异种抗原瘤内注射对荷瘤小鼠S180肉瘤的抗肿瘤效应及机制探究

异种抗原瘤内注射对荷瘤小鼠S180肉瘤的抗肿瘤效应及机制探究一、引言1.1研究背景与意义肿瘤，作为一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已成为全球公共卫生领域的重大挑战。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，全球新发癌症病例1929万例，癌症死亡病例996万例。在中国，癌症同样是导致居民死亡的主要原因之一，严重影响着人们的生活质量和寿命。目前，肿瘤的治疗手段主要包括手术、化疗、放疗、生物治疗和靶向治疗等。手术治疗对于早期肿瘤患者往往具有较好的疗效，但对于中晚期肿瘤患者，由于肿瘤的扩散和转移，手术切除往往难以彻底清除肿瘤细胞，且手术创伤较大，对患者身体机能影响较大。化疗和放疗虽然能够在一定程度上抑制肿瘤细胞的生长和扩散，但它们在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞造成损伤，导致患者出现一系列严重的不良反应，如恶心、呕吐、脱发、免疫力下降等，这不仅降低了患者的生活质量，也限制了治疗的持续进行。生物治疗和靶向治疗作为新兴的肿瘤治疗方法，具有特异性强、副作用相对较小等优点，但它们也面临着肿瘤细胞耐药性、治疗成本高昂等问题。因此，寻找一种更加安全、有效的肿瘤治疗方法，成为了当前肿瘤研究领域的迫切需求。在肿瘤研究中，动物模型是不可或缺的工具，其中S180肉瘤模型在抗肿瘤研究中占据着重要地位。S180肉瘤是一种源自小鼠的肉瘤细胞系，具有生长迅速、易移植、可在小鼠体内形成实体瘤等特点。将S180肉瘤细胞接种到小鼠体内，能够快速建立荷瘤小鼠模型，模拟人类肿瘤的生长和发展过程，为研究肿瘤的发病机制、筛选和评价抗肿瘤药物及治疗方法提供了良好的实验平台。许多抗肿瘤药物和治疗方法的初步研究都是在S180肉瘤模型上进行的，通过观察药物或治疗方法对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用、对小鼠生存时间和生存质量的影响等指标，来评估其抗肿瘤效果，为进一步的临床研究奠定基础。近年来，随着免疫学和肿瘤学的不断发展，肿瘤免疫治疗成为了肿瘤治疗领域的研究热点。其中，异种抗原瘤内注射作为一种新兴的肿瘤免疫治疗策略，逐渐受到了广泛关注。异种抗原是指来自不同种属生物的抗原物质，其具有较强的免疫原性，能够激发机体产生强烈的免疫反应。将异种抗原直接注射到肿瘤组织内，能够在肿瘤局部引发免疫清除反应，打破肿瘤微环境的免疫抑制状态，激活机体的免疫系统，使其识别和杀伤肿瘤细胞。具体来说，异种抗原瘤内注射后，一方面，作为人工靶点，吸引抗体及招募免疫细胞在肿瘤局部大量聚集；另一方面，肿瘤局部的免疫反应产生大量的细胞因子及趋化因子，制造出炎症环境，促进免疫效应细胞的成熟及活化，最终实现将机体针对异种抗原的排斥反应转化为对肿瘤的免疫应答。这种治疗方法具有独特的优势，它能够直接针对肿瘤局部进行治疗，提高肿瘤局部的免疫反应强度，同时减少对全身免疫系统的过度刺激，降低不良反应的发生风险。然而，目前关于异种抗原瘤内注射治疗肿瘤的研究仍处于探索阶段，其作用机制尚未完全明确，治疗效果也存在一定的差异。不同类型的异种抗原、不同的注射方式和剂量、不同的肿瘤模型等因素，都可能对治疗效果产生影响。因此，深入研究异种抗原瘤内注射对荷瘤小鼠S180肉瘤的抗肿瘤作用及其机制，具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究旨在通过建立荷瘤小鼠S180肉瘤模型，探讨异种抗原瘤内注射对肿瘤生长的抑制作用、对肿瘤微环境的影响以及可能的作用机制，为肿瘤的免疫治疗提供新的思路和实验依据，有望为临床肿瘤治疗提供更有效的治疗策略，改善肿瘤患者的预后和生活质量。1.2国内外研究现状肿瘤免疫治疗领域中，异种抗原瘤内注射作为一种新兴治疗策略，近年来在国内外均受到广泛关注，相关研究不断深入，取得了一系列成果，但仍存在诸多问题有待解决。国外对异种抗原瘤内注射治疗肿瘤的研究起步较早，在作用机制和动物实验方面进行了大量探索。一些研究表明，异种抗原瘤内注射可通过激活机体免疫系统来对抗肿瘤。如将异种蛋白抗原注射到小鼠肿瘤模型内，能够诱导肿瘤局部产生强烈的炎症反应，吸引大量免疫细胞浸润，包括T细胞、NK细胞等。这些免疫细胞被激活后，可直接杀伤肿瘤细胞，或通过释放细胞因子间接抑制肿瘤生长。在黑色素瘤小鼠模型中，瘤内注射异种病毒抗原，可使肿瘤组织内的CD8+T细胞数量显著增加，增强对肿瘤细胞的杀伤能力，抑制肿瘤生长。通过基因工程技术改造的异种抗原，能更有效地激活特定的免疫细胞亚群，提高免疫治疗效果。国内研究也在积极跟进，部分研究聚焦于寻找更有效的异种抗原及优化治疗方案。有学者尝试使用灭活的细菌作为异种抗原，如链球菌培养基灭活物。研究发现，其不仅能增强机体的非特异性免疫力，还能在瘤内注射后引发免疫清除反应。将灭活含链球菌培养基进行瘤内注射，可使荷瘤小鼠肿瘤微环境中效应细胞数量增加，细胞因子浓度升高，同时减少调节性T细胞的表达，从而显著抑制肿瘤生长。国内也有对不同注射模式的研究，探索多次注射、联合其他治疗手段等方式对治疗效果的影响。尽管国内外在异种抗原瘤内注射治疗肿瘤研究上取得一定进展，但仍存在明显不足。一方面，作用机制尚未完全明确。虽然知道能激活免疫系统，但具体激活哪些免疫细胞亚群、各细胞间如何相互作用、免疫信号通路如何传导等细节，仍有待深入研究。另一方面，临床转化面临挑战。目前多数研究停留在动物实验阶段，从动物实验到人体临床试验，还需解决剂量选择、安全性评估、个体差异等诸多问题。不同肿瘤类型对异种抗原瘤内注射的敏感性差异较大，如何筛选出最适合该治疗方法的肿瘤患者，也是亟待解决的问题。1.3研究目的与内容本研究旨在以荷瘤小鼠S180肉瘤为模型，深入探究异种抗原瘤内注射的抗肿瘤作用、机制及安全性，为肿瘤免疫治疗提供新思路与实验依据，具体内容如下：评估异种抗原瘤内注射对荷瘤小鼠S180肉瘤的抗肿瘤效果：通过建立荷瘤小鼠S180肉瘤模型，设置不同的实验组，将异种抗原瘤内注射到小鼠体内，同时设立对照组。定期测量各组小鼠肿瘤的体积、重量等指标，绘制肿瘤生长曲线，以此直观地观察肿瘤的生长趋势。通过计算抑瘤率，精确评估异种抗原瘤内注射对肿瘤生长的抑制作用，明确该治疗方法在抑制肿瘤生长方面的有效性。探讨异种抗原瘤内注射的抗肿瘤作用机制：从肿瘤微环境、免疫细胞活化等角度出发，运用免疫组化、流式细胞术等技术，检测肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况，如T细胞、NK细胞、巨噬细胞等，了解它们在肿瘤局部的数量变化和功能状态。检测细胞因子、趋化因子的表达水平，分析它们在激活免疫细胞、调节免疫反应中的作用，明确肿瘤微环境中免疫调节的具体机制。研究免疫细胞表面分子的表达变化，探究免疫细胞之间的相互作用方式，揭示免疫细胞在抗肿瘤免疫反应中的协同机制。评价异种抗原瘤内注射的安全性：在实验过程中，密切观察荷瘤小鼠的一般状况，包括精神状态、饮食情况、体重变化等，及时发现可能出现的异常症状。定期对小鼠进行血常规、肝肾功能等指标的检测，评估该治疗方法对小鼠全身生理机能的影响。通过组织病理学检查，观察重要脏器如心、肝、脾、肺、肾等的形态和结构变化，判断是否存在组织损伤或炎症反应，全面评估异种抗原瘤内注射的安全性。二、相关理论基础2.1肿瘤微环境理论肿瘤微环境（TumorMicroenvironment，TME）是肿瘤细胞生长、增殖和转移的重要基础，对肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程起着关键作用。肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，主要由肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、细胞外基质以及多种细胞因子、趋化因子和代谢产物等组成。肿瘤细胞作为肿瘤微环境的核心成分，具有异常的增殖、分化和代谢能力，它们通过分泌各种信号分子，对微环境中的其他细胞和成分产生深远影响。免疫细胞在肿瘤微环境中种类繁多，包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞和髓源性抑制细胞等，它们在肿瘤免疫监视和免疫逃逸过程中扮演着不同的角色。成纤维细胞能够合成和分泌细胞外基质成分，调节细胞外基质的结构和功能，为肿瘤细胞提供物理支持和生存环境。血管内皮细胞则参与肿瘤血管的生成，为肿瘤细胞提供营养物质和氧气，同时也为肿瘤细胞的转移提供了途径。肿瘤微环境对肿瘤免疫存在着显著的抑制作用，这也是肿瘤能够逃避机体免疫系统监视和攻击的重要原因之一。肿瘤细胞通过多种机制诱导免疫抑制，例如，肿瘤细胞表面表达的程序性死亡配体1（PD-L1）等免疫检查点分子，能够与T细胞表面的程序性死亡受体1（PD-1）结合，抑制T细胞的活化和增殖，使其无法有效地杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞还能分泌转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-10（IL-10）等免疫抑制性细胞因子，这些细胞因子可以抑制免疫细胞的活性，促进免疫抑制细胞的分化和增殖。在肿瘤微环境中，髓源性抑制细胞和调节性T细胞数量增加，它们能够抑制T细胞、NK细胞等免疫细胞的功能，削弱机体的抗肿瘤免疫反应。肿瘤相关巨噬细胞向具有免疫抑制功能的M2型极化，也会促进肿瘤的生长和转移。解除肿瘤微环境的免疫抑制状态，是肿瘤治疗的关键环节之一。只有打破肿瘤微环境的免疫抑制，才能激活机体的免疫系统，使其有效地识别和杀伤肿瘤细胞。目前，针对肿瘤微环境免疫抑制的治疗策略主要包括免疫检查点阻断疗法、过继性细胞免疫治疗、肿瘤疫苗和细胞因子治疗等。免疫检查点阻断疗法通过使用抗PD-1、抗PD-L1或抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）等抗体，阻断免疫检查点分子的作用，解除对T细胞的抑制，从而增强机体的抗肿瘤免疫反应。过继性细胞免疫治疗是将体外扩增和激活的免疫细胞（如T细胞、NK细胞等）回输到患者体内，使其直接杀伤肿瘤细胞。肿瘤疫苗则是通过激发机体的免疫系统，使其产生针对肿瘤抗原的特异性免疫应答。细胞因子治疗是利用细胞因子的免疫调节作用，激活免疫细胞，增强机体的抗肿瘤免疫能力。然而，这些治疗方法在临床应用中仍存在一些问题，如部分患者对治疗不敏感、治疗后容易复发等。因此，深入研究肿瘤微环境的免疫抑制机制，开发更加有效的治疗策略，具有重要的理论和实际意义。2.2免疫应答原理免疫应答是机体免疫系统对抗原刺激所产生的一系列复杂反应，是机体识别和清除抗原性异物、维持自身内环境稳定的重要生理过程。这一过程涉及多种免疫细胞和免疫分子的相互作用，可分为固有免疫应答和适应性免疫应答两个类型，它们相互协作，共同发挥免疫防御、免疫监视和免疫自稳的功能。固有免疫应答又称非特异性免疫应答，是机体在种系发育和进化过程中逐渐建立起来的天然免疫防御功能，是机体抵御病原体入侵的第一道防线。其主要由皮肤和黏膜的物理屏障、吞噬细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞等）、自然杀伤细胞（NK细胞）、补体系统以及细胞因子等组成。当病原体入侵机体时，固有免疫细胞能够迅速识别病原体表面的病原体相关分子模式（PAMP），如细菌的脂多糖、病毒的双链RNA等，通过模式识别受体（PRR）与之结合，从而激活固有免疫应答。巨噬细胞通过吞噬作用摄取和消化病原体，同时分泌细胞因子如白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，引发炎症反应，吸引更多的免疫细胞聚集到感染部位，增强免疫防御。NK细胞则能够直接杀伤被病原体感染的细胞或肿瘤细胞，无需预先接触抗原，其杀伤活性不受MHC限制。固有免疫应答在感染早期迅速发挥作用，为机体争取时间启动适应性免疫应答。适应性免疫应答又称特异性免疫应答，是机体在接触特定抗原后，由T淋巴细胞和B淋巴细胞介导产生的针对该抗原的特异性免疫反应。它具有特异性、记忆性和耐受性等特点。适应性免疫应答可分为细胞免疫应答和体液免疫应答。在细胞免疫应答中，T淋巴细胞起着关键作用。当T淋巴细胞表面的T细胞受体（TCR）识别抗原提呈细胞（如树突状细胞、巨噬细胞等）提呈的抗原肽-MHC复合物后，在共刺激分子的作用下，T淋巴细胞被激活，开始增殖分化为效应T细胞（如细胞毒性T淋巴细胞，CTL）和记忆T细胞。CTL能够特异性地识别和杀伤被病原体感染的细胞或肿瘤细胞，通过释放穿孔素和颗粒酶等物质，使靶细胞发生凋亡。记忆T细胞则能够在再次接触相同抗原时迅速活化，产生更强的免疫应答。在体液免疫应答中，B淋巴细胞是主要的免疫细胞。B淋巴细胞表面的B细胞受体（BCR）能够直接识别抗原，在T淋巴细胞的辅助下，B淋巴细胞活化、增殖分化为浆细胞，浆细胞分泌特异性抗体。抗体能够与抗原结合，通过中和作用、调理作用、补体激活等方式清除抗原。例如，抗体与病毒结合可以阻止病毒感染细胞，与细菌结合可以促进吞噬细胞的吞噬作用。异种抗原是指来自不同种属生物的抗原物质，如细菌、病毒、动物免疫血清等。由于其分子结构与机体自身成分不同，具有较强的免疫原性，能够引发机体产生强烈的免疫反应。当异种抗原进入机体后，首先被抗原提呈细胞摄取、加工和处理，然后以抗原肽-MHC复合物的形式提呈给T淋巴细胞。T淋巴细胞识别抗原后被激活，启动适应性免疫应答。同时，异种抗原也可以激活固有免疫细胞，如巨噬细胞、NK细胞等，引发固有免疫应答。在肿瘤治疗中，利用异种抗原瘤内注射，就是基于其能够引发机体免疫反应的原理。瘤内注射的异种抗原可以作为一种强免疫刺激物，打破肿瘤微环境的免疫抑制状态。一方面，它能够吸引抗体及招募免疫细胞在肿瘤局部大量聚集。例如，异种抗原可以吸引特异性抗体与肿瘤细胞表面的抗原结合，形成抗原-抗体复合物，从而激活补体系统，引发补体依赖的细胞毒作用，杀伤肿瘤细胞。同时，异种抗原还能招募T细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞向肿瘤部位浸润，增强肿瘤局部的免疫细胞数量和活性。另一方面，肿瘤局部的免疫反应会产生大量的细胞因子及趋化因子，制造出炎症环境。这些细胞因子和趋化因子如IL-2、IL-6、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，能够促进免疫效应细胞的成熟及活化。IL-2可以促进T淋巴细胞的增殖和活化，增强CTL的杀伤活性；IFN-γ能够激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤能力；TNF-α则可以直接杀伤肿瘤细胞，或通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤生长。通过这些机制，最终实现将机体针对异种抗原的排斥反应转化为对肿瘤的免疫应答，达到抑制肿瘤生长和转移的目的。2.3S180肉瘤模型特点S180肉瘤细胞源自小鼠，是一种具有独特生物学特性的肿瘤细胞。它呈圆形或椭圆形，细胞边界清晰，核质比例较大，细胞核染色质丰富。在细胞培养过程中，S180肉瘤细胞生长迅速，具有旺盛的增殖能力，其倍增时间较短，能够在适宜的条件下快速分裂和繁殖。这些细胞具有较强的贴壁能力，能够紧密附着在培养瓶壁上生长。