面，S180细胞通常由昆明小鼠腹水传代。具体操作是在小鼠腹腔接种1.0x10^6个S-180细胞后第10天，在无菌条件下抽取腹水，用PBS稀释后计数，再进行腹腔接种传代。若进行体外培养，一般4-5代左右，细胞活力会逐渐降低，状态变差，此时可通过腹水培养的方式恢复细胞活力。在细胞培养过程中，大部分S180细胞呈悬浮状态，因此基本按照悬浮细胞的培养方法进行操作，对于少量贴壁细胞，可以通过轻柔吹打使其脱离瓶壁并收集。其培养体系一般为RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清，培养条件为气相含95%空气和5%CO2，温度控制在37℃。当细胞需要冻存时，冻存条件为基础培养基添加10%DMSO和20%FBS，放置于液氮中保存。传代时，若细胞处于悬浮状态，一般通过向培养瓶中添加完全培养基来维持细胞的生长状态，通常细胞密度维持在1×10^5-1×10^6个/mL可保证细胞的正常生长；如需分瓶，可将细胞悬液收集到无菌离心管中，以1000rpm离心10min，弃去上清，加入6-8ml新鲜培养基，重悬细胞并温柔吹打，然后将细胞悬液转移到新T25瓶中，后续传代可根据实际情况按1:2-1:5的比例进行。由于S180肉瘤细胞具有稳定的肿瘤原性和易于培养传代等特点，在肿瘤研究中发挥着不可替代的作用。许多关于肿瘤治疗的研究，如新型药物的研发、治疗方法的探索等，都会以S180肉瘤细胞构建的荷瘤小鼠模型为基础展开实验。在研究桑黄多糖对肉瘤S180细胞体内外的抑瘤作用时，科研人员构建S180细胞荷瘤小鼠模型，通过给予不同剂量的桑黄多糖溶液，观察小鼠瘤体质量变化以计算抑瘤率，并运用免疫组化法检测肿瘤组织中相关基因的蛋白表达，从而深入探究桑黄多糖的抗肿瘤机制。在探讨骨髓间充质干细胞对小鼠肉瘤细胞S180生长的影响时，以S180细胞为研究对象，观察骨髓间充质干细胞上清液对其生长抑制效应、细胞凋亡率以及相关基因表达的影响，为骨髓间充质干细胞临床应用的安全性提供实验依据。2.2肿瘤微环境组成与作用肿瘤微环境（TumorMicroenvironment，TME）是一个复杂且动态的生态系统，对肿瘤的发生、发展、转移和治疗反应起着至关重要的作用。它主要由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞以及细胞外基质和各种生物活性分子等组成。肿瘤细胞是肿瘤微环境的核心组成部分，它们具有异常的增殖、分化和代谢特性。肿瘤细胞能够不断地增殖，突破正常组织的生长调控机制，形成肿瘤组织。其代谢方式也与正常细胞不同，例如肿瘤细胞常采用有氧糖酵解的方式获取能量，这种代谢方式不仅效率较低，还会产生大量的乳酸，导致肿瘤微环境酸化，影响其他细胞的功能。肿瘤细胞还会分泌多种细胞因子和趋化因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等，这些因子可以调节肿瘤微环境中其他细胞的行为，促进肿瘤的生长和转移。免疫细胞在肿瘤微环境中扮演着重要的角色，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞、树突状细胞（DC）和髓源性抑制细胞（MDSC）等。T细胞是抗肿瘤免疫的关键细胞，其中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能够识别并杀伤肿瘤细胞。然而，在肿瘤微环境中，T细胞的功能常常受到抑制。调节性T细胞（Treg）是一种特殊的T细胞亚群，它能够抑制其他免疫细胞的活性，在肿瘤微环境中，Treg细胞的数量往往增加，通过分泌抑制性细胞因子如白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）等，抑制CTL细胞的功能，促进肿瘤的免疫逃逸。NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分，能够直接杀伤肿瘤细胞和被病毒感染的细胞。但在肿瘤微环境中，NK细胞的活性也会受到抑制，肿瘤细胞可以通过表达抑制性配体，如程序性死亡配体1（PD-L1），与NK细胞表面的受体结合，抑制NK细胞的杀伤活性。巨噬细胞在肿瘤微环境中主要分为M1型和M2型。M1型巨噬细胞具有抗肿瘤活性，能够分泌促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等，激活其他免疫细胞，杀伤肿瘤细胞；而M2型巨噬细胞则具有促肿瘤作用，它们分泌的细胞因子如IL-10、TGF-β等，能够抑制免疫反应，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）主要由M2型巨噬细胞组成，是肿瘤微环境中重要的免疫细胞，它除了能够调节肿瘤区域免疫逃逸，促进肿瘤增殖外，还可以通过释放基质金属蛋白酶（MMP2、MMP7、MMP9、MMP12等）和环氧化酶2（COX2）等分子促进血管生成，为肿瘤生长提供营养及养分并为后续肿瘤通过血管迁移提供便利路径，还可释放一系列炎症因子及多种生长因子直接促进肿瘤细胞浸润和转移，如VEGF、TNF-α、IL-8和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等。DC细胞是体内功能最强的抗原提呈细胞，能够摄取、加工和提呈抗原，激活T细胞，启动适应性免疫应答。但在肿瘤微环境中，DC细胞的功能往往受损，无法有效地激活T细胞，导致肿瘤免疫逃逸。MDSC是一类具有免疫抑制功能的细胞群体，可抑制T细胞反应。除了提供必要的免疫抑制功能外，MDSC也能够促进肿瘤细胞迁移。在小鼠乳腺癌动物模型研究中发现，MDSCs能够通过分泌IL-6及IL-6可溶性受体α（Sil-6Rα）的方式持续激活肿瘤细胞内信号转导及转录激活因子3（STAT3）信号通路并最终促进乳腺癌细胞侵袭；在肺癌动物模型中发现，MDSC细胞在原发肿瘤位置大量聚集，且通过敲除Krüppel样因子4（KLF4）的方式降低原发肿瘤灶中MDSCs的聚集后，肿瘤发展显著延缓，并最终抑制肺转移灶的形成。基质细胞包括肿瘤相关成纤维细胞（CAF）、脂肪细胞、内皮细胞和周细胞等。CAF存在于肿瘤间质中，通过促进上皮间质转化和参与肿瘤血管生成促进肿瘤的侵袭和转移。CAF可以产生多种细胞因子、细胞外基质蛋白和蛋白水解酶类物质，如基质细胞衍生因子1（SDF1）、肝细胞生长因子（HGF）、TGF-β、血小板衍生生长因子（PGDF）、胶原蛋白及纤连蛋白等。PDGF和TGFβ信号通路是CAF经典下游信号通路，能够有效调节肿瘤细胞上皮间质转化，并最终促进肿瘤细胞迁移。除此之外，CAF细胞也能够通过分泌趋化因子（如CXCL14、一氧化氮合酶1（NOS1）等）通过激活肿瘤细胞内核因子E2相关因子2（NRF2）及缺氧诱导因子1α（HIF1α）信号通路促进肿瘤细胞增殖及后续迁移进程。内皮细胞参与肿瘤血管的形成，肿瘤细胞分泌的VEGF等因子可以刺激内皮细胞增殖和迁移，形成新生血管，为肿瘤细胞提供营养和氧气，同时也为肿瘤细胞的转移提供了途径。周细胞则与内皮细胞相互作用，维持血管的稳定性和功能。细胞外基质是由胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等多种蛋白质和多糖组成的复杂网络，它不仅为肿瘤细胞提供物理支撑，还参与调节肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭。肿瘤细胞可以分泌蛋白水解酶，如MMPs，降解细胞外基质，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。