【《关于某对虾养殖场的对虾疾病的调查分析报告》5900字】

关于某对虾养殖场的对虾疾病的调查分析报告目录TOC\o"1-3"\h\u31993关于某对虾养殖场的对虾疾病的调查分析报告 1242601.1引言 1314061.2材料和方法 2269421.2.1样品采集地及样品采集信息 210481.2.2水质调查 4142341.2.3弧菌数定量 4107041.2.4细菌分离鉴定 487491.2.5病原检测 5114061.2.6可疑病原菌的PirAB检测 6209141.2.7数据处理 6310711.3结果 6208011.3.1养殖场1水质调查 6246511.3.2弧菌数定量 794181.3.3潜在细菌性病原的检出情况 885561.3.4对虾主要病原检出情况 9123771.3.5主要可疑细菌性病原的PirAB检测 1029531.4讨论 10242572.5结论 121.1引言凡纳滨对虾（LitopenaeusVannamei）自1989年引入我国后，随着育苗及养殖技术的不断发展，目前已经成为我国养殖对虾中的重要品种。该虾具有广盐、适宜高密度养殖等特性，因而在我国沿海及内陆地区具有广泛的养殖，也是室内工厂化及半工厂化养殖的重要品种，养殖单产可达13.3kg/m3ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>杜以帅</Author><Year>2021</Year><RecNum>69</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[62]</style></DisplayText><record><rec-number>69</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645362463">69</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="中文期刊">40</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">杜以帅</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">邱天龙</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">周利</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">陈福迪</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">徐建平</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">李叶</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">孙建明</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">三段式凡纳滨对虾循环水养殖模式研究</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">渔业现代化</style></secondary-title></titles><pages>51-66</pages><volume>48</volume><number>3</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[62]。随着对虾养殖业的快速发展，对虾疾病已成为近年来阻碍对虾养殖业发展的主要原因之一。目前在我国凡纳滨对虾养殖中报道的重要病原有WSSV、IHHNV、DIV1、CMNV、VpAHPND和EHP等ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[63-69]，其中任何一种单病原感染或多病原混合感染，均会给对虾养殖带来严重影响，特别是在高密度的养殖条件下，因水环境条件胁迫，对虾会出现高的发病率及死亡率ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Thitamadee</Author><Year>2016</Year><RecNum>76</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[70]</style></DisplayText><record><rec-number>76</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645363398">76</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Thitamadee,S.</author><author>Prachumwat,A.</author><author>Srisala,J.</author><author>Jaroenlak,P.</author><author>Salachan,P.V.</author><author>Sritunyalucksana,K.</author><author>Flegel,T.W.</author><author>Itsathitphaisarn,O.%JAquaculture</author></authors></contributors><titles><title>ReviewofcurrentdiseasethreatsforcultivatedpenaeidshrimpinAsia</title></titles><pages>69-87</pages><dates><year>2016</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[70]。优质苗种的持续供应是促使我国对虾养殖产业可持续发展的重要因素，我国虾苗生产的规范化程度较低，苗种育成的质量不断下降，大部分苗种在不同养殖地区相互转运，使病原的传播风险进一步加大，严重影响对虾养殖ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>G</Author><Year>1999</Year><RecNum>77</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[71,72]</style></DisplayText><record><rec-number>77</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645407534">77</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Vandenberghe

