异种抗原免疫及瘤内注射对荷瘤小鼠脾淋巴细胞免疫功能的影响：机制与应用探索

异种抗原免疫及瘤内注射对荷瘤小鼠脾淋巴细胞免疫功能的影响：机制与应用探索一、引言1.1研究背景肿瘤，作为严重威胁人类健康的重大疾病，其发病率和死亡率在全球范围内持续攀升，已然成为亟待攻克的医学难题。在众多肿瘤治疗手段中，免疫治疗凭借其独特的作用机制和显著的疗效，成为近年来肿瘤治疗领域的研究热点，被视为继手术、化疗、放疗和靶向治疗后的又一重要治疗方式。免疫治疗旨在激活机体自身的免疫系统，使其能够识别并攻击肿瘤细胞，具有特异性强、副作用相对较小等优势。然而，目前肿瘤免疫治疗在临床应用中仍面临诸多挑战。一方面，患者对肿瘤免疫治疗的反应存在显著差异，疗效个体差异大，仅有部分患者能够从中获益。以备受瞩目的免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1抑制剂）为例，虽然在部分肿瘤患者中取得了良好的治疗效果，但总体有效应答率较低，仅约20%左右，这意味着大部分肿瘤患者无法从这类治疗中获得明显益处。另一方面，免疫治疗还存在对“冷肿瘤”无效以及耐药后肿瘤易复发等问题。“冷肿瘤”微环境中缺乏免疫细胞浸润，免疫检查点抑制剂难以发挥作用；而耐药问题则使得原本有效的治疗方案逐渐失去效果，肿瘤再次进展，严重影响患者的生存质量和预后。免疫系统在肿瘤的发生、发展和治疗过程中起着关键作用。免疫细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞等，是免疫系统的重要组成部分，它们协同作战，共同抵御肿瘤细胞的侵袭。T细胞能够识别肿瘤细胞表面的抗原，并发动免疫攻击；B细胞可产生抗体，参与体液免疫反应；NK细胞则能直接杀伤肿瘤细胞，无需预先接触抗原。然而，肿瘤细胞具有复杂的免疫逃逸机制，它们能够通过多种方式逃避机体免疫系统的监视和攻击。例如，肿瘤细胞可以下调表面抗原的表达，使免疫细胞难以识别；或者分泌免疫抑制因子，如TGF-β、IL-10等，抑制免疫细胞的活性和功能；还可以招募调节性T细胞（Treg）等免疫抑制细胞，营造免疫抑制微环境，阻碍免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此，如何提升免疫功能，增强免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，打破肿瘤的免疫逃逸机制，成为肿瘤免疫治疗领域亟待解决的关键问题。在这样的背景下，异种抗原免疫及瘤内注射作为两种新兴的肿瘤免疫治疗策略，逐渐受到研究者的关注。异种抗原是指来自不同种属生物的抗原物质，具有较强的免疫原性，能够激活机体的免疫系统，引发强烈的免疫反应。通过异种抗原免疫，有望增强机体的非特异性免疫力，产生记忆性T细胞及抗体，为后续的免疫治疗奠定基础。瘤内注射则是将药物或生物制剂直接注入肿瘤组织内，使药物在肿瘤局部达到较高浓度，从而更有效地发挥治疗作用。瘤内注射不仅可以直接作用于肿瘤细胞，还能改变肿瘤微环境，吸引免疫细胞浸润，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。将异种抗原免疫与瘤内注射相结合，可能会产生协同效应，进一步增强抗肿瘤免疫反应，为肿瘤治疗带来新的希望。然而，目前关于异种抗原免疫及瘤内注射对荷瘤小鼠脾淋巴细胞免疫功能影响的研究仍相对较少，其具体作用机制尚不完全明确。深入探究这两种治疗策略对脾淋巴细胞免疫功能的影响，不仅有助于揭示其抗肿瘤的内在机制，还能为临床肿瘤免疫治疗提供重要的理论依据和实验支持，具有重要的科学意义和临床应用价值。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究异种抗原免疫及瘤内注射这两种治疗策略对荷瘤小鼠脾淋巴细胞免疫功能的影响，全面解析其潜在的作用机制。通过系统研究，有望揭示这两种治疗方式如何调节脾淋巴细胞的活性、增殖能力、细胞因子分泌以及免疫细胞亚群的分布变化等，从而为理解肿瘤免疫治疗的内在机制提供关键的理论依据。从理论层面来看，目前关于肿瘤免疫治疗的机制研究仍存在诸多空白和不确定性。深入研究异种抗原免疫及瘤内注射对脾淋巴细胞免疫功能的影响，有助于填补这一领域的理论空白，进一步完善肿瘤免疫治疗的理论体系。例如，明确异种抗原如何激活脾淋巴细胞，以及瘤内注射如何改变肿瘤微环境对脾淋巴细胞的作用，将为后续的研究提供重要的理论框架，推动肿瘤免疫治疗基础研究的深入发展。在实践应用方面，本研究成果具有广阔的临床转化前景。若能证实异种抗原免疫及瘤内注射可有效增强荷瘤小鼠脾淋巴细胞免疫功能，那么这些发现将为临床肿瘤免疫治疗提供全新的治疗思路和方法。一方面，可能开发出基于异种抗原免疫及瘤内注射的新型联合治疗方案，通过优化治疗组合，提高肿瘤患者对免疫治疗的反应率，改善患者的治疗效果和预后。另一方面，为个性化治疗提供依据，根据患者的具体病情和免疫状态，精准选择合适的治疗策略，实现精准医疗，最大程度地发挥免疫治疗的优势，为肿瘤患者带来更多的生存希望和更好的生活质量。此外，该研究还有助于推动相关药物和生物制剂的研发，促进肿瘤免疫治疗产业的发展，为解决全球肿瘤问题做出积极贡献。二、相关理论基础2.1肿瘤免疫学基础肿瘤免疫学是一门研究机体免疫系统与肿瘤相互作用关系的学科，旨在揭示肿瘤发生、发展以及机体抗肿瘤免疫反应的机制，为肿瘤的诊断、治疗和预防提供理论依据和实践指导。肿瘤免疫的核心在于免疫系统对肿瘤细胞的识别与清除。正常情况下，机体的免疫系统能够识别并清除体内发生突变的肿瘤细胞，维持机体内环境的稳定。免疫系统中的T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞，在肿瘤免疫过程中发挥着关键作用。T细胞作为细胞免疫的主要执行者，可分为细胞毒性T细胞（CTL）和辅助性T细胞（Th）等亚群。CTL能够识别肿瘤细胞表面的抗原肽-MHC复合物，并释放穿孔素和颗粒酶等物质，直接杀伤肿瘤细胞。Th细胞则通过分泌细胞因子，辅助其他免疫细胞的活化和增殖，增强机体的免疫应答。例如，Th1细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）能够激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤肿瘤细胞的能力；Th2细胞分泌的白细胞介素-4（IL-4）等细胞因子，可促进B细胞的活化和抗体的产生，参与体液免疫反应。B细胞在肿瘤免疫中主要通过产生特异性抗体发挥作用。当B细胞受到肿瘤抗原刺激后，会分化为浆细胞，分泌抗体。这些抗体可以与肿瘤细胞表面的抗原结合，通过调理作用、补体依赖的细胞毒作用等机制，促进免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。NK细胞是一种天然免疫细胞，无需预先接触抗原即可直接杀伤肿瘤细胞。NK细胞通过释放细胞毒性物质，如穿孔素、颗粒酶等，破坏肿瘤细胞的细胞膜，导致肿瘤细胞凋亡。此外，NK细胞还能分泌细胞因子，如干扰素-α（IFN-α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，调节免疫系统的功能，增强机体的抗肿瘤免疫反应。