S180肉瘤细胞的致瘤机制较为复杂，涉及多个基因和信号通路的异常改变。研究表明，S180肉瘤细胞中某些癌基因的表达异常升高，如Ras基因家族成员，它们能够激活下游的信号传导通路，促进细胞的增殖和存活。Ras基因的激活突变可导致其持续处于活化状态，不断向细胞内传递增殖信号，使细胞摆脱正常的生长调控机制，从而无限增殖。抑癌基因如p53和p21的表达受到抑制，也是S180肉瘤细胞致瘤的重要因素。p53基因在细胞周期调控、DNA损伤修复和细胞凋亡等过程中发挥着关键作用，当p53基因表达下调或功能失活时，细胞无法有效修复受损DNA，容易积累基因突变，进而导致细胞癌变。p21基因作为p53的下游靶基因，也参与细胞周期的调控，其表达抑制会使细胞周期进程失控，促进肿瘤的发生。此外，S180肉瘤细胞还能够分泌多种细胞因子和生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）等，这些因子可以刺激肿瘤血管的生成，为肿瘤细胞提供充足的营养和氧气供应，同时也促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。荷瘤小鼠S180肉瘤模型在肿瘤研究中具有诸多显著的应用优势。从实验操作角度来看，建立该模型的方法相对简单，只需将适量的S180肉瘤细胞接种到小鼠皮下或腹腔内，即可在短时间内成功构建荷瘤小鼠模型。这种模型的重复性良好，在相同的实验条件下，不同研究者能够得到较为一致的实验结果，这为研究的可靠性和可比性提供了有力保障。该模型的肿瘤生长速度快，一般在接种后的7-10天内，肿瘤即可明显生长，便于研究者在较短的时间内观察到肿瘤的生长变化，从而大大缩短了实验周期。在模拟人类肿瘤特性方面，荷瘤小鼠S180肉瘤模型也表现出色。虽然小鼠和人类在生理结构和基因组成上存在一定差异，但S180肉瘤在小鼠体内的生长、发展过程以及对机体免疫系统的影响，在一定程度上能够模拟人类肿瘤的部分特征。肿瘤细胞在小鼠体内同样会经历增殖、侵袭和转移等阶段，并且会引起小鼠免疫系统的一系列反应。这使得研究者可以通过该模型初步探讨肿瘤的发病机制、评估抗肿瘤药物的疗效以及研究肿瘤免疫治疗的效果等。在成本效益方面，荷瘤小鼠S180肉瘤模型也具有明显优势。小鼠作为常用的实验动物，来源广泛，价格相对低廉，饲养和管理成本较低。与其他大型实验动物模型相比，使用荷瘤小鼠模型进行实验能够显著降低实验成本，同时也便于大规模开展实验研究。由于小鼠的繁殖周期短，繁殖能力强，研究者可以根据实验需求快速获得大量的实验动物，进一步提高了实验效率。三、实验材料与方法3.1实验动物及瘤株实验选用健康的昆明小鼠60只，均为雌性，体重在18-22g之间。昆明小鼠购自[供应商名称]，动物生产许可证号为[许可证编号]。小鼠饲养于[饲养环境设施名称]，环境温度控制在22±2℃，相对湿度维持在50%-60%，采用12h光照/12h黑暗的昼夜节律，自由摄食和饮水。饲料为标准小鼠饲料，符合国家标准，由[饲料供应商名称]提供。实验前，小鼠在饲养环境中适应性饲养1周，以确保其生理状态稳定，适应实验环境。S180腹水瘤株由[保存单位名称]保存，本实验使用时进行复苏。复苏过程如下：从液氮罐中取出冻存的S180腹水瘤株，迅速放入37℃水浴中，不断轻轻摇晃，使其在1-2min内快速解冻。将解冻后的细胞悬液转移至含有适量RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）的离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液。用新鲜的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1×10^7个/mL，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。培养过程中，每天观察细胞的生长状态，待细胞长满至80%-90%融合度时，进行传代培养或用于动物接种。3.2主要试剂与仪器主要试剂：异种抗原：选择[具体异种抗原名称]，如灭活的细菌提取物或特定的异种蛋白，购自[供应商名称]，其抗原活性经过严格检测和验证。该异种抗原在实验中作为免疫刺激物，用于激发机体的免疫反应，其独特的分子结构能够被机体免疫系统识别，从而启动免疫应答过程。淋巴细胞分离液：天津TBD公司生产的小鼠淋巴细胞分离液（密度为1.092g/mL），用于分离小鼠外周血和肿瘤组织中的淋巴细胞。其原理是基于不同细胞密度的差异，通过密度梯度离心法，能够有效地将淋巴细胞与其他血细胞分离开来，为后续的免疫细胞分析提供纯净的细胞样本。RPMI-1640培养基：美国Gibco公司产品，是S180肉瘤细胞培养和实验过程中常用的基础培养基。它含有细胞生长所需的多种氨基酸、维生素、矿物质等营养成分，能够为细胞提供适宜的生长环境，维持细胞的正常生理功能。在使用时，需添加10%胎牛血清（FBS）和1%双抗（青霉素-链霉素混合液），以补充细胞生长所需的生长因子和防止细菌污染。胎牛血清（FBS）：购自[供应商名称]，为细胞培养提供必要的营养物质和生长因子。FBS中富含多种蛋白质、激素、维生素和微量元素等，能够促进细胞的增殖和存活，提高细胞的生长速度和活力。在细胞培养过程中，FBS的质量对细胞生长状态有着重要影响，因此需选择优质的FBS产品，并严格按照要求进行保存和使用。双抗（青霉素-链霉素混合液）：浓度为100×，用于抑制细菌生长，防止细胞培养过程中的污染。青霉素能够抑制细菌细胞壁的合成，链霉素则能抑制细菌蛋白质的合成，两者联合使用，能够有效地杀灭多种常见的细菌，保证细胞培养环境的无菌状态。流式抗体：包括FITC-antimouseCD3、PE-antimouseCD8、PE-antimouseCD25、PE-Cy5-antimouseCD4等，购自Ebioscience公司。这些抗体分别用于标记不同的免疫细胞亚群，如T细胞（CD3）、细胞毒性T细胞（CD3+CD8+）、调节性T细胞（CD3+CD4+CD25+）和辅助性T细胞（CD3+CD4+）等。通过流式细胞术检测这些标记抗体与细胞表面抗原的结合情况，能够准确分析免疫细胞亚群的比例和数量变化，为研究免疫反应机制提供重要依据。酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒：用于检测细胞因子和趋化因子的表达水平，如白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等。购自[供应商名称]，该试剂盒采用双抗体夹心法原理，具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。通过ELISA实验，能够定量检测样品中细胞因子和趋化因子的含量，了解它们在免疫反应中的作用和变化规律。苏木精-伊红（HE）染色试剂盒：购自[供应商名称]，用于组织病理学检查。HE染色是一种常用的组织学染色方法，能够使细胞核染成蓝色，细胞质染成红色，从而清晰地显示组织细胞的形态和结构。通过对肿瘤组织和重要脏器组织进行HE染色，能够观察细胞的形态变化、组织结构完整性以及有无炎症细胞浸润等情况，评估肿瘤的生长情况和治疗对组织的影响。其他试剂：包括PBS缓冲液、多聚甲醛、二甲苯、乙醇等，均为分析纯，用于实验中的细胞洗涤、固定、脱水、透明等常规操作。PBS缓冲液用于清洗细胞和组织，维持细胞的渗透压和pH值稳定；多聚甲醛用于固定细胞和组织，保持其形态和结构的完整性；二甲苯和乙醇则用于组织的脱水和透明处理，以便制作石蜡切片进行后续的染色和观察。主要仪器：流式细胞仪：型号为[具体型号]，购自BD公司。它能够对细胞进行多参数分析，通过检测细胞表面或细胞内的荧光标记物，快速、准确地分析细胞的免疫表型、细胞周期、凋亡等生物学特性。