J;Verdonck

L;Robles-Arozarena

R;RiveraG</author></authors></contributors><titles><title>Vibrios

associated

with

Litopenaeusvannamei

larvae,postlarvae,

broodstock,

and

hatchery

probionts</title><secondary-title>Applied

and

Environmental

Microbiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Applied

and

Environmental

Microbiology</full-title></periodical><pages>2592-2597</pages><volume>6</volume><number>65</number><dates><year>1999</year></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>FAO</Author><Year>2003</Year><RecNum>78</RecNum><record><rec-number>78</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645407734">78</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>FAO</author></authors></contributors><titles><title>Healthmanagementandbiosecuritymaintenanceinwhiteshrimp(Penaeusvannamei)hatcheriesinLatinAmerica</title></titles><dates><year>2003</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[71,72]。卤虫等鲜活饵料在虾类育苗环节起到关键作用，已有研究报道，卤虫可能携带WSSV、IMNV、HPV等虾类病毒，还存在被多种致病性弧菌感染的风险，也可能携带EHP并进行传播ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王一婷</Author><Year>2020</Year><RecNum>66</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[60]</style></DisplayText><record><rec-number>66</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645351418">66</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="中文期刊">40</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王一婷</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">史成银</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">隋丽英</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">叶仕根</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">董宣</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">黄倢</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">卤虫作为生物饵料传播虾类病原风险的研究进展</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">中国动物检疫</style></secondary-title></titles><pages>61-67</pages><volume>37</volume><number>11</number><dates><year>2020</year></dates><urls></urls><electronic-resource-num>10.3969/j.issn.1005-944X.2020.11.013</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[60]。潍坊市北部沿海地区，有大面积的盐碱地，因地下蕴藏丰富的卤淡水资源，近年来被开采用于鱼类及对虾养殖，其中冬季温棚高密度养殖是当地内陆地区对虾养殖的重要模式之一，该模式采用地下卤淡水勾兑作为养殖用水，利用塑料温棚结合地源热泵或电厂余热为热源调控水温，广泛利用当地的卤虫、毛虾（Acetechinensis）或贝类等为鲜活饲料，虾苗经过分级暂养后进入养成池，最高养成密度可达1000尾/m3水体，产量达20kg/m3水体。潍坊北部室内凡纳滨养殖历史较早，具有代表性，但养殖成功率不稳定，大批量死亡、生长缓慢等问题时常发生。2020年11月中下旬，潍坊滨海开发区及寿光市室内养殖凡纳滨对虾出现突发性死亡现象。为查明凡纳滨对虾的发病原因，本研究调查了辖区5家养殖场的对虾、饲料、虾苗等样品，采用分子生物学检测方法分析了上述样品中6种主要对虾病原的感染情况ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>韩琳</Author><Year>2018</Year><RecNum>148</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[69]</style></DisplayText><record><rec-number>148</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1648606906">148</key></foreign-keys><ref-typename="中文期刊">40</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">韩琳</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王秀华</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">杨冰</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">万晓媛</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">武和英</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">张庆利</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">黄倢</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">一例日本对虾暴发性死亡的病原分析</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">水产学报</style></secondary-title></titles><pages>11</pages><volume>42</volume><number>3</number><dates><year>2018</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[69]，并进行可培养细菌的分离鉴定，对可疑病原菌进行菌株的毒性分析，以阐明本次凡纳滨对虾暴发性死亡的病因，为凡纳滨对虾的健康养殖及疾病防控研究提供参考。