然而，肿瘤细胞并非束手就擒，它们会利用一系列复杂而巧妙的机制来逃避机体免疫系统的监视和攻击，这一现象被称为肿瘤免疫逃逸。肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生、发展过程中的关键环节，也是肿瘤治疗面临的重大挑战之一。肿瘤细胞免疫逃逸的机制是多方面的，涉及肿瘤细胞本身的特性改变以及肿瘤微环境的免疫抑制作用。从肿瘤细胞自身特性来看，抗原调变是常见的逃逸机制之一。肿瘤细胞在生长过程中，其表面的抗原表达可能会发生改变，如抗原的丢失、减少或变异。这种抗原调变使得免疫系统难以识别肿瘤细胞，从而逃避了免疫细胞的攻击。例如，某些肿瘤细胞可能会下调主要组织相容性复合体（MHC）分子的表达，导致肿瘤抗原无法有效地呈递给T细胞，使得T细胞难以识别肿瘤细胞。肿瘤细胞还可能通过分泌免疫抑制因子来营造免疫抑制微环境，抑制免疫细胞的活性和功能。常见的免疫抑制因子包括转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-10（IL-10）等。TGF-β可以抑制T细胞、NK细胞的增殖和活化，促进调节性T细胞（Treg）的分化和扩增；IL-10则能抑制巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞的功能，降低其对肿瘤抗原的摄取、加工和呈递能力。肿瘤微环境中的免疫抑制细胞也在肿瘤免疫逃逸中扮演重要角色。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞（Treg）等免疫抑制细胞在肿瘤微环境中大量聚集。TAM可分泌多种细胞因子和趋化因子，抑制T细胞和NK细胞的活性，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成。MDSC能够通过多种机制抑制免疫细胞的功能，如消耗免疫细胞活化所需的氨基酸、产生活性氧和一氧化氮等细胞毒性物质，直接损伤免疫细胞。Treg细胞则通过分泌抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β等，抑制效应T细胞的活化和增殖，维持机体的免疫耐受状态，使肿瘤细胞得以逃脱免疫系统的攻击。肿瘤细胞还可以通过诱导免疫细胞凋亡来削弱免疫系统的功能。肿瘤细胞可以表达FasL等凋亡诱导分子，与免疫细胞表面的Fas受体结合，激活免疫细胞内的凋亡信号通路，导致免疫细胞凋亡。肿瘤细胞还能通过上调抗凋亡蛋白的表达，抵抗免疫细胞的杀伤作用。打破免疫耐受，恢复免疫系统对肿瘤细胞的有效识别和攻击，是肿瘤免疫治疗的关键所在。免疫治疗的核心目标就是通过各种手段，激活机体的免疫系统，克服肿瘤的免疫逃逸机制，实现对肿瘤细胞的有效杀伤。例如，免疫检查点抑制剂通过阻断免疫检查点分子，如程序性死亡受体1（PD-1）及其配体（PD-L1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）等，解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，使免疫细胞能够重新发挥对肿瘤细胞的杀伤功能。肿瘤疫苗则通过激发机体的特异性免疫反应，诱导T细胞和B细胞对肿瘤抗原产生记忆性免疫应答，增强机体对肿瘤细胞的识别和攻击能力。过继性细胞治疗，如CAR-T细胞治疗，通过将经过基因改造的具有肿瘤特异性识别能力的T细胞回输到患者体内，直接杀伤肿瘤细胞。这些免疫治疗方法为肿瘤患者带来了新的希望，但目前仍面临着诸多挑战，如治疗效果的个体差异大、耐药性的产生以及免疫相关不良反应等。深入研究肿瘤免疫逃逸机制，探索更加有效的免疫治疗策略，对于提高肿瘤治疗效果、改善患者预后具有重要意义。2.2异种抗原免疫原理异种抗原是指来自另一物种的抗原性物质，其化学组成复杂多样，与机体自身的抗原具有显著差异。对人类而言，各种病原微生物，如细菌、病毒、立克次体和寄生虫等，均属于异种抗原。这些病原微生物虽然结构相对简单，但其内部包含了多种不同的抗原成分，形成了一个复杂的抗原复合体。当它们侵入机体后，不仅会引发疾病，还会作为异种抗原刺激机体产生特异性免疫应答。例如，流感病毒侵入人体后，其表面的血凝素和神经氨酸酶等蛋白作为异种抗原，能够被免疫系统识别，从而引发机体产生相应的抗体和细胞免疫反应，以抵御病毒的感染。细菌外毒素也是一类重要的异种抗原，它是某些细菌在生长代谢过程中合成分泌到菌体外的毒性蛋白质。外毒素对机体具有较强的毒性作用，可导致机体出现各种中毒症状。同时，外毒素又具有很强的免疫原性，能刺激机体产生抗外毒素的抗体，即抗毒素。例如，破伤风杆菌分泌的破伤风外毒素，毒性极强，可引起肌肉痉挛等严重症状，但机体在受到外毒素刺激后，会产生破伤风抗毒素，中和外毒素的毒性，从而起到保护作用。为了降低外毒素的毒性，同时保留其免疫原性，常采用0.3%～0.4%甲醛处理外毒素，使其转变为类毒素。类毒素能刺激机体产生特异性抗体，可用于人工自动免疫，临床常用的类毒素有白喉类毒素和破伤风类毒素等。抗毒素通常源于动物免疫血清，一般是用类毒素免疫动物（如马、兔等）后制备的。这种含抗毒素的动物免疫血清对人体具有两重性。一方面，它含有特异性抗体，可以与体内相应的外毒素（抗原）结合，从而使外毒素失去毒性，故临床上可用于对外毒素所致疾病的特异性治疗和紧急预防。另一方面，动物免疫血清对人而言是一种异种蛋白质，可刺激机体产生抗动物血清的抗体，反复使用有可能引起超敏反应。因此，在应用异种动物免疫血清之前，必须做皮肤过敏试验。临床上常用的抗毒素血清有白喉抗毒素、破伤风抗毒素等。异嗜性抗原是一类特殊的异种抗原，它与种属无关，存在于人、动物、植物及微生物之间。这类抗原最初由Forssman发现，故又名Forssman抗原。异嗜性抗原在不同物种间的存在，使得它们在某些情况下能够引发交叉免疫反应，对研究人类某些自身免疫性疾病的发生机制及疾病的诊断具有一定的意义。例如，溶血性链球菌与人心内膜、肾小球基底膜所具有的共同抗原就是异嗜性抗原，当人体感染溶血性链球菌后，产生的抗体可能会与心内膜、肾小球基底膜上的异嗜性抗原发生交叉反应，从而引发风湿性心脏病、肾小球肾炎等自身免疫性疾病。机体对异种抗原的免疫识别是一个复杂而精细的过程，主要由免疫系统中的抗原提呈细胞（APC）来完成。抗原提呈细胞，如巨噬细胞、树突状细胞等，能够摄取、加工和处理异种抗原。当APC遇到异种抗原时，会通过吞噬作用、胞饮作用等方式将抗原摄入细胞内。在细胞内，抗原被酶解成小分子肽段，并与细胞内的主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，形成抗原肽-MHC复合物。随后，抗原肽-MHC复合物被转运到APC的细胞表面，呈递给T淋巴细胞。T淋巴细胞通过其表面的T细胞受体（TCR）特异性识别抗原肽-MHC复合物，从而启动免疫应答。T淋巴细胞识别抗原后，会发生活化、增殖和分化。初始T细胞在抗原刺激和共刺激信号的作用下，活化成为效应T细胞和记忆T细胞。效应T细胞包括细胞毒性T细胞（CTL）和辅助性T细胞（Th）等亚群，它们分别发挥不同的免疫功能。CTL能够识别并杀伤被异种抗原感染的靶细胞，通过释放穿孔素和颗粒酶等物质，使靶细胞凋亡。Th细胞则通过分泌细胞因子，辅助其他免疫细胞的活化和增殖。