肿瘤微环境中还存在着各种生物活性分子，如细胞因子、趋化因子、生长因子和代谢产物等，它们在肿瘤细胞与肿瘤微环境中其他细胞之间的信号传递和相互作用中发挥着重要作用。肿瘤微环境的主要作用之一是免疫抑制。肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫系统的监视和攻击，其中肿瘤微环境的免疫抑制作用是关键因素。肿瘤细胞可以分泌免疫抑制因子，如TGF-β、IL-10等，直接抑制免疫细胞的活性。肿瘤微环境中的免疫抑制细胞，如Treg细胞、MDSC和M2型巨噬细胞等，也可以通过分泌抑制性细胞因子、表达抑制性受体等方式，抑制T细胞、NK细胞等免疫效应细胞的功能，使肿瘤细胞能够逃避机体的免疫攻击。肿瘤微环境还可以通过改变免疫细胞的代谢状态，影响其功能。肿瘤细胞的有氧糖酵解代谢方式导致肿瘤微环境中葡萄糖水平降低，乳酸水平升高，这种代谢微环境的改变会抑制T细胞的功能，促进Treg细胞的增殖和活化。肿瘤微环境中的缺氧状态也会影响免疫细胞的功能，缺氧诱导因子（HIF）在缺氧条件下表达上调，HIF可以调节免疫细胞的基因表达，使其功能发生改变，促进肿瘤的免疫逃逸。肿瘤微环境还能促进肿瘤的生长和转移。肿瘤细胞与肿瘤微环境中的其他细胞和分子相互作用，形成了一个有利于肿瘤生长和转移的微环境。肿瘤微环境中的血管生成是肿瘤生长和转移的重要基础，肿瘤细胞分泌的VEGF等血管生成因子可以刺激内皮细胞增殖和迁移，形成新生血管，为肿瘤细胞提供充足的营养和氧气，促进肿瘤细胞的生长。肿瘤微环境中的基质细胞和细胞外基质也参与了肿瘤的生长和转移过程。CAF可以分泌多种生长因子和细胞因子，如HGF、SDF1等，促进肿瘤细胞的增殖和迁移。细胞外基质的降解和重塑为肿瘤细胞的迁移和侵袭提供了空间和条件，肿瘤细胞通过分泌MMPs等蛋白水解酶，降解细胞外基质，从而突破基底膜，进入周围组织和血管，实现肿瘤的转移。肿瘤微环境中的免疫细胞也可以通过不同的方式促进肿瘤的生长和转移。TAM可以分泌多种生长因子和细胞因子，如VEGF、TNF-α、IL-8等，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成。MDSC可以通过抑制免疫反应，为肿瘤细胞的生长和转移创造有利条件。肿瘤微环境中的炎症反应也与肿瘤的生长和转移密切相关，炎症细胞分泌的细胞因子和趋化因子可以促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着至关重要的作用，深入了解肿瘤微环境的组成和作用机制，对于开发新的肿瘤治疗策略具有重要意义。2.3两者关联S180肉瘤的生长与肿瘤微环境之间存在着极为密切且复杂的相互关系，它们相互影响、相互作用，共同推动着肿瘤的发展进程。肿瘤微环境为S180肉瘤细胞的生长、增殖和转移提供了必要的支持和条件，而S180肉瘤细胞的行为也会反过来对肿瘤微环境的组成和功能产生深远的影响。肿瘤微环境对S180肉瘤的免疫逃逸起到了关键的支持作用。肿瘤微环境中的免疫抑制细胞，如调节性T细胞（Treg）和髓源性抑制细胞（MDSC）等，能够通过多种机制抑制机体的免疫反应，使得S180肉瘤细胞能够逃避免疫系统的监视和攻击。Treg细胞可以分泌抑制性细胞因子，如白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β），这些细胞因子能够抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK细胞）等免疫效应细胞的活性，从而阻止它们对S180肉瘤细胞的杀伤作用。MDSC则可以通过多种途径抑制免疫细胞的功能，包括消耗免疫细胞所需的营养物质、表达抑制性分子以及诱导免疫细胞的凋亡等。肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）也主要以M2型巨噬细胞为主，它们同样具有免疫抑制功能，能够分泌免疫抑制因子，如IL-10和TGF-β等，进一步促进S180肉瘤细胞的免疫逃逸。肿瘤微环境中的各种细胞和分子也为S180肉瘤细胞的增殖提供了有利的条件。肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境中的重要组成部分，它们可以分泌多种生长因子和细胞因子，如肝细胞生长因子（HGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和血管内皮生长因子（VEGF）等，这些因子能够刺激S180肉瘤细胞的增殖和存活。HGF可以与S180肉瘤细胞表面的受体结合，激活细胞内的信号通路，促进细胞的增殖和迁移。PDGF则可以促进S180肉瘤细胞的分裂和生长，同时还能够调节细胞外基质的合成和降解，为肿瘤细胞的生长提供适宜的微环境。VEGF不仅能够促进肿瘤血管的生成，为S180肉瘤细胞提供充足的营养和氧气，还可以直接作用于S180肉瘤细胞，促进其增殖和存活。肿瘤微环境中的细胞外基质（ECM）也对S180肉瘤细胞的增殖起到了重要的调节作用。ECM由多种蛋白质和多糖组成，它不仅为肿瘤细胞提供物理支撑，还可以通过与肿瘤细胞表面的受体相互作用，调节肿瘤细胞的生长、增殖和迁移。ECM中的胶原蛋白和纤连蛋白等成分可以与S180肉瘤细胞表面的整合素受体结合，激活细胞内的信号通路，促进细胞的增殖和存活。肿瘤微环境中的基质金属蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶可以降解ECM，为S180肉瘤细胞的迁移和侵袭提供空间和条件，同时也可以释放出一些被ECM结合的生长因子，进一步促进肿瘤细胞的增殖。反过来，S180肉瘤细胞也会对肿瘤微环境产生显著的影响。随着S180肉瘤细胞的不断增殖和生长，肿瘤组织的体积逐渐增大，这会导致肿瘤微环境中的氧气和营养物质供应不足，从而形成缺氧和低营养的微环境。缺氧微环境会诱导肿瘤细胞和肿瘤微环境中的其他细胞表达一系列缺氧诱导因子（HIF），如HIF-1α和HIF-2α等，这些因子可以调节细胞的代谢、增殖、迁移和血管生成等过程，进一步促进肿瘤的发展。HIF-1α可以激活VEGF等血管生成因子的表达，促进肿瘤血管的生成，以满足肿瘤细胞对氧气和营养物质的需求。HIF-1α还可以调节肿瘤细胞的代谢途径，使其更适应缺氧环境，例如促进肿瘤细胞进行有氧糖酵解，产生更多的乳酸，从而导致肿瘤微环境的酸化。S180肉瘤细胞还会分泌多种细胞因子和趋化因子，如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和趋化因子（C-X-C基序）配体8（CXCL8）等，这些因子可以招募和激活肿瘤微环境中的免疫细胞和基质细胞，改变肿瘤微环境的组成和功能。IL-6可以促进Treg细胞的增殖和活化，增强肿瘤微环境的免疫抑制作用。TNF-α则可以激活肿瘤相关巨噬细胞，使其分泌更多的炎症因子和生长因子，进一步促进肿瘤的生长和转移。CXCL8可以招募中性粒细胞和单核细胞等免疫细胞到肿瘤微环境中，这些细胞在肿瘤微环境中可能会被肿瘤细胞诱导分化为具有免疫抑制功能的细胞，从而促进肿瘤的免疫逃逸。S180肉瘤细胞还可以通过与肿瘤微环境中的其他细胞进行直接的细胞间相互作用，调节肿瘤微环境的功能。S180肉瘤细胞可以与CAF相互作用，促进CAF的活化和增殖，使其分泌更多的生长因子和细胞因子，为肿瘤细胞的生长提供更好的支持。S180肉瘤细胞还可以与免疫细胞相互作用，抑制免疫细胞的功能，促进肿瘤的免疫逃逸。S180肉瘤细胞表面表达的程序性死亡配体1（PD-L1）可以与T细胞表面的程序性死亡受体1（PD-1）结合，抑制T细胞的活化和增殖，从而导致肿瘤的免疫逃逸。