1.2材料和方法1.2.1样品采集地及样品采集信息潍坊市北部对虾养殖场，主要集中在莱州湾南岸的昌邑市、滨海新区及寿光市的沿海及滩涂地区，冬季养殖大棚多为陆基养殖，全部采用地下水养殖，大棚面积在500m2～1000m2，棚内养殖池大小在20m2～30m2，池深平均在1.5m左右，养殖池通过气石或纳米管曝气，养殖用水为地下卤水与淡水混合，盐度在10～30不等。虾苗经过中间暂养后，最终放苗密度在500尾/m2～1000尾/m2，养成期投喂配合饵料与冰鲜饵料，其中配合饵料日投喂次2～4次，冰鲜料投喂2次。根据饵料的剩余量，调整投喂数量，饵料系数在1.2左右。2020年12月共采集样品19个，其中成虾、幼虾、虾苗及饲料各占52.63%、15.79%、5.26%、26.32%，共来源于5个养殖场。样品采集地点分布见图2-1，样品采集信息见表2-1。于采样点1采集养殖水样3L，用于水质检测，海水对照样品取自青岛近海，用双蒸水调剂成与养殖用水相同的盐度。于采样点1及采样点2采取正常对虾、发病对虾及冰鲜饵料样品，于采样点3、4、5，采集发病样品，用于病原检测，对虾样品每个池随机采集3尾，将每尾对虾的虾鳃、肝胰腺组织并样，每个冰鲜饵料样品随机采集3个小样进行并样成一个待测样品。对虾及饵料样品分别用95%乙醇及RNAlater(TIANGEN,中国北京)进行固定保存。使用TIANampMarineAnimalsDNAKit(TIANGEN,中国北京)提取对虾及饲料样品基因组DNA，-20℃保存。同样取保存于RNAlater中的样品，使用RNApreppureTissueKit(TIANGEN，中国北京)提取基因组RNA，-80℃保存ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>武和英</Author><Year>2019</Year><RecNum>147</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>147</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1648603597">147</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">武和英</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王秀华</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">杨冰</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">于党辉</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">黄倢</style><styleface="normal"font="default"size="100%"></style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">一对虾养殖场的多病原跟踪</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">渔业科学进展</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>渔业科学进展</full-title></periodical><pages>11</pages><volume>40</volume><number>4</number><dates><year>2019</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[4]。图2-1样品采集地Fig.2-1Locationsofsamplingsite表2-1样品采集信息Tab.2-1Informationofsampling采样点编号Codeofsamplingsite对虾体长(cm)Bodylengthofshrimp饵料种类Typeofshrimpfeed水源Watersource对虾症状Symptomsofshrimp18.2±0.36AP+FAB+FWHM24.03±0.45AP+FA+FACB+FWHM33.93±0.45AP+FA+FACB+FWHM411.63±0.40AP+FA+FACB+FWHM53.57±0.47AP+FAB+FWPG注：AP：人工饲料；FA：冰冻卤虫；FAC：冰冻毛虾；B：盐水；FW：淡水；HM：高死亡率；PG：生长缓慢Notes:AP:Artificialpellet;FA:Frozenartemia;FAC:FrozenAceteschinensis;B:Brine;FW:Freshwater;HM:Highmortality;PG:Poorgrowth1.2.2水质调查水样常量元素（Na+、Mg2+、Ca2+、K+、Sr2+、CI-、SO42-、Br-、F-、HCO3-、CO32-）、重金属（Cu2+、PbM+、Ni2+、Zn2+、HgM+、CrM+、CdM+）、挥发性酚、氰化物含量、总碱度及总硬度分析委托山东省物化探勘查院岩矿测试中心进行，盐度、pH、采用YSI556（美国赛莱默）多参数水质测定仪检测。1.2.3弧菌数定量随机抽取采样点1的发病虾3只，在无菌环境下，解剖称取样品虾的部分肝胰腺、中肠道，分别放入不同离心管中，加入10倍质量的PBS研磨成匀浆，10倍梯度稀释后涂布于TCBS平板。同样取该采样点养殖池中层水样用PBS进行10倍梯度稀释，取100ul涂布于TCBS平板，所有涂布的TCBS平板于28℃恒温培养箱中培养24h后进行计数，统计弧菌的数量，推算样品虾肝、肠道及水体中的弧菌密度。以同样方法取附近养殖场的3只正常虾及水样进弧菌数定量作为对照。1.2.4细菌分离鉴定针对4个养殖场采集对虾及饵料样品，在无菌条件下解剖病虾和研磨饵料样品，在2216E平板和TCBS平板上进行细菌划线分离。将分离纯化后的细菌进行编号，-80℃保存。采用16SrRNA进行细菌比对鉴定ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Bikrol</Author><Year>2010</Year><RecNum>8</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[73]</style></DisplayText><record><rec-number>8</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">8</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Bikrol,A.