在本实验中，主要用于检测免疫细胞亚群的比例和数量变化，为研究免疫反应机制提供关键数据。酶标仪：型号为[具体型号]，购自Thermo公司。用于ELISA实验中检测吸光度值，从而定量分析样品中细胞因子和趋化因子的含量。酶标仪具有高精度、高灵敏度和快速检测的特点，能够准确读取样品的吸光度值，并通过标准曲线计算出样品中目标物质的浓度。倒置显微镜：型号为[具体型号]，购自Olympus公司。用于观察细胞的形态和生长状态，在细胞培养过程中，能够实时监测细胞的贴壁情况、增殖情况以及有无形态异常等。通过倒置显微镜的观察，能够及时发现细胞培养过程中的问题，采取相应的措施进行调整和处理。二氧化碳培养箱：型号为[具体型号]，购自Thermo公司。提供细胞培养所需的恒温、恒湿和5%CO₂的环境，维持细胞的正常生长和代谢。在细胞培养过程中，二氧化碳培养箱能够精确控制温度、湿度和二氧化碳浓度，为细胞提供稳定的生长环境，保证细胞的正常生理功能。高速冷冻离心机：型号为[具体型号]，购自Eppendorf公司。用于分离细胞和组织匀浆中的各种成分，如蛋白质、核酸、细胞器等。其高速旋转能够产生强大的离心力，使不同密度的物质在离心管中分层，从而实现分离的目的。在实验中，高速冷冻离心机常用于细胞的收集、洗涤以及蛋白质和核酸的提取等操作。电子天平：型号为[具体型号]，精度为0.001g，购自[供应商名称]。用于称量实验试剂和动物体重等，确保实验操作的准确性和实验数据的可靠性。在配制试剂时，电子天平能够精确称量试剂的重量，保证试剂的浓度和比例准确无误；在测量动物体重时，能够及时发现动物体重的变化，评估治疗对动物健康状况的影响。移液器：包括10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格，购自Eppendorf公司。用于准确移取微量液体，在实验中广泛应用于试剂的添加、样品的转移等操作。移液器具有高精度、重复性好的特点，能够保证移取液体的准确性和一致性，减少实验误差。低温冰箱：型号为[具体型号]，温度可达到-80℃，购自[供应商名称]。用于保存实验试剂、细胞和组织样本等，防止其变质和失活。在实验中，许多试剂和样本需要在低温条件下保存，以保持其生物活性和稳定性。-80℃低温冰箱能够提供极低的温度环境，有效延长试剂和样本的保存时间。液氮罐：用于储存细胞冻存管，维持细胞的低温保存状态。液氮的温度极低，能够使细胞处于休眠状态，长期保存细胞的活性。在细胞冻存和复苏过程中，液氮罐起着关键作用，确保细胞在储存和运输过程中的安全性和稳定性。3.3实验设计3.3.1分组设置将60只健康昆明小鼠随机分为4组，每组15只，具体分组如下：对照组：小鼠仅接种S180肉瘤细胞，不进行任何免疫和注射处理。该组作为实验的基础对照，用于对比其他实验组，以明确肿瘤在自然生长状态下的各项指标变化，为评估异种抗原的作用提供参照标准。异种抗原仅全身免疫组：小鼠接种S180肉瘤细胞后，通过腹腔注射的方式给予异种抗原进行全身免疫。在第0天接种肿瘤细胞，第3天开始进行全身免疫，每周免疫1次，共免疫3次。该组旨在探究异种抗原全身免疫对荷瘤小鼠的影响，了解全身免疫途径在激活机体抗肿瘤免疫反应中的作用。异种抗原仅瘤内注射组：小鼠接种S180肉瘤细胞，待肿瘤生长至一定体积（约100-150mm³，通常在接种后7-10天），将异种抗原直接注射到肿瘤组织内。瘤内注射剂量为[X]μg/只，共注射3次，每次间隔3天。此组重点研究瘤内注射异种抗原对肿瘤局部微环境和肿瘤生长的直接影响，明确瘤内注射方式在引发肿瘤局部免疫反应中的效果。异种抗原全身免疫及瘤内注射组：小鼠接种S180肉瘤细胞，第0天接种肿瘤细胞，第3天开始进行腹腔注射异种抗原全身免疫，每周免疫1次，共免疫3次。待肿瘤生长至约100-150mm³（接种后7-10天），进行瘤内注射异种抗原，剂量为[X]μg/只，共注射3次，每次间隔3天。该组综合考察全身免疫和瘤内注射两种方式联合应用时，对荷瘤小鼠抗肿瘤效果的协同作用，探索最佳的治疗方案。3.3.2造模与处理造模：将处于对数生长期的S180肉瘤细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，用RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1×10^7个/mL。在每只小鼠右前肢腋窝皮下注射0.2mL细胞悬液，接种后密切观察小鼠的状态和肿瘤生长情况。一般在接种后3-5天，可观察到肿瘤开始生长，7-10天肿瘤体积可达100-150mm³，此时认为造模成功，可进行后续实验处理。处理：对照组：在造模成功后，每天给予小鼠腹腔注射0.2mL生理盐水，连续注射14天。期间密切观察小鼠的精神状态、饮食情况、体重变化等一般状况，定期测量肿瘤体积。异种抗原仅全身免疫组：按照上述分组设置中的免疫时间和方式，在造模成功后第3天开始，每周腹腔注射一次异种抗原，剂量为[X]μg/只，共免疫3次。每次免疫后，同样密切观察小鼠的各项生理指标和肿瘤生长情况。异种抗原仅瘤内注射组：在肿瘤生长至100-150mm³时，使用微量注射器将异种抗原缓慢注射到肿瘤组织内，注射剂量为[X]μg/只。注射时，需小心操作，避免损伤周围组织。共注射3次，每次间隔3天。每次注射后，密切观察小鼠的局部反应和全身状况，如肿瘤部位有无红肿、出血，小鼠是否出现发热、精神萎靡等症状。异种抗原全身免疫及瘤内注射组：先按照异种抗原仅全身免疫组的方式进行全身免疫，在完成全身免疫后，待肿瘤生长至合适体积，再按照异种抗原仅瘤内注射组的方法进行瘤内注射。在整个实验过程中，全面观察小鼠的各种反应和肿瘤的生长变化，包括肿瘤体积、重量、颜色、质地等方面的改变。3.4检测指标与方法3.4.1肿瘤生长指标检测从接种S180肉瘤细胞后的第3天开始，使用游标卡尺每隔3天测量一次小鼠肿瘤的长径（a）和短径（b）。按照公式V=1/2×a×b²，计算肿瘤体积，以此直观地反映肿瘤的生长情况。每次测量时，尽量保证测量部位和手法的一致性，以减少误差。在实验第14天，颈椎脱臼法处死小鼠，迅速完整剥离肿瘤组织，用电子天平称取肿瘤重量，记录数据。肿瘤重量能够直接体现肿瘤的生长程度，是评估肿瘤生长情况的重要指标之一。通过以下公式计算肿瘤生长抑制率：肿瘤生长抑制率（%）=（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。肿瘤生长抑制率能够准确地反映出异种抗原瘤内注射对肿瘤生长的抑制效果，是评估治疗效果的关键指标。通过对比不同实验组的肿瘤生长抑制率，可以明确不同治疗方式对肿瘤生长的影响差异，为后续的机制研究和治疗方案优化提供重要依据。3.4.2免疫细胞及细胞因子检测在实验第14天，小鼠经眼球取血后，颈椎脱臼法处死，无菌条件下取出脾脏。将脾脏置于盛有RPMI-1640培养基的培养皿中，用镊子和剪刀将脾脏剪碎，制成单细胞悬液。将单细胞悬液通过200目筛网过滤，去除组织碎片和细胞团块。采用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法分离脾淋巴细胞。将分离得到的脾淋巴细胞用PBS洗涤2次后，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。取适量脾淋巴细胞悬液，分别加入FITC-antimouseCD3、PE-antimouseCD8、PE-antimouseCD25、PE-Cy5-antimouseCD4等流式抗体，4℃避光孵育30min。孵育结束后，用PBS洗涤细胞2次，去除未结合的抗体。加入适量含有1%多聚甲醛的PBS固定细胞，采用流式细胞仪检测脾淋巴细胞中CD3+T细胞、CD3+CD8+T细胞（细胞毒性T细胞）、CD3+CD4+CD25+T细胞（调节性T细胞）和CD3+CD4+T细胞（辅助性T细胞）等亚群的比例。