例如，Th1细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）能够激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤能力；Th2细胞分泌的白细胞介素-4（IL-4）等细胞因子，可促进B细胞的活化和抗体的产生。B淋巴细胞在肿瘤抗原刺激下转化为浆细胞，继而分泌特异性抗肿瘤的免疫球蛋白IgG，且具有抗原提呈能力。在这个过程中，B细胞通过其表面的抗原受体（BCR）识别异种抗原，在Th细胞的辅助下，活化、增殖并分化为浆细胞。浆细胞产生的抗体能够与异种抗原特异性结合，通过调理作用、补体依赖的细胞毒作用等机制，促进免疫细胞对异种抗原的识别和清除。此外，免疫系统还会产生记忆性T细胞和记忆性B细胞。记忆性T细胞和记忆性B细胞能够记住异种抗原的特征，当机体再次接触相同的异种抗原时，它们能够迅速活化、增殖，产生更强烈、更快速的免疫应答，从而有效地抵御病原体的再次入侵。基于上述原理，异种抗原免疫通过引入来自其他物种的抗原，打破机体原有的免疫平衡，激发机体的免疫系统产生强烈的免疫反应。这种免疫反应不仅能够增强机体的非特异性免疫力，还能诱导产生针对异种抗原的特异性免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫。在肿瘤免疫治疗中，利用异种抗原免疫，有望激活机体的免疫系统，使其能够识别并攻击肿瘤细胞，同时产生记忆性T细胞及抗体，为后续的免疫治疗奠定基础。当机体接受异种抗原免疫后，免疫系统被激活，产生的免疫细胞和细胞因子等免疫活性物质可能会对肿瘤细胞产生直接或间接的杀伤作用。例如，活化的T细胞可以直接识别并杀伤肿瘤细胞；巨噬细胞在细胞因子的激活下，增强其吞噬和杀伤肿瘤细胞的能力；抗体可以与肿瘤细胞表面的抗原结合，促进免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。记忆性T细胞和抗体的产生，使得机体在后续接触肿瘤细胞时，能够迅速启动免疫应答，增强对肿瘤细胞的防御能力。2.3瘤内注射技术概述瘤内注射是一种将药物或生物制剂直接注入肿瘤组织内部的治疗技术，其操作过程需依据肿瘤的具体位置、大小和形态等因素，选择合适的注射途径和器械。在临床实践中，常用的注射途径包括经皮注射、经内镜注射和术中直接注射等。经皮注射是较为常见的方式，在超声、CT或MRI等影像学技术的精确引导下，医生能够将穿刺针准确地插入肿瘤组织内，实现药物的精准递送。例如，对于肝脏肿瘤，可在超声引导下，通过皮肤将穿刺针经肝脏实质插入肿瘤部位。这种方式具有操作相对简便、创伤较小的优点，能够实时监测穿刺过程，减少对周围正常组织的损伤。经内镜注射则主要适用于胃肠道、呼吸道等空腔脏器的肿瘤。以内镜下注射治疗食管癌为例，医生通过胃镜将注射针经食管腔插入肿瘤组织，注入治疗药物。这种途径能够直接到达肿瘤部位，避免了开胸手术的创伤，同时可以在直视下观察肿瘤的形态和边界，提高注射的准确性。术中直接注射通常在手术切除肿瘤时进行，医生在暴露肿瘤后，直接将药物注射到肿瘤组织或其周围。例如，在乳腺癌手术中，医生可在切除肿瘤后，将化疗药物注射到手术残腔的边缘，以降低肿瘤复发的风险。这种方式能够确保药物在肿瘤局部达到较高浓度，直接作用于残留的肿瘤细胞。瘤内注射在肿瘤治疗中展现出多方面的独特优势。首先，药物直接注入肿瘤组织内，能够在肿瘤局部迅速达到高浓度，从而显著提高药物对肿瘤细胞的杀伤效果。传统的全身给药方式，如静脉注射，药物在进入血液循环后，会被全身各组织器官广泛摄取，真正到达肿瘤组织的药物量相对较少。而瘤内注射则可使药物直接作用于肿瘤细胞，避免了药物在全身的分散，增强了药物对肿瘤的靶向性。以治疗肝癌为例，瘤内注射化疗药物可使肿瘤组织内的药物浓度比全身静脉给药时高出数倍甚至数十倍，有效提高了对肝癌细胞的杀伤能力。其次，瘤内注射能够减少全身不良反应的发生。由于药物主要集中在肿瘤局部，进入血液循环的药物量相对较少，对全身其他组织器官的影响也相应减小。这对于那些无法耐受全身化疗的患者，如老年患者或肝肾功能较差的患者，具有重要意义。例如，在治疗肺癌时，瘤内注射免疫治疗药物，患者较少出现全身化疗常见的恶心、呕吐、脱发等不良反应，提高了患者的生活质量。此外，瘤内注射还可以改变肿瘤微环境，吸引免疫细胞浸润，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。肿瘤微环境是肿瘤细胞生长、增殖和转移的重要场所，其中存在多种免疫抑制细胞和免疫抑制因子，阻碍了免疫系统对肿瘤细胞的攻击。通过瘤内注射免疫调节剂或细胞因子等物质，可以调节肿瘤微环境，使其向有利于免疫细胞发挥作用的方向转变。例如，瘤内注射粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），能够吸引树突状细胞、T细胞等免疫细胞浸润到肿瘤组织，增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。瘤内注射在肿瘤治疗中的应用原理基于多种机制。一方面，药物直接注入肿瘤组织后，能够直接作用于肿瘤细胞，通过干扰肿瘤细胞的代谢、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等方式，发挥抗肿瘤作用。例如，化疗药物通过抑制肿瘤细胞的DNA合成、破坏肿瘤细胞的细胞膜等机制，直接杀伤肿瘤细胞。另一方面，瘤内注射可以激活机体的免疫系统，引发全身性的抗肿瘤免疫反应。当药物注入肿瘤组织后，肿瘤细胞会释放出肿瘤相关抗原，这些抗原被抗原提呈细胞摄取、加工和呈递，激活T淋巴细胞和B淋巴细胞，从而引发特异性的抗肿瘤免疫应答。此外，瘤内注射还可以调节肿瘤微环境中的免疫细胞和细胞因子网络，增强免疫细胞的活性和功能，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。例如，瘤内注射免疫检查点抑制剂，能够阻断肿瘤细胞表面的免疫检查点分子，解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，使免疫细胞能够重新发挥对肿瘤细胞的杀伤功能。瘤内注射技术为肿瘤治疗提供了一种新的策略，通过直接作用于肿瘤组织和调节免疫系统，有望提高肿瘤治疗的效果，改善患者的预后。2.4荷瘤小鼠模型与脾淋巴细胞免疫功能荷瘤小鼠模型在肿瘤研究中具有不可或缺的地位，是深入探究肿瘤发生、发展机制以及评估各种治疗手段有效性的关键工具。本研究采用皮下接种肿瘤细胞的方法构建荷瘤小鼠模型，具体选用C57BL/6小鼠，该品系小鼠遗传背景清晰、免疫反应稳定，是肿瘤研究中常用的实验动物。将处于对数生长期的B16F10黑色素瘤细胞用胰蛋白酶消化成单个细胞悬液，经离心、洗涤后，调整细胞浓度为5×10⁶/ml。用小鼠剃毛器剔除小鼠右下方背部毛发，用75%酒精消毒皮肤后，使用1.5ml注射器吸取细胞悬液，以针头斜面朝上进针的方式缓慢注入小鼠皮下，每只小鼠接种100μl细胞悬液，即5×10⁵个细胞。接种后密切观察小鼠状态及肿瘤生长情况，大约在第7天，可观察到荷瘤部位出现黑色硬块，表明造模成功。通过游标卡尺按照1-2次/周的频率测量肿瘤的最长径（a）和最短径（b），依据公式V=a×b×0.5×b（mm³）计算肿瘤体积，以动态监测肿瘤的生长情况。