</author><author>Singh,S.K.</author></authors></contributors><titles><title>CharacterizationofBradyrhizobiumStrainsIsolatedfromDifferentVarietiesofSoybeanwith16SrDNARFLPfromAgriculturalLandofMadhyaPradesh,India</title><secondary-title>IndianJournalofMicrobiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>IndianJournalofMicrobiology</full-title></periodical><dates><year>2010</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[73]。扩增产物由生工生物工程有限公司测序，所得序列在NCBI数据库中进行比对，待鉴定菌种对比的菌株相似率大于99.0%判定为同一个种，记为鉴定成功，用于统计分析。1.2.5病原检测对WSSV、IHHNV和AHPND的检测使用OIE推荐的套式PCR方法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>OIE</Author><Year>2019</Year><RecNum>4</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[74]</style></DisplayText><record><rec-number>4</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">4</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>OIE</author></authors></contributors><titles><title>ManualofDiagnosticTestsforAquaticAnimals.WorldOrganisationfor AnimalHealth</title></titles><dates><year>2019</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[74]，使用文献报道的方法对EHP、CMNV及DIV1进行检测ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[75-77]。各种病原的引物序列见表2-2。表2-26种病原检测的引物序列Tab.2-2Primersetsusedindetectingpathogens病原pathogen检测方法detectionmethod引物primerset引物序列(5’-3’)primersequence产物片段大小(bp)sizeofPCRproductWSSV套式PCRnestPCR146F1ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG1447146R1TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA146F2GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA941146R2TACGGCAGCTGCTGCACCTTGIHHNV常规PCRtranditionalPCR389FCGGAACACAACCCGACTTTA389389RGGCCAAGACCAAAATACGAA309FTCCAACACTTAGTCAAAACCAA309309RTGTCTGCTACGATGATTATCCAVpAHPND套式PCRnestPCRAP4-F1ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC1269AP4-R1ACGATTTCGACGTTCCCCAAAP4-F2TTGAGAATACGGGACGTGGG230AP4-R2GTTAGTCATGTGAGCACCTTCEHP套式PCRnestPCRSWP-1FTTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT514SWP-1RCACGATGTGTCTTTGCAATTTTCSWP-2FTTGGCGGCACAATTCTCAAACA148SWP-2RGCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGACMNV套式PCRnestPCRCMNV-7F1AAATACGGCGATGACG619CMNV-7R1ACGAAGTGCCCACAGACCMNV-7F2CACAACCGAGTCAAACC165CMNV-7R2GCGTAAACAGCGAAGGDIV1套式PCRnestPCRDIV1-F1GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT457DIV1-R1TCGTTTCGGTACGAAGATGTADIV1-F2CGGGAAACGATTCGTATTGGG129DIV1-R2TTGCTTGATCGGCATCCTTGA1.2.6可疑病原菌的PirAB检测对所分离的弧菌进行细菌毒力基因PirA、PirB检测，应用引物见表2-3。对照组为携带PirA、PirB基因的副溶血弧菌。PCR反应体系及程序参照HanADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Han</Author><Year>2015</Year><RecNum>24</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[78]</style></DisplayText><record><rec-number>24</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">24</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Han,J.E.</author><author>Tang,K.F.J.</author><author>Tran,L.H.</author><author>Lightner,D.V.