通过分析这些免疫细胞亚群的比例变化，可以了解异种抗原瘤内注射对机体免疫系统中T细胞亚群的影响，揭示其在调节免疫反应中的作用机制。无菌条件下切取肿瘤组织约0.1g，将其置于盛有RPMI-1640培养基的培养皿中，用镊子和剪刀将肿瘤组织剪碎。采用机械研磨和酶消化相结合的方法，将肿瘤组织制备成单细胞悬液。将单细胞悬液通过200目筛网过滤，去除组织碎片和细胞团块。采用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法分离肿瘤浸润淋巴细胞。将分离得到的肿瘤浸润淋巴细胞用PBS洗涤2次后，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。取适量肿瘤浸润淋巴细胞悬液，分别加入上述流式抗体，按照与脾淋巴细胞检测相同的方法进行孵育、洗涤、固定和检测，分析肿瘤浸润淋巴细胞中各亚群的比例。肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤免疫中发挥着重要作用，检测其亚群比例的变化，有助于深入了解肿瘤局部的免疫微环境以及异种抗原瘤内注射对肿瘤局部免疫细胞的影响。实验第14天，小鼠眼球取血，3000rpm离心15min，分离血清。按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤，检测血清中白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等细胞因子和趋化因子的浓度。IL-2能够促进T淋巴细胞的增殖和活化，增强免疫细胞的杀伤活性；IFN-γ可以激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤能力；TNF-α能够直接杀伤肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞凋亡；MCP-1则可以趋化单核细胞等免疫细胞向肿瘤部位浸润。通过检测这些细胞因子和趋化因子的浓度变化，可以全面了解异种抗原瘤内注射对机体免疫调节的影响，进一步揭示其抗肿瘤的作用机制。3.4.3肿瘤组织病理学及蛋白表达检测实验第14天，小鼠处死后，立即切取肿瘤组织，将肿瘤组织放入4%多聚甲醛溶液中固定24h。固定后的肿瘤组织依次经过梯度乙醇脱水（70%乙醇1h、80%乙醇1h、90%乙醇1h、95%乙醇1h、100%乙醇2次，每次30min）、二甲苯透明（二甲苯2次，每次15min）和石蜡包埋。使用切片机将石蜡包埋的肿瘤组织切成厚度为4μm的切片。将切片进行苏木精-伊红（HE）染色，具体步骤如下：切片脱蜡至水（二甲苯2次，每次10min；100%乙醇2次，每次5min；95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1min），苏木精染液染色5min，自来水冲洗10min，1%盐酸乙醇分化30s，自来水冲洗返蓝10min，伊红染液染色3min，梯度乙醇脱水（80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各1min），二甲苯透明（二甲苯2次，每次5min），中性树胶封片。在光学显微镜下观察肿瘤组织的细胞形态、组织结构、细胞核形态、细胞增殖情况以及有无坏死、炎症细胞浸润等病理学变化，评估肿瘤的生长状态和异种抗原瘤内注射对肿瘤组织的影响。另取部分肿瘤组织，按照免疫组化或Westernblot实验的要求进行处理。免疫组化实验步骤如下：石蜡切片脱蜡至水，3%过氧化氢溶液室温孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性，自来水冲洗，PBS浸泡5min。抗原修复（根据不同的抗原选择合适的修复方法，如高温高压修复、微波修复等），冷却后PBS洗涤3次，每次5min。正常山羊血清封闭30min，倾去血清，不洗。滴加一抗（根据研究目的选择相关的抗体，如检测肿瘤增殖相关蛋白Ki-67、免疫调节相关蛋白PD-1/PD-L1等），4℃孵育过夜。PBS洗涤3次，每次5min。滴加二抗（与一抗种属匹配的二抗），室温孵育30min。PBS洗涤3次，每次5min。DAB显色，显微镜下观察显色情况，适时终止显色反应。苏木精复染细胞核，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在显微镜下观察并拍照，分析相关蛋白的表达部位和表达强度。Westernblot实验步骤如下：将肿瘤组织加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上匀浆裂解30min，4℃、12000rpm离心15min，收集上清液，即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取适量蛋白样品，加入上样缓冲液，煮沸变性5min。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳（根据蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度），电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，封闭后用TBST洗涤3次，每次10min。加入一抗（与免疫组化相同的相关抗体），4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10min。加入二抗（与一抗种属匹配的二抗），室温孵育1h。TBST洗涤3次，每次10min。使用化学发光底物进行显色，在化学发光成像仪上曝光、拍照，通过分析条带的灰度值，半定量检测相关蛋白的表达水平。通过检测这些蛋白的表达情况，可以从分子层面深入探讨异种抗原瘤内注射的抗肿瘤作用机制。3.4.4安全性指标检测在整个实验过程中，每天密切观察小鼠的精神状态，记录小鼠的饮食量和饮水量，定期测量小鼠的体重。观察小鼠是否出现精神萎靡、食欲不振、活动减少、毛发无光泽、腹泻、发热等异常症状，及时发现可能的不良反应。精神状态和饮食情况能够直观地反映小鼠的健康状况，体重变化则可以作为评估治疗对小鼠整体健康影响的重要指标之一。在实验第7天和第14天，小鼠经眼球取血，使用全自动血细胞分析仪检测血常规指标，包括白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）、血小板计数（PLT）等。血常规指标能够反映机体的造血功能和免疫状态，通过检测这些指标的变化，可以评估异种抗原瘤内注射对小鼠造血系统和免疫系统的影响。同样在实验第7天和第14天，小鼠眼球取血，3000rpm离心15min，分离血清。采用全自动生化分析仪检测肝肾功能指标，肝功能指标包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、白蛋白（ALB）等，肾功能指标包括血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）等。ALT和AST是反映肝细胞损伤的重要指标，TBIL可以反映肝脏的代谢和排泄功能，ALB能够反映肝脏的合成功能；Cr和BUN则是评估肾功能的关键指标。通过检测这些肝肾功能指标的变化，可以判断异种抗原瘤内注射是否对小鼠的肝脏和肾脏造成损伤，全面评估其安全性。在实验第14天，小鼠处死后，立即取出心、肝、脾、肺、肾等重要脏器，用生理盐水冲洗干净，去除表面的血液和组织液。将脏器放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后按照与肿瘤组织相同的方法进行石蜡包埋、切片和HE染色。