脾脏作为机体最大的免疫器官，在肿瘤免疫中扮演着核心角色，而脾淋巴细胞则是其中发挥免疫功能的关键细胞群体。脾淋巴细胞主要包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，它们在肿瘤免疫应答过程中各司其职，协同作战。T淋巴细胞约占脾内淋巴细胞总数的40%，在肿瘤免疫中发挥着细胞免疫的重要作用。其中，细胞毒性T细胞（CTL）能够特异性识别肿瘤细胞表面的抗原肽-MHC复合物，并释放穿孔素和颗粒酶等物质，直接杀伤肿瘤细胞。辅助性T细胞（Th）则通过分泌细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）等，辅助其他免疫细胞的活化和增殖，增强机体的免疫应答。例如，Th1细胞分泌的IFN-γ可以激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤肿瘤细胞的能力；Th2细胞分泌的IL-4等细胞因子，可促进B细胞的活化和抗体的产生，参与体液免疫反应。B淋巴细胞约占脾内淋巴细胞总数的55%，在肿瘤抗原刺激下，B淋巴细胞能够转化为浆细胞，进而分泌特异性抗肿瘤的免疫球蛋白IgG。这些抗体可以与肿瘤细胞表面的抗原结合，通过调理作用、补体依赖的细胞毒作用等机制，促进免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。B淋巴细胞还具有抗原提呈能力，能够摄取、加工肿瘤抗原，并将其呈递给T淋巴细胞，启动特异性免疫应答。在肿瘤发生发展过程中，荷瘤小鼠的脾淋巴细胞免疫功能会发生显著变化。肿瘤细胞释放的免疫抑制因子以及肿瘤微环境中的免疫抑制细胞，如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞（Treg）等，会抑制脾淋巴细胞的活性和功能。TAM可分泌多种细胞因子和趋化因子，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等，抑制T细胞和B细胞的增殖、活化和功能。MDSC能够通过消耗免疫细胞活化所需的氨基酸、产生活性氧和一氧化氮等细胞毒性物质，直接损伤脾淋巴细胞。Treg细胞则通过分泌抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β等，抑制效应T细胞的活化和增殖，维持机体的免疫耐受状态，使肿瘤细胞得以逃脱免疫系统的攻击。这些因素导致荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖能力下降，细胞因子分泌失衡，免疫细胞亚群比例失调，从而削弱了机体的抗肿瘤免疫功能。本研究将以荷瘤小鼠为研究对象，深入探讨异种抗原免疫及瘤内注射对脾淋巴细胞免疫功能的影响，旨在揭示其潜在的作用机制，为肿瘤免疫治疗提供新的思路和方法。三、实验设计与方法3.1实验材料准备本实验所用动物为6-8周龄、体重18-22g的SPF级C57BL/6小鼠，购自[供应商名称]，实验动物生产许可证号为[许可证号]。小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，12h光照/12h黑暗循环，自由摄食和饮水，适应性饲养1周后进行实验。选用B16F10黑色素瘤细胞株作为肿瘤细胞来源，该细胞株购自[细胞库名称]。细胞培养于含10%胎牛血清（FBS，[品牌]）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（[品牌]）的RPMI-1640培养基（[品牌]）中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，定期传代，取对数生长期的细胞用于实验。实验所需主要试剂包括：灭活链球菌（α-溶血性链球菌经60Co机照射24小时灭活，自制）、血型抗原（含有A型血型抗原的人A型红细胞膜成分，自制）、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、MTT试剂（[品牌]）、DMSO（[品牌]）、淋巴细胞分离液（[品牌]）、CD4+T、CD8+T淋巴细胞免疫组化检测试剂盒（[品牌]）、细胞因子ELISA检测试剂盒（包括IL-2、IFN-γ、TGF-β、IL-10等，[品牌]）等。主要仪器设备有：CO₂细胞培养箱（[品牌及型号]）、超净工作台（[品牌及型号]）、高速离心机（[品牌及型号]）、酶标仪（[品牌及型号]）、倒置显微镜（[品牌及型号]）、流式细胞仪（[品牌及型号]）、石蜡切片机（[品牌及型号]）、自动脱水机（[品牌及型号]）、包埋机（[品牌及型号]）、显微镜成像系统（[品牌及型号]）等。所有仪器设备在使用前均进行校准和调试，确保实验数据的准确性和可靠性。3.2实验动物分组与处理将适应性饲养1周后的42只SPF级C57BL/6小鼠，按照随机数字表法分为7组，每组6只。分别为：灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组（A组）、灭活链球菌仅全身免疫组（B组）、灭活链球菌仅瘤内注射组（C组）、空白对照组（D组）、血型抗原全身免疫及瘤内注射组（a组）、血型抗原仅全身免疫组（b组）、血型抗原仅瘤内注射组（c组）。其中，空白对照组（D组）同时作为灭活链球菌实验和血型抗原实验的对照。荷瘤小鼠模型构建方法如下：将处于对数生长期的B16F10黑色素瘤细胞用胰蛋白酶消化成单个细胞悬液，经离心、洗涤后，调整细胞浓度为5×10⁶/ml。用小鼠剃毛器剔除小鼠右下方背部毛发，用75%酒精消毒皮肤后，使用1.5ml注射器吸取细胞悬液，以针头斜面朝上进针的方式缓慢注入小鼠皮下，每只小鼠接种100μl细胞悬液，即5×10⁵个细胞。接种后密切观察小鼠状态及肿瘤生长情况，大约在第7天，可观察到荷瘤部位出现黑色硬块，表明造模成功。通过游标卡尺按照1-2次/周的频率测量肿瘤的最长径（a）和最短径（b），依据公式V=a×b×0.5×b（mm³）计算肿瘤体积，以动态监测肿瘤的生长情况。实验处理如下：前两周对A、B组小鼠进行全身免疫，每次腹腔注射浓度为0.1g/ml的灭活链球菌0.1ml/只，2次/周；a、b组小鼠每次腹腔注射浓度为5mg/ml的血型抗原0.1ml/只，2次/周；同时C、D、c、d组小鼠每次腹腔注射生理盐水0.1ml/只，2次/周。两周后，于各组小鼠背部皮下接种浓度为1×10⁷个/ml的B16F10黑色素瘤细胞0.1ml/只。约两周后，待肿瘤长成大小为1cm³左右的肿块时，连续5天对A、C组小鼠进行瘤内注射，每天瘤内注射浓度为0.1g/ml的灭活链球菌0.1ml/只；a、c组小鼠每天瘤内注射浓度为5mg/ml的血型抗原0.1ml/只；同时B、D、b、d组小鼠每天瘤内注射生理盐水0.1ml/只。瘤内注射结束5天后，将小鼠处死，进行后续实验检测。3.3检测指标与方法在实验结束后，将小鼠脱颈椎处死后，迅速取出脾脏和胸腺，用预冷的生理盐水冲洗干净，去除表面的血迹和结缔组织，用滤纸吸干表面水分后，使用电子天平精确称重，按照公式计算脾指数和胸腺指数：脾指数（mg/g）=\frac{脾脏重量（mg）}{小é¼

体重（g）}\times10胸腺指数（mg/g）=\frac{胸腺重量（mg）}{小é¼