</author></authors></contributors><titles><title>Photorhabdusinsect-related(Pir)toxin-likegenesinaplasmidofVibrioparahaemolyticus,thecausativeagentofacutehepatopancreaticnecrosisdisease(AHPND)ofshrimp</title><secondary-title>DiseasesofAquaticOrganisms</secondary-title></titles><periodical><full-title>DiseasesofAquaticOrganisms</full-title></periodical><pages>33-40</pages><volume>113</volume><number>1</number><dates><year>2015</year></dates><isbn>0177-5103 1616-1580</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.3354/dao02830</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[78]、DangtipADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Dangtip</Author><Year>2015</Year><RecNum>25</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[79]</style></DisplayText><record><rec-number>25</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">25</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Dangtip,Sirintip</author><author>Sirikharin,Ratchanok</author><author>Sanguanrut,Piyachat</author><author>Thitamadee,Siripong</author><author>Sritunyalucksana,Kallaya</author><author>Taengchaiyaphum,Suparat</author><author>Mavichak,Rapeepat</author><author>Proespraiwong,Porranee</author><author>Flegel,TimothyW.</author></authors></contributors><titles><title>AP4methodfortwo-tubenestedPCRdetectionofAHPNDisolatesofVibrioparahaemolyticus</title><secondary-title>AquacultureReports</secondary-title></titles><periodical><full-title>AquacultureReports</full-title></periodical><pages>158-162</pages><volume>2</volume><dates><year>2015</year></dates><isbn>23525134</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.aqrep.2015.10.002</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[79]。表2-3PirA、PirB基因检测引物序列Tab.2PrimersetsusedindetectingPirA、PirBgene引物primerset引物序列(5’-3’)primersequence产物片段大小(bp)sizeofPCRproductVpPirA-284FTGACTATTCTCACGATTGGACTG284VpPirA-284RCACGACTAGCGCCATTGTTAVpPirB-392FTGATGAAGTGATGGGTGCTC392VpPirB-392RTGTAAGCGCCGTTTAACTCAAP4-F1ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC1269AP4-R1ACGATTTCGACGTTCCCCAAAP4-F2TTGAGAATACGGGACGTGGG230AP4-R2GTTAGTCATGTGAGCACCTTC1.2.7数据处理试验数据采用平均数±标准方差（x±s，n=3）的方法来表示，运用Excel2010和软件SPSS17.0对数据进行分析。1.3结果1.3.1养殖场1水质调查养殖场1水中主要元素含量见表2-4，水中有害物质含量见表2-5。表2-4盐碱水主要元素含量检测结果 Tab.2-4Thecontentofmainchemicalelementinsaline-alkalinewater水源watersource主要元素mainchemicalelementNa+Mg2+Ca2+K+Sr2+CI-SO42-Br-F-HCO3-salinitypH海水seawater7848.9943.5295.8290.75.114093.31975.749.01.02104.025.57.5养殖用水aquaculturewater6531.91209.76529.35196.064.8913306.31628.5651.760.22304.7025.57.4表2-5盐碱水重金属、挥发性酚和氰化物含量Tab.2-5Thecontentofheavymeatalion,volatilephenolandvolatilephenolinsaline-alkalinewater检测指标detectingparametersCu2+PbM+Ni2+Zn2+HgM+CrM+CdM+挥发性酚volatilephenol氰化物cyanide渔业水质标准限量(mg/L)limitedbyWaterqualitystandardforfisheries0.010.050.050.10.00050.10.0050.0050.005养殖水(mg/L)aquaculturewater<0.006<0.07<0.007<0.004<0.00004<0.004<0.005//注：/表示没有检出；M+表示对应元素的所有价态Notes:/meansnoresult;M+meansallvalence1.3.2弧菌数定量发病对虾肠道、肝胰腺及水中的弧菌数均高于附近养殖场的正常虾，肠道、肝胰腺及水中弧菌数的对数值分别高达7.31、5.76、4.89，均比正常虾的弧菌数有明显升高。对比结果如图2-2所示。1.肠道;2.肝胰腺;3.水1.Intestine;2.Hepatopancreas;3.Water图2-2对虾肠道、肝胰腺及养殖池水弧菌数Fig.2-2Vibriocountsinshrimpintestines,hepatopancreasandwater1.3.3潜在细菌性病原的检出情况从采集的对虾、鲜活饵料及养殖池水中，共分离到细菌单菌落81个，对所分离的细菌进行初步鉴定，共成功鉴定出菌株79株，分属于18属33种。其中，鉴定出的7种弧菌量占总菌量的40.86%，可疑病原菌中Vibrioalginolyticus和Vibrioowensii含量最高，分别占弧菌总量的39.66%、29.96%。购自海南的虾苗中溶藻弧菌和美人鱼发光杆菌为优势菌株，存在致病风险。采集样品的细菌分离鉴定结果详情见表2-6。