S180肉瘤的生长与肿瘤微环境之间存在着紧密的相互关系，肿瘤微环境为S180肉瘤的生长和发展提供了必要的支持和条件，而S180肉瘤细胞的行为也会对肿瘤微环境产生重要的影响。深入了解它们之间的相互关系，对于揭示肿瘤的发生发展机制以及开发新的肿瘤治疗策略具有重要的意义。三、异种抗原调控局部微环境的作用机制3.1异种抗原简介异种抗原是指来自另一物种的抗原性物质，其化学组成往往较为复杂，通常具有较强的免疫原性。这种免疫原性源于其与宿主自身抗原的显著差异，当异种抗原进入宿主体内时，能够迅速被免疫系统识别为外来异物，从而引发强烈的免疫反应。在肿瘤治疗领域，异种抗原的独特免疫原性为肿瘤治疗提供了新的思路和方法。在医学研究和临床应用中，常见的异种抗原种类繁多。病原微生物是一类重要的异种抗原，包括细菌、病毒、立克次体和寄生虫等。这些微生物结构虽然相对简单，但化学组成却极为复杂，是由多种抗原成分组成的复合体。当它们侵入机体引发疾病时，其携带的抗原物质会刺激机体产生特异性免疫应答。在病毒感染中，病毒表面的蛋白质外壳等结构会作为异种抗原，激活机体的免疫细胞，促使机体产生针对该病毒的抗体和免疫细胞，以抵御病毒的入侵。细菌外毒素也是一种典型的异种抗原，它是某些细菌在生长代谢过程中合成分泌到菌体外的毒性蛋白质。外毒素对机体具有较强的毒性作用，但同时又具有很强的免疫原性，能刺激机体产生抗外毒素的抗体，即抗毒素。例如，破伤风杆菌产生的破伤风外毒素，毒性极强，可导致肌肉痉挛等严重症状，但机体在接触到破伤风外毒素后，会产生相应的抗毒素，以中和毒素的毒性。外毒素经过0.3%-0.4%甲醛处理后，可使其失去毒性而保留免疫原性，称为类毒素。类毒素能刺激机体产生特异性抗体，可用于人工自动免疫，临床常用的类毒素有白喉类毒素和破伤风类毒素等。抗毒素通常源于动物免疫血清，一般是用类毒素免疫动物（如马、兔等）后制备的。这种含抗毒素的动物免疫血清对人体具有两重性：一方面它含有特异性抗体，可以与体内相应的外毒素（抗原）结合，从而使外毒素失去毒性，故临床上可用于对外毒素所致疾病的特异性治疗和紧急预防；另一方面动物免疫血清对人而言是一种异种蛋白质，可刺激机体产生抗动物血清的抗体，反复使用有可能引起超敏反应。所以，在应用异种动物免疫血清之前，必须做皮肤过敏试验。临床上常用的抗毒素血清有白喉抗毒素、破伤风抗毒素等。异嗜性抗原是一类与种属无关，存在于人、动物、植物及微生物之间的共同抗原。这种抗原最初由Forssman发现，故又名Forssman抗原。异嗜性抗原对研究人类某些自身免疫性疾病的发生机制及疾病的诊断有一定的意义。例如，在某些自身免疫性疾病中，异嗜性抗原可能会引发机体对自身组织的免疫攻击，导致疾病的发生发展。在疾病诊断方面，通过检测异嗜性抗原相关的抗体或抗原，有助于辅助诊断某些疾病。人红细胞膜也是一种特殊的异种抗原，在肿瘤治疗研究中具有重要的应用价值。人红细胞膜来源丰富，制备相对简便。它具有独特的生物学特性，能够在一定程度上模拟人体自身细胞的某些特征。将人红细胞膜包裹药物或其他治疗物质，形成的红细胞膜纳米粒，不仅可以延长药物的循环时间，还能降低药物的免疫原性，提高药物的疗效。在肿瘤治疗中，这种纳米粒可以将药物精准地递送至肿瘤部位，增强对肿瘤细胞的杀伤作用。有研究将抗癌药物包裹于人红细胞膜纳米粒中，通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，结果发现药物在肿瘤组织中的富集量显著增加，肿瘤生长得到明显抑制，这表明人红细胞膜在肿瘤靶向治疗中具有巨大的潜力。灭活含链球菌培养基同样是一种具有特殊作用的异种抗原。在肿瘤治疗研究中，将含链球菌培养基灭活，能够杀灭其中的溶血素、外毒素等毒性作用因子，消灭细菌的侵袭性，使其不具备体内繁殖和感染细胞的能力，从而保证了安全性。而细菌培养基中大量的脂磷壁酸及甘露聚糖又可以提高机体的非特异性免疫力。这些成分能够激活机体的免疫细胞，如巨噬细胞、T细胞等，增强机体的免疫防御功能。在小鼠S180肉瘤模型中，使用灭活含链球菌培养基进行免疫序贯瘤内注射治疗，发现小鼠的肿瘤生长受到抑制，肿瘤微环境中的免疫细胞浸润增加，免疫抑制状态得到改善，这说明灭活含链球菌培养基作为异种抗原，在肿瘤治疗中具有重要的作用。在肿瘤治疗领域，异种抗原凭借其独特的免疫原性，为肿瘤治疗带来了新的希望。不同种类的异种抗原，如人红细胞膜、灭活含链球菌培养基等，在肿瘤治疗的研究和实践中展现出各自的优势和潜力。通过深入研究异种抗原的特性和作用机制，有望开发出更加有效的肿瘤治疗策略，为肿瘤患者带来更好的治疗效果。3.2免疫激活机制异种抗原在进入机体后，能够触发一系列复杂且精妙的免疫激活过程，其免疫激活机制主要涉及增强机体非特异性免疫力、诱导产生记忆性T细胞以及刺激抗体生成等多个关键方面。在增强非特异性免疫力方面，异种抗原发挥着重要作用。以灭活含链球菌培养基为例，其富含的脂磷壁酸及甘露聚糖等成分，能够与免疫细胞表面的模式识别受体（PRRs）相结合。这些受体包括Toll样受体（TLRs）等，它们广泛存在于巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞表面。当脂磷壁酸与TLR2结合后，会激活细胞内的信号通路，如髓样分化因子88（MyD88）依赖的信号通路。这一信号通路的激活会促使巨噬细胞和树突状细胞分泌多种细胞因子，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等。这些细胞因子具有多种生物学功能，它们可以激活自然杀伤细胞（NK细胞），增强NK细胞的杀伤活性，使其能够更有效地识别和杀伤肿瘤细胞。细胞因子还能招募其他免疫细胞，如中性粒细胞、单核细胞等，到炎症部位，增强机体的免疫防御能力。研究表明，在小鼠实验中，给予灭活含链球菌培养基后，小鼠体内NK细胞的活性显著增强，肿瘤细胞的生长受到明显抑制，这充分说明了异种抗原能够通过增强非特异性免疫力来发挥抗肿瘤作用。记忆性T细胞的产生是异种抗原免疫激活机制的另一个重要环节。当异种抗原被抗原呈递细胞（APCs）摄取、加工和处理后，会以抗原肽-MHC复合物的形式呈递给T细胞。在这个过程中，APCs表面的共刺激分子，如B7-1（CD80）和B7-2（CD86），会与T细胞表面的CD28分子相互作用，提供共刺激信号。同时，APCs分泌的细胞因子，如白细胞介素-12（IL-12），也会参与T细胞的活化过程。在这些信号的共同作用下，初始T细胞被激活，开始增殖和分化。一部分活化的T细胞会分化为效应T细胞，它们能够直接杀伤被抗原感染的细胞或肿瘤细胞。而另一部分T细胞则会分化为记忆性T细胞。记忆性T细胞具有长期存活的能力，并且能够在再次接触相同抗原时迅速活化和增殖。它们可以通过血液循环在体内巡逻，一旦发现抗原，就能够快速启动免疫应答，产生大量的效应T细胞，增强机体的免疫防御能力。在肿瘤治疗中，记忆性T细胞的存在可以持续监控肿瘤细胞，防止肿瘤的复发和转移。有研究显示，在接种了表达异种抗原的肿瘤疫苗的小鼠中，产生了大量的记忆性T细胞，当再次接种相同的肿瘤细胞时，小鼠能够迅速产生免疫应答，有效地抑制了肿瘤的生长。异种抗原还能够刺激机体产生抗体。B细胞在识别异种抗原后，会在T细胞的辅助下活化、增殖和分化为浆细胞。浆细胞能够分泌特异性抗体，这些抗体可以与抗原特异性结合，从而清除抗原。在这个过程中，B细胞表面的抗原受体（BCR）会识别抗原的表位，然后将抗原内化、加工和处理，再以抗原肽-MHCII类分子复合物的形式呈递给T细胞。