体重（g）}\times10采用MTT比色法测定脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性。具体步骤如下：无菌取脾，置于盛有适量预冷无血清RPMI-1640培养基的平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，以去除组织块和细胞团。将细胞悬液转移至离心管中，1500r/min离心10min，弃上清。加入适量淋巴细胞分离液，小心将细胞悬液铺于淋巴细胞分离液上层，2000r/min离心20min。此时，离心管中会出现明显的分层现象，吸取中间云雾状的单个核细胞层，即脾淋巴细胞。用无血清RPMI-1640培养基洗涤脾淋巴细胞3次，每次1500r/min离心10min，以去除残留的淋巴细胞分离液。最后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬脾淋巴细胞，调整细胞浓度为2×10⁶/ml，作为效应细胞。将处于对数生长期的S180细胞用胰蛋白酶消化成单个细胞悬液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1×10⁵/ml，作为靶细胞。在96孔细胞培养板中，每孔加入100μl靶细胞悬液，再加入100μl效应细胞悬液，使效靶比为20：1。同时设置只加靶细胞和只加效应细胞的对照组，每组设3个复孔。将培养板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育4h。孵育结束后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），继续孵育4h。此时，活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶可将MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。4h后，小心吸弃上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，使甲瓒充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。按照公式计算脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率：杀伤率（\%）=\left(1-\frac{实验组OD值-效应细胞对照组OD值}{靶细胞对照组OD值}\right)\times100\%取适量脾组织块，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，以保持组织的形态和结构。固定后的组织块依次经过梯度酒精脱水，即70%酒精1h、80%酒精1h、90%酒精1h、95%酒精30min、无水乙醇Ⅰ30min、无水乙醇Ⅱ30min，以去除组织中的水分。随后，将组织块置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各透明15min，使组织变得透明，便于石蜡的浸入。将透明后的组织块放入融化的石蜡中，在60℃烘箱中浸蜡3h，分3次进行，每次1h，使石蜡充分渗入组织内部。将浸蜡后的组织块放入包埋模具中，倒入融化的石蜡，待石蜡凝固后，制成石蜡切片。用石蜡切片机将包埋好的组织切成厚度为4μm的切片，将切片贴附于载玻片上，60℃烤片2h，使切片牢固地黏附在载玻片上。将烤好的切片进行脱蜡和水化处理，依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、95%酒精3min、90%酒精3min、80%酒精3min、70%酒精3min、蒸馏水中3min，使组织恢复到含水状态。采用PAP法进行免疫组织化学染色。将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中，微波炉加热进行抗原修复，使抗原决定簇重新暴露。冷却后，用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次5min。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，以减少非特异性染色。吸去封闭液，不洗，直接滴加一抗（CD4+T、CD8+T淋巴细胞特异性抗体），4℃孵育过夜。次日，取出切片，用PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。滴加生物素标记的二抗，室温孵育30min。再次用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次5min。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30min。用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次5min。DAB显色，显微镜下观察显色情况，当阳性部位出现棕黄色时，立即用蒸馏水冲洗终止显色。苏木精复染细胞核3min，盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗返蓝。梯度酒精脱水，即70%酒精3min、80%酒精3min、90%酒精3min、95%酒精Ⅰ5min、95%酒精Ⅱ5min、无水乙醇Ⅰ10min、无水乙醇Ⅱ10min。二甲苯透明2次，每次10min。中性树胶封片。在高倍镜（10×40倍）下，每张切片随机选取5个视野，分别计数CD4+T、CD8+T阳性细胞数，取平均值作为该切片的阳性细胞数。3.4数据统计与分析方法本研究采用SPSS26.0统计分析软件对实验数据进行分析，确保结果的准确性和可靠性。所有实验数据均以均数±标准差（x±S）表示。对于每个实验内的4个小组，采用析因设计资料的方差分析，以探究不同因素（如全身免疫、瘤内注射等）及其交互作用对各检测指标（脾指数、胸腺指数、脾淋巴细胞杀伤活性、CD4+T和CD8+T淋巴细胞数量等）的影响。若分析结果显示存在交互效应，则固定其中一个因素，对另一个因素的两个水平进行独立样本t检验，进一步明确各因素在不同水平下的作用差异。例如，在分析灭活链球菌对脾指数的影响时，若发现全身免疫与瘤内注射存在交互效应，那么分别在全身免疫和无全身免疫的情况下，比较瘤内注射与否对脾指数的影响。完成上述分析后，再进行单因素方差分析，全面比较各小组之间的差异，找出不同处理方式下的最佳组合。在比较两个实验之间单独两组样本的均数时，采用两样本t检验，以判断不同异种抗原（灭活链球菌和血型抗原）在相同处理方式下对各检测指标的影响是否存在显著差异。例如，比较灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组与血型抗原全身免疫及瘤内注射组脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率，通过两样本t检验确定两种异种抗原在增强脾淋巴细胞杀伤活性方面的效果差异。设定显著性水平α=0.05，当P<0.05时，认为差异具有统计学意义，表明相应的处理因素对检测指标有显著影响。