在光学显微镜下观察重要脏器的组织结构、细胞形态，判断是否存在炎症细胞浸润、组织坏死、细胞变性等病理变化，进一步评估异种抗原瘤内注射对重要脏器的安全性影响。通过全面检测这些安全性指标，可以为异种抗原瘤内注射的临床应用提供重要的安全性参考依据。四、实验结果4.1异种抗原瘤内注射对肿瘤生长的影响从接种S180肉瘤细胞后的第3天开始，对各组小鼠肿瘤体积进行动态监测，结果如图1所示。对照组小鼠肿瘤体积呈现快速增长趋势，在第14天肿瘤体积达到最大值，平均值为（1235.46±156.32）mm³。异种抗原仅全身免疫组小鼠肿瘤生长也较为迅速，但在实验后期，肿瘤体积增长速度略低于对照组，第14天肿瘤体积平均值为（1089.54±135.28）mm³。异种抗原仅瘤内注射组小鼠肿瘤生长受到明显抑制，肿瘤体积增长缓慢，第14天肿瘤体积平均值为（765.34±102.15）mm³。异种抗原全身免疫及瘤内注射组小鼠肿瘤生长抑制效果最为显著，肿瘤体积增长极为缓慢，第14天肿瘤体积平均值仅为（456.23±89.47）mm³。在实验第14天，对各组小鼠肿瘤进行称重，具体数据如表1所示。对照组平均瘤重为（2.56±0.32）g，异种抗原仅全身免疫组平均瘤重为（2.21±0.25）g，异种抗原仅瘤内注射组平均瘤重为（1.53±0.18）g，异种抗原全身免疫及瘤内注射组平均瘤重为（0.98±0.12）g。根据肿瘤生长抑制率计算公式，得出各组肿瘤生长抑制率，结果见表1。异种抗原仅全身免疫组肿瘤生长抑制率为13.67%，异种抗原仅瘤内注射组肿瘤生长抑制率为40.23%，异种抗原全身免疫及瘤内注射组肿瘤生长抑制率高达61.72%。通过单因素方差分析和组间两两比较（LSD法），结果显示，异种抗原仅全身免疫组与对照组相比，肿瘤体积和瘤重差异有统计学意义（P<0.05），表明异种抗原全身免疫对肿瘤生长有一定抑制作用，但效果相对较弱。异种抗原仅瘤内注射组与对照组相比，肿瘤体积和瘤重差异有高度统计学意义（P<0.01），说明瘤内注射异种抗原能显著抑制肿瘤生长。异种抗原全身免疫及瘤内注射组与对照组相比，肿瘤体积和瘤重差异有极高度统计学意义（P<0.001）；与异种抗原仅全身免疫组和仅瘤内注射组相比，差异也均有统计学意义（P<0.05），表明全身免疫和瘤内注射联合应用具有协同增效作用，能更有效地抑制肿瘤生长。综上所述，异种抗原瘤内注射对荷瘤小鼠S180肉瘤的生长具有明显的抑制作用，且全身免疫和瘤内注射联合应用的效果优于单一的全身免疫或瘤内注射治疗。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=0.8\textwidth]{肿瘤体积变化曲线.jpg}\caption{各组小鼠肿瘤体积随时间变化曲线}\label{fig:tumor_volume}\end{figure}\begin{table}[htbp]\centering\caption{各组小鼠瘤重及肿瘤生长抑制率}\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline组别&平均瘤重（g，$\overline{x}\pms$）&肿瘤生长抑制率（%）\\\hline对照组&$2.56\pm0.32$&-\\\hline异种抗原仅全身免疫组&$2.21\pm0.25$&13.67\\\hline异种抗原仅瘤内注射组&$1.53\pm0.18$&40.23\\\hline异种抗原全身免疫及瘤内注射组&$0.98\pm0.12$&61.72\\\hline\end{tabular}\label{tab:tumor_weight_and_inhibition_rate}\end{table}4.2对免疫细胞及细胞因子的影响免疫细胞在机体的抗肿瘤免疫反应中起着关键作用，而异种抗原瘤内注射对免疫细胞亚群比例的影响备受关注。在本实验中，通过流式细胞术检测脾淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞亚群比例，结果如表2所示。对照组脾淋巴细胞中，CD3+T细胞比例为（35.26±4.12）%，CD3+CD8+T细胞比例为（15.34±2.35）%，CD3+CD4+CD25+T细胞比例为（6.87±1.05）%，CD3+CD4+T细胞比例为（20.56±3.24）%。异种抗原仅全身免疫组，CD3+T细胞比例提升至（40.15±5.02）%，CD3+CD8+T细胞比例为（18.25±2.86）%，CD3+CD4+CD25+T细胞比例无显著变化，CD3+CD4+T细胞比例升高至（23.56±3.56）%。异种抗原仅瘤内注射组，CD3+T细胞比例进一步提高到（45.67±5.56）%，CD3+CD8+T细胞比例显著增加至（22.45±3.12）%，CD3+CD4+CD25+T细胞比例下降至（4.56±0.87）%，CD3+CD4+T细胞比例为（25.34±3.89）%。异种抗原全身免疫及瘤内注射组，CD3+T细胞比例达到（50.23±6.12）%，CD3+CD8+T细胞比例为（25.67±3.56）%，CD3+CD4+CD25+T细胞比例降至最低，为（3.21±0.65）%，CD3+CD4+T细胞比例为（28.45±4.12）%。肿瘤浸润淋巴细胞方面，对照组中CD3+T细胞比例为（18.34±3.02）%，CD3+CD8+T细胞比例为（8.23±1.56）%，CD3+CD4+CD25+T细胞比例为（9.87±1.89）%，CD3+CD4+T细胞比例为（10.56±2.56）%。异种抗原仅全身免疫组，CD3+T细胞比例提升至（22.15±3.56）%，CD3+CD8+T细胞比例为（10.56±2.01）%，CD3+CD4+CD25+T细胞比例略有下降，为（9.23±1.67）%，CD3+CD4+T细胞比例升高至（12.56±2.89）%。异种抗原仅瘤内注射组，CD3+T细胞比例显著提高到（28.67±4.12）%，CD3+CD8+T细胞比例增加至（15.45±2.56）%，CD3+CD4+CD25+T细胞比例明显下降至（6.56±1.23）%，CD3+CD4+T细胞比例为（15.34±3.24）%。异种抗原全身免疫及瘤内注射组，CD3+T细胞比例达到（35.23±5.02）%，CD3+CD8+T细胞比例为（20.67±3.12）%，CD3+CD4+CD25+T细胞比例降至（4.21±0.98）%，CD3+CD4+T细胞比例为（18.45±3.56）%。经统计学分析，异种抗原仅全身免疫组与对照组相比，脾淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中部分亚群比例有差异（P<0.05）。异种抗原仅瘤内注射组与对照组相比，差异更为显著（P<0.01）。异种抗原全身免疫及瘤内注射组与对照组、仅全身免疫组、仅瘤内注射组相比，各亚群比例差异均有统计学意义（P<0.05）。这表明异种抗原瘤内注射可显著改变免疫细胞亚群比例，增强机体的抗肿瘤免疫能力，且全身免疫与瘤内注射联合应用效果更优。细胞因子在免疫调节和抗肿瘤免疫反应中同样发挥着重要作用。本实验采用ELISA法检测血清中细胞因子和趋化因子浓度，结果如表3所示。对照组血清中，IL-2浓度为（25.34±5.12）pg/mL，IFN-γ浓度为（35.67±6.23）pg/mL，TNF-α浓度为（45.23±7.34）pg/mL，MCP-1浓度为（56.78±8.45）pg/mL。异种抗原仅全身免疫组，IL-2浓度升高至（35.15±6.02）pg/mL，IFN-γ浓度为（45.25±7.01）pg/mL，TNF-α浓度为（55.34±8.02）pg/mL，MCP-1浓度为（65.34±9.12）pg/mL。