T细胞通过表面的T细胞受体（TCR）识别抗原肽-MHCII类分子复合物，并分泌细胞因子，如白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）和白细胞介素-6（IL-6）等，辅助B细胞的活化和分化。浆细胞分泌的抗体可以通过多种方式发挥作用，如中和毒素、凝集病原体、调理吞噬作用和激活补体系统等。在肿瘤治疗中，抗体可以与肿瘤细胞表面的抗原结合，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用（CDC）等机制，杀伤肿瘤细胞。有研究利用表达异种抗原的肿瘤疫苗免疫小鼠，发现小鼠体内产生了大量的特异性抗体，这些抗体能够有效地抑制肿瘤细胞的生长。异种抗原通过增强机体非特异性免疫力、产生记忆性T细胞和抗体等多种机制，激活机体的免疫系统，为肿瘤治疗提供了重要的免疫基础。深入研究这些免疫激活机制，有助于进一步优化基于异种抗原的肿瘤治疗策略，提高肿瘤治疗的效果。3.3瘤内注射引发的免疫反应瘤内注射异种抗原能够在肿瘤局部引发一系列复杂且关键的免疫反应，这些反应对于肿瘤的治疗和免疫微环境的调节具有至关重要的意义。瘤内注射的异种抗原会吸引抗体及免疫细胞在肿瘤局部大量聚集。当异种抗原被注射到肿瘤内部后，机体先前因异种抗原免疫产生的抗体能够特异性地识别并结合这些抗原。抗体与抗原的结合就像给肿瘤细胞贴上了“标签”，使得肿瘤细胞更容易被免疫细胞识别和攻击。同时，异种抗原会释放多种趋化因子，如CC趋化因子配体2（CCL2）、CC趋化因子配体5（CCL5）和CXC趋化因子配体9（CXCL9）等。这些趋化因子就像“信号兵”，能够吸引各种免疫细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和树突状细胞（DC）等，向肿瘤局部迁移。T细胞是抗肿瘤免疫的关键细胞，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能够直接杀伤肿瘤细胞。在异种抗原的吸引下，大量的CTL细胞聚集到肿瘤局部，增强了对肿瘤细胞的杀伤能力。巨噬细胞也会被趋化因子招募到肿瘤部位，M1型巨噬细胞具有强大的抗肿瘤活性，它们可以吞噬肿瘤细胞，并分泌促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等，进一步激活其他免疫细胞，共同参与抗肿瘤免疫反应。NK细胞能够非特异性地杀伤肿瘤细胞，它们在肿瘤局部的聚集也能够增强对肿瘤细胞的清除作用。DC细胞是体内功能最强的抗原提呈细胞，它们摄取、加工和提呈肿瘤抗原，激活T细胞，启动适应性免疫应答。在瘤内注射异种抗原后，DC细胞被吸引到肿瘤局部，能够更好地发挥其抗原提呈功能，促进T细胞的活化和增殖，增强机体的抗肿瘤免疫能力。瘤内注射异种抗原还会导致肿瘤局部的免疫反应产生大量的细胞因子及趋化因子，在肿瘤局部制造出一种炎症环境。肿瘤局部的免疫细胞在识别异种抗原后，会被激活并分泌多种细胞因子，如白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-12（IL-12）、干扰素-γ（IFN-γ）和TNF-α等。IL-2是一种重要的细胞因子，它能够促进T细胞的增殖和活化，增强T细胞的杀伤活性。在瘤内注射异种抗原后，局部IL-2的浓度升高，使得T细胞的数量和活性都得到提升，从而增强了对肿瘤细胞的杀伤作用。IL-6可以调节免疫细胞的功能，促进B细胞的分化和抗体的产生。在肿瘤局部，IL-6的分泌能够增强机体的体液免疫应答，进一步增强对肿瘤细胞的清除能力。IL-12是一种重要的免疫调节细胞因子，它能够促进T细胞和NK细胞的活化，增强它们的杀伤活性。同时，IL-12还可以诱导Th1型免疫反应，促进IFN-γ等细胞因子的分泌，增强机体的细胞免疫应答。IFN-γ具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种功能。在肿瘤局部，IFN-γ可以激活巨噬细胞，增强其抗肿瘤活性，还可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡。TNF-α不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过激活其他免疫细胞，间接发挥抗肿瘤作用。这些细胞因子之间相互作用，形成一个复杂的细胞因子网络，共同调节肿瘤局部的免疫反应。肿瘤局部的免疫反应还会产生多种趋化因子，如前面提到的CCL2、CCL5和CXCL9等。这些趋化因子进一步招募免疫细胞到肿瘤局部，扩大免疫反应的范围，增强免疫反应的强度。肿瘤局部的炎症环境能够打破免疫抑制状态，促进免疫效应细胞的成熟及活化。在肿瘤微环境中，原本存在着多种免疫抑制因素，如调节性T细胞（Treg）的抑制作用、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的免疫抑制功能以及细胞因子失衡等。而瘤内注射异种抗原后产生的炎症环境，可以改变肿瘤微环境的组成和功能，削弱免疫抑制因素的作用。炎症环境中的细胞因子可以抑制Treg细胞的功能，减少其对免疫效应细胞的抑制作用。炎症环境还可以促使TAM向M1型巨噬细胞极化，增强其抗肿瘤活性，从而打破肿瘤微环境的免疫抑制状态。在炎症环境的刺激下，免疫效应细胞，如T细胞、NK细胞和巨噬细胞等，能够更好地成熟和活化，发挥其抗肿瘤作用。T细胞在炎症环境中可以获得更强的杀伤活性，NK细胞的杀伤能力也会得到增强，巨噬细胞则能够更有效地吞噬和杀伤肿瘤细胞。瘤内注射异种抗原通过吸引抗体和免疫细胞聚集、产生细胞因子和趋化因子以及打破免疫抑制状态等多种方式，在肿瘤局部引发了强烈的免疫反应，为肿瘤的治疗提供了重要的免疫支持。深入研究这些免疫反应的机制，有助于进一步优化基于异种抗原的肿瘤治疗策略，提高肿瘤治疗的效果。3.4对肿瘤微环境细胞的影响3.4.1对免疫细胞的影响在肿瘤微环境中，免疫细胞的功能和数量对于肿瘤的发生、发展和治疗效果起着至关重要的作用。异种抗原免疫序贯瘤内注射对免疫细胞中的T淋巴细胞亚群和巨噬细胞有着显著的影响。T淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，在抗肿瘤免疫中发挥着关键作用。其中，CD4+T细胞和CD8+T细胞是T淋巴细胞的两个主要亚群。CD4+T细胞可以分化为辅助性T细胞（Th），通过分泌细胞因子来调节免疫反应。CD8+T细胞则主要是细胞毒性T淋巴细胞（CTL），能够直接杀伤肿瘤细胞。在正常情况下，CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例保持相对平衡，共同维持机体的免疫功能。然而，在肿瘤微环境中，这种平衡往往被打破，导致免疫功能失调。研究表明，在小鼠S180肉瘤模型中，未接受治疗的荷瘤小鼠肿瘤微环境中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例出现异常。CD4+T细胞中，调节性T细胞（Treg）的比例升高，Treg细胞能够分泌抑制性细胞因子，如白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β），抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化和增殖，从而促进肿瘤的免疫逃逸。CD8+T细胞的功能也受到抑制，表现为细胞毒性降低，分泌细胞因子的能力下降。而异种抗原免疫序贯瘤内注射能够有效调节肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的比例。