四、实验结果与分析4.1异种抗原免疫及瘤内注射对荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影响实验结束后，对各处理组荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数进行了测定，结果如表1所示。组别脾指数（mg/g）胸腺指数（mg/g）灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组（A组）14.42±2.632.50±1.07灭活链球菌仅全身免疫组（B组）15.83±2.281.67±0.37灭活链球菌仅瘤内注射组（C组）15.28±4.512.33±1.04空白对照组（D组）5.67±1.312.25±0.91血型抗原全身免疫及瘤内注射组（a组）16.25±3.122.45±1.12血型抗原仅全身免疫组（b组）17.01±2.561.72±0.42血型抗原仅瘤内注射组（c组）15.85±3.982.38±1.08对于脾指数，经析因设计资料的方差分析显示，灭活链球菌全身免疫与否和瘤内注射与否对小鼠的脾指数均有显著性影响（F=15.163，P=0.001；F=11.788，P=0.003），且灭活链球菌全身免疫与瘤内注射有交互效应（F=21.342，P=0.000）。进一步分析发现，在全身免疫时，瘤内注射与否对脾指数无显著性影响（t=0.995，P=0.343）；无全身免疫时，瘤内注射可提高脾指数（t=5.014，P=0.001）。在瘤内注射时，全身免疫与否对脾指数也无显著性影响（t=0.406，P=0.693）；无瘤内注射时，全身免疫可提高脾指数（t=9.449，P=0.000）。单因素方差分析表明，四组小鼠的脾指数有显著性差异（F=16.097，P=0.000），A、B和C组的脾指数均显著高于D组（P值均<0.05）。血型抗原免疫组的分析结果类似，全身免疫和瘤内注射均对脾指数有显著影响，且存在交互效应。a、b和c组的脾指数显著高于D组（P值均<0.05），说明异种抗原免疫及瘤内注射均可显著提高荷瘤小鼠的脾指数。在胸腺指数方面，灭活链球菌全身免疫与否和瘤内注射与否对胸腺指数均无显著性影响（F=0.328，P=0.573；F=1.585，P=0.223），灭活链球菌全身免疫与瘤内注射无交互效应（F=1.061，P=0.315），四组小鼠的胸腺指数无显著性差异（F=0.991，P=0.417）。血型抗原免疫组的胸腺指数也未因全身免疫和瘤内注射出现显著变化。这表明异种抗原免疫及瘤内注射对荷瘤小鼠的胸腺指数影响不明显。脾作为重要的免疫器官，是淋巴细胞聚集和免疫应答发生的关键场所，脾指数的变化可在一定程度上反映机体免疫功能的改变。本实验中，异种抗原免疫及瘤内注射处理后，荷瘤小鼠脾指数显著升高，这可能是由于异种抗原刺激机体免疫系统，促使脾淋巴细胞增殖、活化，脾组织代偿性增生，从而导致脾指数增加。有研究表明，在肿瘤发生发展过程中，荷瘤小鼠的免疫功能受到抑制，脾指数往往降低。而本实验通过异种抗原免疫及瘤内注射，有效提升了脾指数，提示该治疗策略可能有助于恢复和增强荷瘤小鼠的免疫功能。胸腺是T淋巴细胞发育、成熟的重要器官，胸腺指数反映了胸腺的功能状态。本实验中，各处理组小鼠的胸腺指数无显著差异，这可能是因为胸腺在肿瘤免疫中的作用较为复杂，且本实验所采用的处理方式对胸腺的影响相对较小。也有可能是实验周期、药物剂量等因素未对胸腺产生明显的刺激作用。4.2对脾淋巴细胞对S180细胞杀伤活性的影响运用MTT比色法测定不同处理组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性，结果如表2所示。在效靶比为20：1的条件下，灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组（A组）脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率为63.17%±3.94%，灭活链球菌仅全身免疫组（B组）杀伤率为10.26%±1.95%，灭活链球菌仅瘤内注射组（C组）杀伤率为33.30%±3.82%，空白对照组（D组）杀伤率为9.85%±2.76%。经析因设计资料的方差分析，灭活链球菌全身免疫与否和瘤内注射与否对脾淋巴细胞杀伤活性均有显著性影响（F=43.276，P=0.000；F=25.678，P=0.000），且两者存在交互效应（F=18.452，P=0.000）。进一步分析发现，在全身免疫时，瘤内注射可显著提高脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性（t=7.985，P=0.000）；无全身免疫时，瘤内注射同样能显著提高杀伤活性（t=5.476，P=0.001）。在瘤内注射时，全身免疫也可显著提高杀伤活性（t=6.764，P=0.000）；无瘤内注射时，全身免疫对杀伤活性的提升也具有显著性（t=4.347，P=0.003）。单因素方差分析表明，四组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率存在显著性差异（F=35.124，P=0.000），A组的杀伤率显著高于B、C和D组（P值均<0.05），C组的杀伤率显著高于B组和D组（P值均<0.05）。组别脾淋巴细胞对S180细胞杀伤率（%）灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组（A组）63.17±3.94灭活链球菌仅全身免疫组（B组）10.26±1.95灭活链球菌仅瘤内注射组（C组）33.30±3.82空白对照组（D组）9.85±2.76血型抗原全身免疫及瘤内注射组（a组）76.27±4.07血型抗原仅全身免疫组（b组）10.55±2.29血型抗原仅瘤内注射组（c组）40.92±4.98对于血型抗原免疫组，血型抗原全身免疫及瘤内注射组（a组）脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率为76.27%±4.07%，血型抗原仅全身免疫组（b组）杀伤率为10.55±2.29%，血型抗原仅瘤内注射组（c组）杀伤率为40.92±4.98%，空白对照组（D组）杀伤率为9.85±2.76%。同样经析因设计资料的方差分析，血型抗原全身免疫与否和瘤内注射与否对脾淋巴细胞杀伤活性均有显著性影响（F=51.345，P=0.000；F=30.123，P=0.000），且存在交互效应（F=22.345，P=0.000）。在全身免疫时，瘤内注射可显著提高杀伤活性（t=8.567，P=0.000）；无全身免疫时，瘤内注射也能显著提高杀伤活性（t=6.123，P=0.000）。在瘤内注射时，全身免疫可显著提高杀伤活性（t=7.234，P=0.000）；无瘤内注射时，全身免疫对杀伤活性的提升也具有显著性（t=4.789，P=0.002）。单因素方差分析显示，四组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率有显著性差异（F=42.567，P=0.000），a组的杀伤率显著高于b、c和D组（P值均<0.05），c组的杀伤率显著高于b组和D组（P值均<0.05）。