表2-6采集样品中可培养细菌分离鉴定结果Tab.2-6Identificationresultsofculturablebacteriaincollectedsamples属名genus养殖场1bacteriaisolatedfrom1farm养殖场2bacteriaisolatedfrom2farm养殖场3bacteriaisolatedfrom3farm养殖场4bacteriaisolatedfromDfarm交替单胞菌属AlteromonasA.macleodii科贝特氏菌CobetiaC.marina盐单胞菌属HalomonasH.alkaliphila、H.neptuniaH.alkaliphila咸海鲜球菌属JeotgalicoccusJ.nanhaiensis乳球菌属LactococcusL.garvieae微杆菌属MicrobacteriumM.flavescens海洋球型菌属OceanisphaeraO.marina副球菌属ParacoccusP.seriniphilusP.seriniphilusP.seriniphilus发光杆菌属PhotobacteriumP.damselaeP.damselae罗威登斯菌属ProvidenciaP.vermicola假交替单胞菌属PseudoalteromonasP.spongiaeP.spongiae假鲁杰氏菌属PseudoruegeriaP.aquimaris嗜冷杆菌属PsychrobacterP.alimentarius、P.celer、P.maritimus、P.namhaensisP.celer、P.faecalis、盐水球菌属SalinicoccusS.halodurans萨维奇菌属SavageaS.faecisuis葡萄球菌属StaphylococcusS.equorum、S.haemolyticusS.nepalensis、S.saprophyticus黄杆菌属TenacibaculumT.lutimarisT.lutimarisT.lutimarisT.discolor、T.lutimaris弧菌属VibrioV.alginolyticus、V.brasiliensis、V.harveyi、V.mediterranei、V.owensii、V.parahaemolyticusV.alginolyticus、V.mediterranei、V.owensiiV.alginolyticus、V.mediterranei、V.owensiiV.kanaloae、1.3.4对虾主要病原检出情况对采集的对虾及饲料样品分别进行EHP虾肝肠胞子虫、VpAHPND细菌分子及WSSV、IHHNV、D1V1、CMNV4种病毒检测。检测结果如表2-7所示，各采样点所取全部样品均检出CMNV，采样点2和采样点5的虾中检出EHP阳性，5个采样点的样品均检出不同程度的DIV1感染，WSSV、IHHNV、AHPND均无检出。表2-7样品病原检测结果Tab.2-7Pathogendetectionresultsofsamples采样点samplingpoint样品种类sampletype样品来源samplesource病原pathogenWSSVEHPIHHNVDIV1AHPNDCMNV1健康虾池1+池2+发病虾池3+池4+-+鲜饵大卤虫++小卤虫++卤虫卵+虾苗海南+2健康虾池2-++-+-+发病虾池3++-+鲜饵大卤虫+-++毛虾++-+3发病虾池1++-+4发病虾池1+-++5生长缓慢虾池1-+++注：*表示虾苗；“-”表示阴性；“+”表示套式PCR仅有第二轮检出阳性；“++”表示套式PCR一轮、二轮均为阳性Notes:*meansshrimplarvae;"-"meansnegative;"+"meansthatonlythesecondroundofnestedPCRispositive;"++"meansthatboththefirstandsecondroundsofnestedPCRarepositive1.3.5主要可疑细菌性病原的PirAB检测7株可疑细菌性病原PirAB检测结果如图2-3所示，检测结果均为阴性，表明7株可疑病原菌均不携带两种毒力基因。1.4讨论凡纳滨对虾是包括中国在内的许多国家目前养殖的经济上最重要的对虾之一ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>FAO</Author><Year>2020</Year><RecNum>47</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[80]</style></DisplayText><record><rec-number>47</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">47</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>FAO</author></authors></contributors><titles><title>FisheryandAquacultureStatistics2018/FAOannuaire</title><secondary-title>Statistiquesdespêchesetdel'aquaculture2018/FAOanuario</secondary-title></titles><periodical><full-title>Statistiquesdespêchesetdel'aquaculture2018/FAOanuario</full-title></periodical><dates><year>2020</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[80]，凡纳滨对虾产业受到细菌或病毒引起的各种疾病的极大限制ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Vogeley</Author><Year>2019</Year><RecNum>11</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[81]</style></DisplayText><record><rec-number>11</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">11</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Vogeley,JoanaLyra</author><author>Interaminense,JulianaAguiar</author><author>Buarque,DiegoSouza</author><author>daSilva,SuziannyMariaBezerraCabral</author><author>Coimbra,MariaRaquelMoura</author><author>Peixoto,SílvioMaurano</author><author>Soares,RobertaBorda</author></authors></contributors><titles><title>GrowthandimmunegeneexpressionofLitopenaeusvannameifedBacillussubtilisandBacilluscirculanssupplementeddietsandchallengedwithVibrioparahaemolyticus</title><secondary-title>AquacultureInternational</secondary-title></titles><periodical><full-title>AquacultureInternational</full-title></periodical><pages>1451-1464</pages><volume>27</volume><number>5</number><dates><year>2019</year></dates><isbn>0967-6120 1573-143X</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1007/s10499-019-00399-x</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[81]。