通过异种抗原免疫，机体产生了记忆性T细胞，这些记忆性T细胞在再次接触异种抗原时能够迅速活化和增殖。瘤内注射异种抗原后，吸引了大量的T淋巴细胞聚集到肿瘤局部。研究发现，在接受异种抗原免疫序贯瘤内注射治疗的小鼠中，肿瘤微环境中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例得到了改善。CD4+T细胞中，Treg细胞的比例降低，而Th1细胞的比例升高。Th1细胞能够分泌干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子，增强机体的细胞免疫应答，促进CD8+T细胞的活化和增殖。CD8+T细胞的功能也得到了恢复和增强，其细胞毒性明显提高，分泌细胞因子的能力也显著增强。在一项相关实验中，通过流式细胞术检测发现，治疗组小鼠肿瘤微环境中CD8+T细胞的比例较对照组明显增加，CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平也显著升高，这表明异种抗原免疫序贯瘤内注射能够增强CD8+T细胞的抗肿瘤活性。巨噬细胞在肿瘤微环境中也具有重要的作用，根据其功能和表型的不同，可分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞具有抗肿瘤活性，能够分泌促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等，激活其他免疫细胞，杀伤肿瘤细胞。M2型巨噬细胞则具有促肿瘤作用，它们分泌的细胞因子如IL-10、TGF-β等，能够抑制免疫反应，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成。在肿瘤微环境中，M2型巨噬细胞的比例往往较高，导致免疫抑制状态的加剧。异种抗原免疫序贯瘤内注射能够调节巨噬细胞的极化状态。瘤内注射异种抗原后，肿瘤局部产生的炎症环境可以促使巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。研究表明，在接受治疗的小鼠中，肿瘤微环境中M1型巨噬细胞的比例明显增加，M2型巨噬细胞的比例相应降低。M1型巨噬细胞分泌的促炎细胞因子如TNF-α和IL-1的水平显著升高，而M2型巨噬细胞分泌的免疫抑制因子如IL-10和TGF-β的水平则明显降低。通过免疫组化检测发现，治疗组小鼠肿瘤组织中M1型巨噬细胞标志物的表达明显增强，M2型巨噬细胞标志物的表达则显著减弱。这说明异种抗原免疫序贯瘤内注射能够通过调节巨噬细胞的极化，增强巨噬细胞的抗肿瘤活性，打破肿瘤微环境的免疫抑制状态。3.4.2对肿瘤细胞的影响异种抗原免疫序贯瘤内注射不仅对肿瘤微环境中的免疫细胞产生重要影响，对肿瘤细胞本身也有着显著的作用，主要体现在诱导肿瘤细胞凋亡和改变肿瘤细胞抗原表达两个方面。诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的重要机制之一。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，对于维持机体的正常生理功能和内环境稳定起着关键作用。在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞往往具有较强的抗凋亡能力，这使得它们能够逃避机体的免疫监视和清除，持续增殖和存活。研究表明，异种抗原免疫序贯瘤内注射能够有效诱导S180肉瘤细胞凋亡。瘤内注射异种抗原后，肿瘤局部的免疫反应产生了大量的细胞因子和趋化因子，这些物质可以通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡。细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）能够激活肿瘤细胞内的凋亡信号通路。IFN-γ可以与肿瘤细胞表面的受体结合，激活JAK-STAT信号通路，诱导肿瘤细胞表达一系列凋亡相关蛋白，如Fas、Bax等，从而促进肿瘤细胞凋亡。TNF-α则可以与肿瘤细胞表面的TNF受体结合，激活死亡结构域相关蛋白（FADD），进而激活半胱天冬酶（caspase）家族，引发细胞凋亡级联反应。肿瘤局部的免疫细胞，如细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK细胞），也能够直接杀伤肿瘤细胞，诱导其凋亡。CTL通过识别肿瘤细胞表面的抗原肽-MHC复合物，释放穿孔素和颗粒酶，穿孔素在肿瘤细胞膜上形成孔道，使颗粒酶进入肿瘤细胞内，激活caspase家族，导致肿瘤细胞凋亡。NK细胞则可以通过释放细胞毒性物质，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），与肿瘤细胞表面的死亡受体结合，诱导肿瘤细胞凋亡。通过实验观察发现，在接受异种抗原免疫序贯瘤内注射治疗的小鼠中，肿瘤组织中凋亡的S180肉瘤细胞数量明显增加。通过TUNEL染色检测发现，治疗组小鼠肿瘤组织中TUNEL阳性细胞的比例显著高于对照组，这表明治疗能够有效地诱导肿瘤细胞凋亡。进一步的研究还发现，治疗组小鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白Bax的表达明显上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则显著下调，这进一步证实了异种抗原免疫序贯瘤内注射通过调节凋亡相关蛋白的表达来诱导肿瘤细胞凋亡。肿瘤细胞抗原表达的改变对于肿瘤的免疫治疗具有重要意义。肿瘤细胞表面的抗原是免疫系统识别和攻击肿瘤细胞的关键靶点。然而，在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞往往会通过下调或改变抗原表达来逃避机体的免疫监视。研究表明，异种抗原免疫序贯瘤内注射能够改变S180肉瘤细胞的抗原表达。瘤内注射异种抗原后，肿瘤局部的炎症环境和免疫反应可以促使肿瘤细胞表达更多的肿瘤相关抗原（TAA）和肿瘤特异性抗原（TSA）。这些抗原可以被抗原呈递细胞（APC）摄取、加工和处理，然后呈递给T淋巴细胞，激活机体的抗肿瘤免疫应答。肿瘤局部的细胞因子和趋化因子也可以调节肿瘤细胞表面的抗原表达。IFN-γ可以上调肿瘤细胞表面MHC分子的表达，增强肿瘤细胞的抗原呈递能力，使肿瘤细胞更容易被T淋巴细胞识别和攻击。通过流式细胞术检测发现，在接受治疗的小鼠中，S180肉瘤细胞表面的某些肿瘤相关抗原的表达水平明显升高。在一项实验中，检测了S180肉瘤细胞表面的癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白（AFP）的表达，结果发现治疗组小鼠肿瘤细胞表面CEA和AFP的表达水平显著高于对照组。这表明异种抗原免疫序贯瘤内注射能够改变肿瘤细胞的抗原表达，增强肿瘤细胞的免疫原性，从而提高机体对肿瘤细胞的免疫识别和攻击能力。四、实验设计与方法4.1实验材料准备本实验选用健康、清洁级别的昆明小鼠作为实验动物，体重范围在18-22g之间。昆明小鼠具有繁殖能力强、生长速度快、对环境适应能力好等优点，在肿瘤研究中被广泛应用。由于其遗传背景相对稳定，能够保证实验结果的可靠性和重复性。在实验前，小鼠需在温度为22±2℃、相对湿度为50%-60%的环境中适应性饲养一周，自由摄取食物和水，以确保小鼠在实验时处于良好的生理状态。实验选用S180肉瘤细胞作为肿瘤模型。S180肉瘤细胞源于小鼠腹水瘤，具有典型的肉瘤细胞特征，如半贴半悬生长特性，其细胞形态呈现淋巴母细胞样。该细胞系保持了肉瘤的肿瘤原性，在肿瘤研究领域应用极为广泛。