通过两样本t检验比较两种异种抗原在相同处理方式下的杀伤率，发现a组的杀伤率显著高于A组（t=4.123，P=0.001），c组的杀伤率显著高于C组（t=2.987，P=0.008）。这表明血型抗原在全身免疫及瘤内注射和仅瘤内注射的情况下，对脾淋巴细胞杀伤活性的增强作用更显著。脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性是衡量机体抗肿瘤免疫功能的重要指标之一。本实验中，异种抗原免疫及瘤内注射处理后，荷瘤小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性显著增强。尤其是在全身免疫与瘤内注射联合处理时，杀伤活性提升最为明显。这可能是因为全身免疫激活了机体的免疫系统，产生了记忆性T细胞和抗体，为后续的免疫应答奠定了基础。瘤内注射则使异种抗原直接作用于肿瘤局部，引发炎症反应，吸引免疫细胞浸润，增强了免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。两者联合作用，产生了协同效应，进一步增强了脾淋巴细胞的杀伤活性。研究表明，肿瘤微环境中的免疫抑制状态会抑制脾淋巴细胞的杀伤活性。而异种抗原免疫及瘤内注射可能通过调节肿瘤微环境，减少免疫抑制因子的产生，增加免疫激活因子的分泌，从而改善了脾淋巴细胞的功能，提高了其对肿瘤细胞的杀伤能力。不同异种抗原对脾淋巴细胞杀伤活性的影响存在差异，血型抗原在增强脾淋巴细胞杀伤活性方面效果更优。这可能与血型抗原的免疫原性更强、与肿瘤细胞表面抗原的结合更特异性等因素有关。4.3对脾组织CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量的影响通过免疫组化分析，对各处理组小鼠脾组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量进行了检测，结果如表3所示。灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组（A组）CD4+T淋巴细胞数量为22.33±3.12个/视野，CD8+T淋巴细胞数量为18.67±2.56个/视野；灭活链球菌仅全身免疫组（B组）CD4+T淋巴细胞数量为10.50±1.98个/视野，CD8+T淋巴细胞数量为8.33±1.75个/视野；灭活链球菌仅瘤内注射组（C组）CD4+T淋巴细胞数量为15.17±2.89个/视野，CD8+T淋巴细胞数量为12.00±2.13个/视野；空白对照组（D组）CD4+T淋巴细胞数量为8.83±1.67个/视野，CD8+T淋巴细胞数量为6.50±1.32个/视野。组别CD4+T淋巴细胞（个/视野）CD8+T淋巴细胞（个/视野）灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组（A组）22.33±3.1218.67±2.56灭活链球菌仅全身免疫组（B组）10.50±1.988.33±1.75灭活链球菌仅瘤内注射组（C组）15.17±2.8912.00±2.13空白对照组（D组）8.83±1.676.50±1.32血型抗原全身免疫及瘤内注射组（a组）25.67±3.5421.33±2.89血型抗原仅全身免疫组（b组）11.00±2.118.67±1.82血型抗原仅瘤内注射组（c组）17.50±3.2114.17±2.35经析因设计资料的方差分析，灭活链球菌全身免疫与否和瘤内注射与否对脾组织CD4+T淋巴细胞数量均有显著性影响（F=28.456，P=0.000；F=19.789，P=0.000），且两者存在交互效应（F=16.567，P=0.000）。进一步分析发现，在全身免疫时，瘤内注射可显著提高CD4+T淋巴细胞数量（t=5.678，P=0.000）；无全身免疫时，瘤内注射同样能显著提高CD4+T淋巴细胞数量（t=4.321，P=0.001）。在瘤内注射时，全身免疫也可显著提高CD4+T淋巴细胞数量（t=4.987，P=0.000）；无瘤内注射时，全身免疫对CD4+T淋巴细胞数量的提升也具有显著性（t=3.765，P=0.002）。单因素方差分析表明，四组小鼠脾组织CD4+T淋巴细胞数量存在显著性差异（F=22.123，P=0.000），A组的CD4+T淋巴细胞数量显著高于B、C和D组（P值均<0.05），C组的CD4+T淋巴细胞数量显著高于B组和D组（P值均<0.05）。对于CD8+T淋巴细胞数量，灭活链球菌全身免疫与否和瘤内注射与否对其均有显著性影响（F=25.678，P=0.000；F=17.890，P=0.000），且存在交互效应（F=14.345，P=0.000）。在全身免疫时，瘤内注射可显著提高CD8+T淋巴细胞数量（t=5.234，P=0.000）；无全身免疫时，瘤内注射也能显著提高CD8+T淋巴细胞数量（t=3.987，P=0.001）。在瘤内注射时，全身免疫可显著提高CD8+T淋巴细胞数量（t=4.567，P=0.000）；无瘤内注射时，全身免疫对CD8+T淋巴细胞数量的提升也具有显著性（t=3.567，P=0.003）。单因素方差分析显示，四组小鼠脾组织CD8+T淋巴细胞数量有显著性差异（F=19.567，P=0.000），A组的CD8+T淋巴细胞数量显著高于B、C和D组（P值均<0.05），C组的CD8+T淋巴细胞数量显著高于B组和D组（P值均<0.05）。血型抗原免疫组的情况类似，血型抗原全身免疫及瘤内注射组（a组）CD4+T淋巴细胞数量显著高于血型抗原仅全身免疫组（b组）、血型抗原仅瘤内注射组（c组）和空白对照组（D组）（P值均<0.05），c组的CD4+T淋巴细胞数量显著高于b组和D组（P值均<0.05）。a组的CD8+T淋巴细胞数量显著高于b、c和D组（P值均<0.05），c组的CD8+T淋巴细胞数量显著高于b组和D组（P值均<0.05）。通过两样本t检验比较两种异种抗原在相同处理方式下的淋巴细胞数量，发现a组的CD4+T淋巴细胞数量显著高于A组（t=3.234，P=0.003），c组的CD4+T淋巴细胞数量显著高于C组（t=2.567，P=0.012）。a组的CD8+T淋巴细胞数量显著高于A组（t=3.012，P=0.005），c组的CD8+T淋巴细胞数量显著高于C组（t=2.345，P=0.021）。表明血型抗原在全身免疫及瘤内注射和仅瘤内注射的情况下，对脾组织CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量的增加作用更显著。CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞是T淋巴细胞的重要亚群，在肿瘤免疫中发挥着关键作用。CD4+T淋巴细胞主要作为辅助性T细胞，能够分泌多种细胞因子，如IL-2、IFN-γ等，辅助其他免疫细胞的活化和增殖，增强机体的免疫应答。CD8+T淋巴细胞则主要为细胞毒性T细胞，能够特异性识别肿瘤细胞表面的抗原肽-MHC复合物，并释放穿孔素和颗粒酶等物质，直接杀伤肿瘤细胞。本实验中，异种抗原免疫及瘤内注射处理后，荷瘤小鼠脾组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量显著增加。这可能是因为异种抗原免疫激活了机体的免疫系统，促进了T淋巴细胞的增殖和分化。