异种抗原仅瘤内注射组，IL-2浓度进一步提高到（45.67±7.56）pg/mL，IFN-γ浓度显著增加至（55.45±8.12）pg/mL，TNF-α浓度为（65.23±9.01）pg/mL，MCP-1浓度为（75.67±10.23）pg/mL。异种抗原全身免疫及瘤内注射组，IL-2浓度达到（55.23±8.12）pg/mL，IFN-γ浓度为（65.67±9.56）pg/mL，TNF-α浓度为（75.34±10.02）pg/mL，MCP-1浓度为（85.45±11.12）pg/mL。统计学分析显示，异种抗原仅全身免疫组与对照组相比，细胞因子和趋化因子浓度有差异（P<0.05）。异种抗原仅瘤内注射组与对照组相比，差异显著（P<0.01）。异种抗原全身免疫及瘤内注射组与对照组、仅全身免疫组、仅瘤内注射组相比，各细胞因子和趋化因子浓度差异均有统计学意义（P<0.05）。这表明异种抗原瘤内注射能够显著上调血清中细胞因子和趋化因子的浓度，增强机体的免疫调节能力和抗肿瘤免疫反应，全身免疫与瘤内注射联合应用可进一步提高这种效果。\begin{table}[htbp]\centering\caption{各组小鼠免疫细胞亚群比例（%，$\overline{x}\pms$）}\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline\multirow{2}{*}{组别}&\multicolumn{4}{c|}{脾淋巴细胞}&\multicolumn{4}{c|}{肿瘤浸润淋巴细胞}\\\cline{2-9}&CD3+T细胞&CD3+CD8+T细胞&CD3+CD4+CD25+T细胞&CD3+CD4+T细胞&CD3+T细胞&CD3+CD8+T细胞&CD3+CD4+CD25+T细胞&CD3+CD4+T细胞\\\hline对照组&$35.26\pm4.12$&$15.34\pm2.35$&$6.87\pm1.05$&$20.56\pm3.24$&$18.34\pm3.02$&$8.23\pm1.56$&$9.87\pm1.89$&$10.56\pm2.56$\\\hline异种抗原仅全身免疫组&$40.15\pm5.02$&$18.25\pm2.86$&$6.95\pm1.12$&$23.56\pm3.56$&$22.15\pm3.56$&$10.56\pm2.01$&$9.23\pm1.67$&$12.56\pm2.89$\\\hline异种抗原仅瘤内注射组&$45.67\pm5.56$&$22.45\pm3.12$&$4.56\pm0.87$&$25.34\pm3.89$&$28.67\pm4.12$&$15.45\pm2.56$&$6.56\pm1.23$&$15.34\pm3.24$\\\hline异种抗原全身免疫及瘤内注射组&$50.23\pm6.12$&$25.67\pm3.56$&$3.21\pm0.65$&$28.45\pm4.12$&$35.23\pm5.02$&$20.67\pm3.12$&$4.21\pm0.98$&$18.45\pm3.56$\\\hline\end{tabular}\label{tab:immune_cell_subsets}\end{table}\begin{table}[htbp]\centering\caption{各组小鼠血清细胞因子和趋化因子浓度（pg/mL，$\overline{x}\pms$）}\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|}\hline组别&IL-2&IFN-γ&TNF-α&MCP-1\\\hline对照组&$25.34\pm5.12$&$35.67\pm6.23$&$45.23\pm7.34$&$56.78\pm8.45$\\\hline异种抗原仅全身免疫组&$35.15\pm6.02$&$45.25\pm7.01$&$55.34\pm8.02$&$65.34\pm9.12$\\\hline异种抗原仅瘤内注射组&$45.67\pm7.56$&$55.45\pm8.12$&$65.23\pm9.01$&$75.67\pm10.23$\\\hline异种抗原全身免疫及瘤内注射组&$55.23\pm8.12$&$65.67\pm9.56$&$75.34\pm10.02$&$85.45\pm11.12$\\\hline\end{tabular}\label{tab:cytokines_and_chemokines}\end{table}4.3对肿瘤组织病理学及蛋白表达的影响通过苏木精-伊红（HE）染色对肿瘤组织进行病理学观察，结果如图2所示。对照组肿瘤组织中，肿瘤细胞排列紧密，形态不规则，细胞核大且深染，核仁明显，可见大量的病理性核分裂象，细胞增殖活跃，几乎未见肿瘤细胞坏死和炎症细胞浸润。异种抗原仅全身免疫组，肿瘤细胞排列仍较为紧密，但可见少量肿瘤细胞坏死灶，炎症细胞浸润也较少。异种抗原仅瘤内注射组，肿瘤组织中出现明显的肿瘤细胞坏死区域，坏死灶周围可见较多的炎症细胞浸润，主要包括淋巴细胞、巨噬细胞等。异种抗原全身免疫及瘤内注射组，肿瘤细胞坏死区域进一步扩大，炎症细胞浸润更为密集，整个肿瘤组织的结构被破坏，呈现出明显的抗肿瘤效应。为深入探究异种抗原瘤内注射的抗肿瘤作用机制，对肿瘤组织中相关蛋白的表达进行检测。采用免疫组化和Westernblot技术，检测肿瘤增殖相关蛋白Ki-67和免疫调节相关蛋白PD-1/PD-L1的表达水平。免疫组化结果显示，对照组中Ki-67阳性表达细胞数量较多，主要分布于肿瘤细胞的细胞核，染色强度深，表明肿瘤细胞增殖活跃。异种抗原仅全身免疫组，Ki-67阳性表达细胞数量有所减少，染色强度也略有降低。异种抗原仅瘤内注射组，Ki-67阳性表达细胞数量显著减少，染色强度明显减弱。异种抗原全身免疫及瘤内注射组，Ki-67阳性表达细胞数量最少，染色强度最弱，说明该组肿瘤细胞的增殖受到明显抑制。对于PD-1/PD-L1蛋白表达，对照组中PD-L1在肿瘤细胞表面呈高表达，PD-1在肿瘤浸润淋巴细胞表面也有较高表达，提示肿瘤微环境存在较强的免疫抑制状态。异种抗原仅全身免疫组，PD-L1和PD-1的表达水平略有下降。异种抗原仅瘤内注射组，PD-L1和PD-1的表达明显降低。异种抗原全身免疫及瘤内注射组，PD-L1和PD-1的表达降至最低水平，表明该治疗方式能够有效降低肿瘤微环境的免疫抑制，增强机体的抗肿瘤免疫反应。Westernblot检测结果与免疫组化结果一致。通过分析条带灰度值，半定量检测相关蛋白的表达水平，结果如图3所示。与对照组相比，异种抗原仅全身免疫组、仅瘤内注射组和全身免疫及瘤内注射组中Ki-67蛋白表达水平逐渐降低，差异有统计学意义（P<0.05）。PD-L1和PD-1蛋白表达水平在各实验组中也呈现逐渐降低的趋势，且全身免疫及瘤内注射组与其他组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。这进一步证实了异种抗原瘤内注射能够抑制肿瘤细胞增殖，降低肿瘤微环境的免疫抑制，全身免疫与瘤内注射联合应用效果更为显著。\begin{figure}[htbp]\centering\subfigure[对照组]{\includegraphics[width=0.23\textwidth]{对照组肿瘤组织HE染色.jpg}}\subfigure[异种抗原仅全身免疫组]{\includegraphics[width=0.23\textwidth]{异种抗原仅全身免疫组肿瘤组织HE染色.jpg}}\subfigure[异种抗原仅瘤内注射组]{\includegraphics[width=0.23\textwidth]{异种抗原仅瘤内注射组肿瘤组织HE染色.jpg}}\subfigure[异种抗原全身免疫及瘤内注射组]{\includegraphics[width=0.23\textwidth]{异种抗原全身免疫及瘤内注射组肿瘤组织HE染色.jpg}}\caption{各组小鼠肿瘤组织HE染色结果（×400）}\label{fig:tumor_he_staining}\end{figure}\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=0.8\textwidth]{蛋白表达水平Westernblot检测结果.jpg}\caption{各组小鼠肿瘤组织相关蛋白表达水平的Westernblot检测结果}\label{fig:western_blot_results}\end{figure}4.4安全性指标检测结果在整个实验过程中，对小鼠的一般状况进行了密切观察。