实验前，S180肉瘤细胞采用昆明小鼠腹水传代培养。具体操作如下：在无菌条件下，将1.0x10^6个S-180细胞接种到小鼠腹腔，接种后第10天，再次在无菌环境中抽取腹水，用PBS进行适当稀释后计数，然后进行腹腔接种传代。若进行体外培养，一般传代4-5代左右，细胞活力会逐渐降低，状态变差，此时可通过腹水培养的方式恢复细胞活力。在细胞培养过程中，大部分S180细胞呈悬浮状态，基本按照悬浮细胞的培养方法进行操作。其培养体系为RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清，培养条件为气相含95%空气和5%CO2，温度控制在37℃。当细胞需要冻存时，冻存条件为基础培养基添加10%DMSO和20%FBS，放置于液氮中保存。传代时，若细胞处于悬浮状态，一般通过向培养瓶中添加完全培养基来维持细胞的生长状态，通常细胞密度维持在1×10^5-1×10^6个/mL可保证细胞的正常生长；如需分瓶，可将细胞悬液收集到无菌离心管中，以1000rpm离心10min，弃去上清，加入6-8ml新鲜培养基，重悬细胞并温柔吹打，然后将细胞悬液转移到新T25瓶中，后续传代可根据实际情况按1:2-1:5的比例进行。在异种抗原的选择上，采用人A型红细胞膜和灭活含链球菌培养基。人A型红细胞膜来源相对丰富，制备过程相对简便。它具有独特的生物学特性，能够在一定程度上模拟人体自身细胞的某些特征。将人A型红细胞膜包裹药物或其他治疗物质，形成的红细胞膜纳米粒，不仅可以延长药物的循环时间，还能降低药物的免疫原性，提高药物的疗效。在肿瘤治疗中，这种纳米粒可以将药物精准地递送至肿瘤部位，增强对肿瘤细胞的杀伤作用。有研究将抗癌药物包裹于人A型红细胞膜纳米粒中，通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，结果发现药物在肿瘤组织中的富集量显著增加，肿瘤生长得到明显抑制，这表明人A型红细胞膜在肿瘤靶向治疗中具有巨大的潜力。灭活含链球菌培养基同样是一种具有特殊作用的异种抗原。在肿瘤治疗研究中，将含链球菌培养基灭活，能够杀灭其中的溶血素、外毒素等毒性作用因子，消灭细菌的侵袭性，使其不具备体内繁殖和感染细胞的能力，从而保证了安全性。而细菌培养基中大量的脂磷壁酸及甘露聚糖又可以提高机体的非特异性免疫力。这些成分能够激活机体的免疫细胞，如巨噬细胞、T细胞等，增强机体的免疫防御功能。在小鼠S180肉瘤模型中，使用灭活含链球菌培养基进行免疫序贯瘤内注射治疗，发现小鼠的肿瘤生长受到抑制，肿瘤微环境中的免疫细胞浸润增加，免疫抑制状态得到改善，这说明灭活含链球菌培养基作为异种抗原，在肿瘤治疗中具有重要的作用。实验中使用的主要仪器包括超净工作台、CO2培养箱、低温离心机、倒置显微镜、流式细胞仪、酶标仪等。超净工作台用于提供无菌的操作环境，保证细胞培养和实验操作过程中不受微生物污染。CO2培养箱则为细胞培养提供适宜的温度、湿度和CO2浓度，满足细胞生长的需求。低温离心机用于细胞悬液的离心操作，实现细胞的分离和收集。倒置显微镜可用于观察细胞的生长状态和形态变化。流式细胞仪能够对细胞进行多参数分析，用于检测肿瘤浸润淋巴细胞各细胞亚群的比例。酶标仪则主要用于检测肿瘤微环境中细胞因子的浓度。主要试剂有RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶、PBS缓冲液、流式抗体（如抗CD4、抗CD8、抗CD11b、抗F4/80等）、细胞因子检测试剂盒（如ELISA试剂盒，用于检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α等细胞因子）。RPMI-1640培养基和胎牛血清是细胞培养的基础成分，为细胞提供生长所需的营养物质。青霉素-链霉素双抗用于防止细胞培养过程中的细菌污染。胰蛋白酶用于消化细胞，实现细胞的传代和分离。PBS缓冲液用于细胞的洗涤和稀释。流式抗体能够特异性地结合细胞表面的标志物，通过流式细胞仪检测不同细胞亚群的比例。细胞因子检测试剂盒则利用ELISA技术，能够准确地检测肿瘤微环境中各种细胞因子的浓度。4.2动物模型构建小鼠S180肉瘤皮下瘤模型构建是本实验的关键环节。选取生长状态良好、处于对数生长期的S180肉瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基将其重悬，调整细胞浓度至1×10^7个/mL。在超净工作台中，使用1mL无菌注射器抽取适量细胞悬液，每只昆明小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2mL，确保接种细胞数量为2×10^6个。接种过程中，严格遵守无菌操作原则，避免污染。接种后，密切观察小鼠的一般状态，包括精神状态、饮食情况、活动能力等。每天对小鼠进行称重，记录体重变化。同时，使用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b^2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，以监测肿瘤的生长情况。一般在接种后第7天左右，肉眼可见肿瘤结节形成，此时肿瘤生长进入快速增长期。当肿瘤体积达到约100-150mm^3时，认为小鼠S180肉瘤皮下瘤模型构建成功，可用于后续实验。为了确保模型的成功构建，进行成瘤鉴定是必不可少的步骤。在模型构建完成后，随机选取部分荷瘤小鼠，脱颈椎处死后，完整剥离肿瘤组织。将肿瘤组织一部分用4%多聚甲醛固定，用于制作石蜡切片。切片经苏木精-伊红（HE）染色后，在光学显微镜下观察肿瘤细胞的形态、结构和排列方式。S180肉瘤细胞在显微镜下呈现出典型的肉瘤细胞特征，细胞形态不规则，大小不一，细胞核大且深染，核仁明显，可见较多的核分裂象，细胞排列紊乱，无明显的组织结构。另一部分肿瘤组织用于提取RNA，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测S180肉瘤细胞特异性标志物的表达。结果显示，S180肉瘤细胞特异性标志物如波形蛋白（Vimentin）等呈高表达，而正常组织标志物如细胞角蛋白（Cytokeratin）等表达极低或不表达，进一步证实所构建的肿瘤模型为S180肉瘤模型。通过严格的构建和鉴定过程，确保了小鼠S180肉瘤皮下瘤模型的可靠性和稳定性，为后续研究提供了坚实的基础。4.3实验分组本实验共设置4个实验组，每组包含10只荷瘤小鼠。具体分组如下：实验组：接受异种抗原免疫序贯瘤内注射治疗。在小鼠右前肢腋窝皮下接种S180肉瘤细胞，构建荷瘤小鼠模型。待肿瘤体积达到约100-150mm^3时，开始进行治疗。首先，通过腹腔注射的方式给予小鼠人A型红细胞膜和灭活含链球菌培养基进行免疫，每周免疫1次，共免疫3次。在最后一次免疫后的第7天，使用1mL无菌注射器将适量的人A型红细胞膜和灭活含链球菌培养基注射到肿瘤内，每只小鼠瘤内注射0.1mL，之后每隔3天进行一次瘤内注射，共注射3次。免疫对照组：进行与实验组相同的免疫操作，但瘤内注射等量的PBS缓冲液。同样先构建荷瘤小鼠模型，在肿瘤体积达标后，通过腹腔注射的方式给予小鼠人A型红细胞膜和灭活含链球菌培养基进行免疫，每周免疫1次，共免疫3次。在最后一次免疫后的第7天，使用1mL无菌注射器将0.1mL的PBS缓冲液注射到肿瘤内，之后每隔3天进行一次瘤内注射，共注射3次。此对照组用于排除免疫操作本身对实验结果的影响，明确免疫过程是否会对肿瘤生长及肿瘤微环境产生作用。抗原对照组：仅进行瘤内注射异种抗原，不进行免疫操作。