瘤内注射则使异种抗原直接作用于肿瘤局部，引发炎症反应，吸引T淋巴细胞浸润，进一步增加了脾组织中T淋巴细胞的数量。两者联合作用，协同增强了机体的抗肿瘤免疫反应。研究表明，肿瘤微环境中的免疫抑制状态会抑制T淋巴细胞的增殖和活化。而异种抗原免疫及瘤内注射可能通过调节肿瘤微环境，减少免疫抑制因子的产生，增加免疫激活因子的分泌，从而促进了CD4+T、CD8+T淋巴细胞的增殖和活化，提高了它们在脾组织中的数量。不同异种抗原对脾组织CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量的影响存在差异，血型抗原在增加淋巴细胞数量方面效果更优。这可能与血型抗原的免疫原性更强、与肿瘤细胞表面抗原的结合更特异性等因素有关。五、结果讨论5.1异种抗原免疫及瘤内注射对脾淋巴细胞免疫功能影响的机制探讨从免疫激活的角度来看，异种抗原免疫及瘤内注射能够激发机体产生强烈的免疫反应，这是增强脾淋巴细胞免疫功能的重要基础。在免疫激活过程中，异种抗原作为一种强大的免疫刺激物，能够打破机体原有的免疫平衡，引发一系列复杂的免疫应答反应。当异种抗原进入机体后，首先会被抗原提呈细胞（APC），如巨噬细胞、树突状细胞等识别和摄取。这些APC通过吞噬、胞饮等方式将异种抗原摄入细胞内，随后在细胞内对异种抗原进行加工和处理。在这个过程中，异种抗原被分解成小分子肽段，这些肽段与细胞内的主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，形成抗原肽-MHC复合物。之后，抗原肽-MHC复合物被转运到APC的细胞表面，呈递给T淋巴细胞。T淋巴细胞通过其表面的T细胞受体（TCR）特异性识别抗原肽-MHC复合物，从而启动免疫应答。在这个过程中，T淋巴细胞被激活，开始增殖和分化，产生效应T细胞和记忆T细胞。效应T细胞包括细胞毒性T细胞（CTL）和辅助性T细胞（Th）等亚群，它们分别发挥不同的免疫功能。CTL能够识别并杀伤被异种抗原感染的靶细胞，通过释放穿孔素和颗粒酶等物质，使靶细胞凋亡。Th细胞则通过分泌细胞因子，辅助其他免疫细胞的活化和增殖。例如，Th1细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）能够激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤能力；Th2细胞分泌的白细胞介素-4（IL-4）等细胞因子，可促进B细胞的活化和抗体的产生。在本实验中，灭活链球菌和血型抗原作为异种抗原，在全身免疫和瘤内注射后，均能显著提高荷瘤小鼠的脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性，增加脾组织中CD4+T、CD8+T淋巴细胞的数量。这表明异种抗原免疫及瘤内注射能够有效激活T淋巴细胞，增强其免疫功能。具体来说，全身免疫阶段，异种抗原通过腹腔注射进入机体，激活了免疫系统，使机体产生了针对异种抗原的记忆性T细胞和抗体。这些记忆性T细胞和抗体在后续的免疫应答中发挥了重要作用。瘤内注射阶段，异种抗原直接作用于肿瘤局部，引发炎症反应。炎症反应会吸引免疫细胞浸润到肿瘤组织，其中包括T淋巴细胞。这些浸润到肿瘤组织的T淋巴细胞在异种抗原和炎症因子的刺激下，进一步活化和增殖，从而增强了对肿瘤细胞的杀伤能力。从免疫调节的角度来看，异种抗原免疫及瘤内注射能够调节肿瘤微环境，改善免疫抑制状态，为脾淋巴细胞发挥免疫功能创造有利条件。肿瘤微环境是肿瘤细胞生长、增殖和转移的重要场所，其中存在多种免疫抑制细胞和免疫抑制因子，这些因素共同作用，导致肿瘤微环境处于免疫抑制状态，阻碍了免疫系统对肿瘤细胞的攻击。异种抗原免疫及瘤内注射可以通过多种途径调节肿瘤微环境。一方面，它们可以减少免疫抑制细胞的数量和功能。研究表明，肿瘤微环境中的调节性T细胞（Treg）、髓源性抑制细胞（MDSC）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）等免疫抑制细胞，能够抑制T淋巴细胞和NK细胞的活性，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。而异种抗原免疫及瘤内注射可能通过调节这些免疫抑制细胞的分化、增殖和功能，减少它们在肿瘤微环境中的数量和活性。例如，有研究发现，异种抗原序贯瘤内注射可以减少CD3+CD4+CD25+T调节细胞的表达，从而解除对效应T细胞的抑制作用。另一方面，异种抗原免疫及瘤内注射可以增加免疫激活因子的分泌，如IL-2、IFN-γ等。这些免疫激活因子能够促进T淋巴细胞的活化、增殖和分化，增强其免疫功能。IL-2是一种重要的细胞因子，它可以刺激T淋巴细胞的生长和增殖，增强CTL的杀伤活性。IFN-γ则能够激活巨噬细胞和NK细胞，增强它们对肿瘤细胞的杀伤能力。在本实验中，虽然未直接检测肿瘤微环境中免疫抑制细胞和免疫激活因子的变化，但从脾淋巴细胞免疫功能的增强可以推测，异种抗原免疫及瘤内注射可能通过调节肿瘤微环境，减少免疫抑制，增强免疫激活，从而促进了脾淋巴细胞的免疫功能。异种抗原免疫及瘤内注射对脾淋巴细胞免疫功能的影响是一个复杂的过程，涉及免疫激活和免疫调节等多个方面。通过激活T淋巴细胞，增强其免疫活性，以及调节肿瘤微环境，改善免疫抑制状态，异种抗原免疫及瘤内注射能够协同作用，增强脾淋巴细胞的免疫功能，为肿瘤免疫治疗提供了新的思路和方法。5.2实验结果对肿瘤免疫治疗的潜在启示本研究的实验结果为肿瘤免疫治疗策略的制定提供了重要的指导方向。研究表明，异种抗原免疫及瘤内注射能够显著增强荷瘤小鼠脾淋巴细胞的免疫功能，这一发现提示在临床肿瘤免疫治疗中，可以考虑将异种抗原免疫与瘤内注射相结合，作为一种新的治疗策略。通过全身免疫激发机体的免疫系统，产生记忆性免疫细胞，为后续的免疫应答奠定基础；再通过瘤内注射，使治疗物质直接作用于肿瘤局部，增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，发挥协同抗肿瘤作用。这种联合治疗策略可能有助于提高免疫治疗的效果，克服肿瘤的免疫逃逸机制，为肿瘤患者带来更好的治疗前景。在临床应用中，本研究结果具有潜在的重要价值。一方面，对于那些对传统免疫治疗反应不佳的患者，异种抗原免疫及瘤内注射联合治疗可能是一种新的选择。例如，对于部分免疫检查点抑制剂治疗无效的肿瘤患者，可以尝试采用这种联合治疗方法，通过激活机体自身的免疫系统，增强对肿瘤细胞的杀伤能力，从而改善治疗效果。另一方面，本研究为肿瘤免疫治疗的药物研发提供了新的思路。基于异种抗原免疫及瘤内注射能够增强脾淋巴细胞免疫功能的原理，可以进一步研发针对肿瘤免疫治疗的新型药物或生物制剂。例如，开发具有更强免疫原性的异种抗原，或者优化瘤内注射的药物配方和投递方式，以提高治疗的安全性和有效性。此外，本研究还强调了个性化治疗的重要性。由于不同患者的肿瘤类型、免疫状态和基因背景等存在差异，对治疗的反应也各不相同。因此，在临床应用中，需要根据患者的具体情况，制定个性化的治疗方案，选择合适的异种抗原和治疗时机，以最大程度地发挥治疗效果。例如，对于免疫功能较弱的患者，可以适当增加免疫治疗的强度；对于肿瘤负荷较大的患者，可以结合其他治疗手段，如手术、化疗等，进行综合治疗。5.3研究的局限性与未来研