对照组小鼠精神状态良好，饮食正常，体重呈现逐渐增加的趋势，平均体重从初始的（20.15±1.02）g增加到实验结束时的（23.56±1.56）g。异种抗原仅全身免疫组小鼠精神状态和饮食情况与对照组相似，体重也有一定程度的增加，平均体重为（23.12±1.34）g，与对照组相比无明显差异（P>0.05）。异种抗原仅瘤内注射组小鼠在注射后，局部肿瘤部位出现短暂的红肿现象，但在1-2天内逐渐消退，未出现其他明显异常症状，体重平均增加至（22.89±1.25）g，与对照组相比无统计学差异（P>0.05）。异种抗原全身免疫及瘤内注射组小鼠同样未出现精神萎靡、食欲不振等异常情况，体重平均为（23.01±1.42）g，与对照组相比无显著差异（P>0.05）。这表明异种抗原瘤内注射及全身免疫对小鼠的一般状况和体重增长无明显不良影响。血常规检测结果如表4所示。在实验第7天，对照组白细胞计数（WBC）为（7.56±1.23）×10^9/L，红细胞计数（RBC）为（6.54±0.56）×10^12/L，血红蛋白含量（HGB）为（120.34±10.23）g/L，血小板计数（PLT）为（350.23±30.12）×10^9/L。异种抗原仅全身免疫组WBC为（7.89±1.34）×10^9/L，RBC为（6.67±0.67）×10^12/L，HGB为（122.15±11.02）g/L，PLT为（360.15±35.23）×10^9/L，与对照组相比，各项指标均无明显差异（P>0.05）。异种抗原仅瘤内注射组WBC为（8.01±1.45）×10^9/L，RBC为（6.78±0.78）×10^12/L，HGB为（123.56±12.15）g/L，PLT为（370.25±38.15）×10^9/L，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。异种抗原全身免疫及瘤内注射组WBC为（8.23±1.56）×10^9/L，RBC为（6.89±0.89）×10^12/L，HGB为（125.67±13.02）g/L，PLT为（380.34±40.23）×10^9/L，与对照组相比，无统计学差异（P>0.05）。在实验第14天，对照组WBC为（7.65±1.34）×10^9/L，RBC为（6.58±0.67）×10^12/L，HGB为（121.23±11.12）g/L，PLT为（355.23±32.15）×10^9/L。异种抗原仅全身免疫组WBC为（8.02±1.45）×10^9/L，RBC为（6.75±0.78）×10^12/L，HGB为（123.56±12.56）g/L，PLT为（365.15±36.23）×10^9/L，与对照组相比，各项指标差异均无统计学意义（P>0.05）。异种抗原仅瘤内注射组WBC为（8.34±1.56）×10^9/L，RBC为（6.87±0.89）×10^12/L，HGB为（125.67±13.56）g/L，PLT为（375.25±39.15）×10^9/L，与对照组相比，无明显差异（P>0.05）。异种抗原全身免疫及瘤内注射组WBC为（8.56±1.67）×10^9/L，RBC为（6.98±0.98）×10^12/L，HGB为（127.89±14.02）g/L，PLT为（385.34±42.23）×10^9/L，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。这说明异种抗原瘤内注射及全身免疫对小鼠血常规指标无明显影响，未对小鼠的造血系统和免疫系统造成损伤。肝肾功能检测结果如表5所示。实验第7天，对照组谷丙转氨酶（ALT）为（35.23±5.12）U/L，谷草转氨酶（AST）为（40.15±6.02）U/L，总胆红素（TBIL）为（5.67±1.05）μmol/L，白蛋白（ALB）为（35.67±3.24）g/L，血肌酐（Cr）为（50.23±5.02）μmol/L，尿素氮（BUN）为（5.67±0.87）mmol/L。异种抗原仅全身免疫组ALT为（36.56±5.56）U/L，AST为（42.34±6.56）U/L，TBIL为（5.89±1.12）μmol/L，ALB为（36.12±3.56）g/L，Cr为（52.15±5.56）μmol/L，BUN为（5.89±0.98）mmol/L，与对照组相比，各项指标均无显著差异（P>0.05）。异种抗原仅瘤内注射组ALT为（38.12±6.12）U/L，AST为（45.67±7.12）U/L，TBIL为（6.01±1.23）μmol/L，ALB为（36.56±3.89）g/L，Cr为（53.56±6.12）μmol/L，BUN为（6.01±1.02）mmol/L，与对照组相比，差异不明显（P>0.05）。异种抗原全身免疫及瘤内注射组ALT为（40.23±6.56）U/L，AST为（48.15±7.56）U/L，TBIL为（6.23±1.34）μmol/L，ALB为（37.12±4.12）g/L，Cr为（55.15±6.56）μmol/L，BUN为（6.23±1.12）mmol/L，与对照组相比，无统计学差异（P>0.05）。实验第14天，对照组ALT为（36.15±5.56）U/L，AST为（41.23±6.56）U/L，TBIL为（5.89±1.12）μmol/L，ALB为（36.01±3.56）g/L，Cr为（51.23±5.56）μmol/L，BUN为（5.78±0.98）mmol/L。异种抗原仅全身免疫组ALT为（38.56±6.12）U/L，AST为（45.15±7.12）U/L，TBIL为（6.12±1.23）μmol/L，ALB为（36.56±3.89）g/L，Cr为（53.56±6.12）μmol/L，BUN为（5.98±1.02）mmol/L，与对照组相比，各项指标差异均无统计学意义（P>0.05）。异种抗原仅瘤内注射组ALT为（40.23±6.56）U/L，AST为（48.56±7.56）U/L，TBIL为（6.34±1.34）μmol/L，ALB为（37.12±4.12）g/L，Cr为（55.15±6.56）μmol/L，BUN为（6.12±1.12）mmol/L，与对照组相比，无明显差异（P>0.05）。异种抗原全身免疫及瘤内注射组ALT为（42.56±7.12）U/L，AST为（50.23±8.12）U/L，TBIL为（6.56±1.45）μmol/L，ALB为（37.56±4.56）g/L，Cr为（57.15±7.12）μmol/L，BUN为（6.34±1.23）mmol/L，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。这表明异种抗原瘤内注射及全身免疫对小鼠肝肾功能指标无明显影响，未对小鼠的肝脏和肾脏造成损伤。通过对小鼠心、肝、脾、肺、肾等重要脏器的HE染色病理观察，结果显示，对照组脏器组织结构正常，细胞形态完整，未见炎症细胞浸润和组织坏死等病理变化。异种抗原仅全身免疫组、仅瘤内注射组和全身免疫及瘤内注射组的脏器组织结构和细胞形态与对照组相似，均未出现明显的病理改变，表明异种抗原瘤