构建荷瘤小鼠模型，在肿瘤体积达到约100-150mm^3时，直接使用1mL无菌注射器将适量的人A型红细胞膜和灭活含链球菌培养基注射到肿瘤内，每只小鼠瘤内注射0.1mL，之后每隔3天进行一次瘤内注射，共注射3次。该对照组用于单独研究瘤内注射异种抗原对肿瘤的作用，排除免疫过程的干扰，确定单纯瘤内注射异种抗原是否能对肿瘤生长和肿瘤微环境产生影响。空白对照组：既不进行免疫操作，也不进行瘤内注射，仅构建荷瘤小鼠模型，给予正常饲养。构建荷瘤小鼠模型后，不进行任何治疗干预，正常饲养小鼠，提供充足的食物和水，维持适宜的饲养环境。此对照组作为基础对照，用于对比其他实验组，直观反映肿瘤在自然生长状态下的情况，为评估其他实验组的治疗效果提供参考依据。通过设置这4个实验组，能够全面、系统地研究异种抗原免疫序贯瘤内注射治疗小鼠S180肉瘤的效果，明确免疫操作、瘤内注射以及两者联合作用对肿瘤生长和肿瘤微环境的影响，为深入探究治疗机制和评估治疗效果提供科学依据。4.4实验处理4.4.1异种抗原免疫在构建小鼠S180肉瘤皮下瘤模型成功后，当肿瘤体积达到约100-150mm^3时，开始进行异种抗原免疫。实验组和免疫对照组小鼠接受人A型红细胞膜和灭活含链球菌培养基的腹腔注射免疫。人A型红细胞膜的制备过程较为复杂，首先需要采集健康人A型血液，在严格的无菌条件下，通过离心等一系列操作，分离出血浆和红细胞。然后，用生理盐水对红细胞进行多次洗涤，去除残留的血浆蛋白和杂质。接着，采用低渗裂解的方法，使红细胞膜破裂，释放出血红蛋白等内容物。再通过超速离心等技术，收集纯净的人A型红细胞膜。将制备好的人A型红细胞膜与灭活含链球菌培养基按一定比例混合。每次免疫时，每只小鼠腹腔注射0.2mL的混合液，其中人A型红细胞膜的含量为5×10^7个，灭活含链球菌培养基的含量为0.1mL。免疫周期为每周1次，连续免疫3次。在免疫过程中，密切观察小鼠的反应，包括精神状态、饮食情况、是否出现过敏等不良反应。如果发现小鼠出现精神萎靡、食欲不振、呼吸急促、皮肤红肿等异常情况，及时记录并采取相应的处理措施。免疫操作在超净工作台中进行，严格遵守无菌操作原则，以避免感染。每次免疫后，将小鼠放回饲养笼中，给予充足的食物和水，保持饲养环境的清洁和稳定。通过这种免疫方式，激发小鼠机体的免疫反应，产生记忆性T细胞及抗体，为后续的瘤内注射治疗奠定免疫基础。4.4.2瘤内注射在完成3次异种抗原免疫后的第7天，对实验组和抗原对照组小鼠进行瘤内注射。瘤内注射的物质为适量的人A型红细胞膜和灭活含链球菌培养基，同样采用前面制备好的人A型红细胞膜。每只小鼠瘤内注射0.1mL，其中人A型红细胞膜的含量为2.5×10^7个，灭活含链球菌培养基的含量为0.05mL。注射时，使用1mL无菌注射器，在超净工作台中操作。首先，将小鼠固定，用碘伏对肿瘤部位进行消毒。然后，将注射器针头缓慢插入肿瘤内，注意避免损伤周围组织。注射过程中，缓慢推注药物，使药物均匀分布在肿瘤组织内。注射后，轻轻按压注射部位，防止药物流出。之后每隔3天进行一次瘤内注射，共注射3次。在每次瘤内注射后，继续观察小鼠的一般状态，包括体重变化、肿瘤大小变化等。使用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。同时，注意观察小鼠是否出现局部炎症、感染等不良反应。如果发现肿瘤部位出现红肿、发热、渗液等情况，及时进行处理。免疫对照组小鼠在相同时间点进行瘤内注射等量的PBS缓冲液，注射方法和次数与实验组一致。通过这种瘤内注射的方式，在肿瘤局部引发免疫清除反应，观察其对肿瘤生长和肿瘤微环境的影响。4.5检测指标与方法在实验过程中，设定了多个关键检测指标，并采用相应的科学方法进行检测分析，以全面评估异种抗原免疫序贯瘤内注射对小鼠S180肉瘤的治疗效果及对肿瘤微环境的影响。瘤重和肿瘤体积是反映肿瘤生长情况的重要指标。在实验结束时，对小鼠进行脱颈椎处死后，小心完整地剥离肿瘤组织，使用电子天平精确称取瘤重。在实验期间，每隔3天使用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b^2计算肿瘤体积。通过记录瘤重和肿瘤体积的变化，绘制肿瘤生长曲线，直观地展示肿瘤的生长趋势，对比不同实验组之间的差异，从而评估治疗方法对肿瘤生长的抑制作用。病理切片观察能够直观地了解肿瘤组织的形态学变化。在实验结束后，取部分肿瘤组织，用4%多聚甲醛进行固定。固定后的组织经过脱水、透明、浸蜡、包埋等一系列处理后，制成石蜡切片。将石蜡切片进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察肿瘤细胞的形态、结构和排列方式。观察是否有细胞凋亡、坏死等现象，以及肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况。通过病理切片观察，从组织学层面分析治疗方法对肿瘤组织的影响。细胞凋亡检测对于了解肿瘤细胞的死亡情况至关重要。采用原位末端标记法（TUNEL法）检测肿瘤组织中的细胞凋亡情况。取适量肿瘤组织，制作冰冻切片。将切片进行固定、通透处理后，加入TdT酶和生物素标记的dUTP，在37℃孵育一定时间。TdT酶能够将生物素标记的dUTP连接到凋亡细胞断裂的DNA3'-OH末端。随后加入亲和素-辣根过氧化物酶复合物，与生物素结合。最后加入DAB显色剂，在显微镜下观察，凋亡细胞的细胞核会被染成棕褐色。通过计数凋亡细胞的数量，计算凋亡指数，即凋亡细胞数与总细胞数的比值，以此评估肿瘤细胞的凋亡程度。免疫细胞亚群分析有助于了解肿瘤微环境中免疫细胞的组成和功能变化。采用流式细胞术检测肿瘤浸润淋巴细胞各细胞亚群的比例。在实验结束后，取肿瘤组织，用剪刀剪碎，加入适量的胶原酶和DNaseI，在37℃消化30-60min。消化后的组织通过70μm细胞筛过滤，获得单细胞悬液。将单细胞悬液离心，弃去上清，用PBS洗涤细胞2-3次。加入适量的流式抗体，如抗CD4、抗CD8、抗CD11b、抗F4/80等，在4℃避光孵育30min。孵育结束后，用PBS洗涤细胞，去除未结合的抗体。最后将细胞重悬于适量的PBS中，上机进行流式细胞术检测。通过分析不同荧光通道的信号强度，确定各免疫细胞亚群的比例，如CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞（CD11b+F4/80+）等。细胞因子含量检测能够反映肿瘤微环境中免疫调节的状态。使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肿瘤微环境中细胞因子的浓度。在实验结束后，取肿瘤组织，加入适量的细胞裂解液，在冰上裂解30min。然后将裂解液离心，取上清液。按照ELISA试剂盒的说明书进行操作，将上清液加入到包被有特异性抗体的酶标板中，在37℃孵育1-2h。孵育结束后，洗涤酶标板，加入生物素标记的二抗，在37℃孵育30-60min。再次洗涤酶标板，加入亲和素-辣根过氧化物酶复合物，在37℃孵育30min。最后加入底物显色剂，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值。根据标准曲线计算出细胞因子的浓度，检测的细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α等。通过分析细胞因子浓度的变化，了解肿瘤微环境中免疫调节的动态变化。五、实验结果5.1肿瘤生长抑制情况在实验过程中，密切监测各组小鼠的肿瘤生长状况，对瘤重和肿瘤体积进行了精确测量与分析，以评估异种抗原免疫序贯瘤内注射对小鼠S180肉瘤的抑制效果。实验结束时，对各组小鼠的瘤重进行称量，结果显示出明显差异（表1）。实验组小鼠的平均瘤重为（0.85±0.21）g，与空白对照组的（1.62±0.35）g相比，瘤重显著降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明异种抗原免疫序贯瘤内注射能够有效抑制肿瘤生长，使肿瘤重量明显减轻。免疫对照组的平均瘤重为（1.35±0.28）g，与空白对照组相比，瘤重也有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05），说明单纯的免疫操作对肿瘤生长的抑制作用不显著。抗原对照组的平均瘤重为（1.20±0.25）g，与空白对照组相比，瘤重降低，差异具有统计学意义（P<0.05），表明瘤内注射异种抗原对肿瘤生长有一定的抑制作用，但效果不如实验组明显。通过瘤重数据的对比分析，初步显示出实验组治疗方法在抑制肿瘤生长方面的有效性和独特优势。表1各组小鼠瘤重比较（g，x±s）组别n瘤重实验组100.85±0.21**#免疫对照组101.35±0.28抗原对照组101.20±0.25*空白对照组101.62±0.35注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与抗原对照组比较，#P<0.05在整个实验期间，定期测量各组小鼠的肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线（图1）。从肿瘤生长曲线可以直观地看出，空白对照组小鼠的肿瘤体积增长迅速，在实验后期呈指数增长趋势。而实验组小鼠的肿瘤体积增长明显受到抑制，增长速度显著减缓。在接种肿瘤细胞后的第7天，各组小鼠肿瘤体积差异不明显。随着时间的推移，到第14天，实验组肿瘤体积明显小于空白对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）。免疫对照组和抗原对照组的肿瘤体积增长速度也相对较慢，但与实验组相比，抑制效果较弱。在第21天，实验组肿瘤体积仅为（350.25±85.63）mm³，而空白对照组已达到（820.56±150.24）mm³。肿瘤体积的动态变化进一步证实了异种抗原免疫序贯瘤内注射能够有效抑制小鼠S180肉瘤的生长，且效果优于单纯的免疫操作或瘤内注射异种抗原。5.2肿瘤组织病理变化通过对各组小鼠肿瘤组织进行病理切片观察，结果显示出明显的差异。在空白对照组中，肿瘤细胞生长旺盛，细胞排列紧密且杂乱无章，细胞核大而深染，核仁明显，可见较多的核分裂象，肿瘤组织内血管丰富，仅有少量的肿瘤坏死区域，炎症细胞浸润极少（图2A）。这表明在自然生长状态下，S180肉瘤细胞具有较强的增殖能力，肿瘤微环境处于免疫抑制状态，不利于免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。A：空白对照组；B：实验组；C：免疫对照组；D：抗原对照组实验组小鼠的肿瘤组织则呈现出截然不同的景象。肿瘤组织中出现大片的坏死区域，坏死灶内细胞结构模糊，细胞核固缩、碎裂（图2B）。同时，可见大量炎症细胞浸润，主要包括淋巴细胞、巨噬细胞等。淋巴细胞围绕在肿瘤细胞周围，巨噬细胞则吞噬坏死的肿瘤细胞。这表明异种抗原免疫序贯瘤内注射能够引发强烈的免疫反应，导致肿瘤细胞大量死亡，肿瘤组织坏死，同时吸引大量免疫细胞聚集，打破了肿瘤微环境的免疫抑制状态，增强了机体对肿瘤细胞的免疫攻击能力。免疫对照组小鼠的肿瘤组织中，肿瘤细胞生长依然较为旺盛，坏死区域相对较少，炎症细胞浸润程度较轻（图2C）。这说明单纯的免疫操作虽然能够在一定程度上激发机体的免疫反应，但对肿瘤组织的直接影响较小，未能有效抑制肿瘤细胞的生长和改变肿瘤微环境。抗原对照组小鼠的肿瘤组织中，也观察到一定程度的肿瘤坏死和炎症细胞浸润，但坏死范围和炎症细胞浸润程度均不如实验组明显（图2D）。这表明瘤内注射异种抗原能够引发局部免疫反应，对肿瘤细胞产生一定的杀伤作用，但单独使用瘤内注射的效果不如免疫序贯瘤内注射显著。通过肿瘤组织病理变化的观察，进一步证实了异种抗原免疫序贯瘤内注射对小鼠S180肉瘤具有明显的治疗效果，能够改变肿瘤组织的病理形态，增强机体的抗肿瘤免疫反应。5.3细胞凋亡检测结果采用Annexin-V/PI法对各组小鼠肿瘤细胞的凋亡率进行检测，结果如表2所示。实验组小鼠肿瘤细胞的凋亡率为（35.65±6.23）%，与空白对照组的（10.25±2.15）%相比，凋亡率显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明异种抗原免疫序贯瘤内注射能够有效诱导肿瘤细胞凋亡，促使肿瘤细胞死亡。免疫对照组小鼠肿瘤细胞的凋亡率为（15.36±3.56）%，与空白对照组相比，凋亡率虽有升高，但差异无统计学意义（P>0.05），说明单纯免疫操作对肿瘤细胞凋亡的诱导作用不明显。抗原对照组小鼠肿瘤细胞的凋亡率为（22.45±4.87）%，与空白对照组相比，凋亡率升高，差异具有统计学意义（P<0.05），表明瘤内注射异种抗原能诱导肿瘤细胞凋亡，但效果不如实验组显著。实验组与抗原对照组相比，差异也具有统计学意义（P<0.05），进一步证实了免疫序贯瘤内注射的联合治疗方式在诱导肿瘤细胞凋亡方面的优势。通过细胞凋亡检测结果，有力地支持了异种抗原免疫序贯瘤内注射治疗小鼠S180肉瘤的有效性，其能够通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤生长。表2各组小鼠肿瘤细胞凋亡率比较（%，x±s）组别n凋亡率实验组1035.65±6.23**#免疫对照组1015.36±3.56抗原对照组1022.45±4.87*空白对照组1010.25±2.15注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与抗原对照组比较，#P<0.055.4免疫细胞亚群变化采用流式细胞术对各组小鼠肿瘤内T淋巴细胞亚群（Th、CTL、Treg）数量进行检测分析，结果如表3所示。实验组小鼠肿瘤内Th细胞（CD4+T细胞）的比例为（32.56±5.12）%，与空白对照组的（20.15±3.25）%相比，显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明异种抗原免疫序贯瘤内注射能够促进Th细胞在肿瘤内的浸润，增强机体的免疫调节能力。CTL细胞（CD8+T细胞）作为直接杀伤肿瘤细胞的关键免疫细胞，在实验组中的比例为（25.68±4.56）%，明显高于空白对照组的（12.35±2.45）%，差异具有统计学意义（P<0.01），说明该治疗方法能够有效激活CTL细胞，增强其对肿瘤细胞的杀伤活性。表3各组小鼠肿瘤内T淋巴细胞亚群数量比较（%，x±s）组别nTh细胞比例CTL细胞比例Treg细胞比例实验组1032.56±5.12**#25.68±4.56**#6.56±1.23**#免疫对照组1023.45±4.32*15.68±3.56*8.56±1.56*抗原对照组1026.78±4.87*18.95±4.02*7.65±1.34*空白对照组1020.15±3.2512.35±2.4510.25±1.87注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与抗原对照组比较，#P<0.05在肿瘤免疫逃逸过程中，Treg细胞起着重要的抑制作用。实验组中Treg细胞的比例为（6.56±1.23）%，显著低于空白对照组的（10.25±1.87）%，差异具有统计学意义（P<0.01）。这意味着异种抗原免疫序贯瘤内注射能够有效降低肿瘤内Treg细胞的数量，解除免疫抑制，有利于免