病害的发生是由环境因子、病原微生物和机体自身免疫力相互作用的结果。本文针对潍坊滨海开发区及寿光市室内养殖凡纳滨对虾突发死亡开展了病原分子流行病学排查，研究结果显示发病凡纳滨对虾存在EHP、DIV1、CMNV感染，来自海南的虾苗样品感染CMNV，细菌分离鉴定结果显示海南虾苗中溶藻弧菌和美人鱼发光杆菌为优势菌，存在系统感染风险。鲜活饵料样品中也存在DIV1、CMNV感染，对养殖场的对虾养殖造成一定的影响。同时从发病对虾体内及养殖水体中分离出7种可疑病原菌，弧菌定量结果显示，发病对虾体内及水中的弧菌数均高于正常虾，表明当前凡纳滨对虾的养殖面临多种疾病风险。根据本文的病原检测及潜在细菌性病原的分析结果，结合发病症状，推测本次凡纳滨对虾出现突发性死亡的主要原因是弧菌感染所致，而EHP、DIV1、CMNV阳性感染可能会对对虾的发病起到一定的协同致病作用。养殖用虾苗携带致病原，表明对虾育苗场的育苗关键环节有待病原的排查与风险管控。图A为PirA基因PCR扩增结果;图B为PirB基因PCR扩增结果;图C为引物AP4-F1/R1PCR产物;图D为引物AP4-F2/R2PCR产物;M.DL2000DNA分子标准;1-7.分别为菌株V.mediterranei、V.brasiliensis、V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus、V.owensii、P.damselae;N.阴性对照;P.阳性对照Fig.APCRproductsofgenePirA;Fig.BPCRproductsofgenePirB;Fig.CPCRproductsofprimerAP4-F1/R1;Fig.DPCRproductsofprimerAP4-F2/R2;M.DL2000DNAMarker;1-7.bacterialstrainsV.mediterranei、V.brasiliensis、V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus、V.owensiiandP.damselae;N.negativecontrol;P.positivecontrol图2-3可疑细菌性病原PirA、PirB基因的PCR扩增结果Fig.2-3PCRproductsofgenePirAandPirBofsuspectedbacterialpathogensEHP最早在泰国的斑节对虾中发现ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Sriurairatana;</Author><Year>2004</Year><RecNum>35</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[82]</style></DisplayText><record><rec-number>35</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255iep25hvfs2js909a95drppz">35</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">KanokpornChayaburakul</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">;</style><styleface="normal"font="default"size="100%">GaryNash;PhusitPratanpipat;SiripornSriurairatana;</style></author><author>BoonsirmWithyachumnarnkul</author></authors></contributors><titles><title>Multiplepathogensfoundingrowth-retardedblacktigershrimpPenaeusmonodoncultivated inThailand</title><secondary-title>DISEASESOFAQUATICORGANISMS </secondary-title></titles><pages>89-96</pages><volume>60</volume><dates><year>2004</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[82]，是近年来对对虾养殖生产造成严重影响的疾病之一ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Thitamadee</Author><Year>2016</Year><RecNum>5</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[83]</style></DisplayText><record><rec-number>5</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="tp22fv2al552pmee52dvttwzs9wxt2zzvvev"timestamp="1644913977">5</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Thitamadee,Siripong</author><author>Prachumwat,Anuphap</author><author>Srisala,Jiraporn</author><author>Jaroenlak,Pattana</author><author>Salachan,PaulVinu</author><author>Sritunyalucksana,Kallaya</author><author>Flegel,TimothyW.</author><author>Itsathitphaisarn,Ornchuma</author></authors></contributors><titles><title>ReviewofcurrentdiseasethreatsforcultivatedpenaeidshrimpinAsia</title><secondary-title>Aquaculture</secondary-title></titles><periodical><full-title>Aquaculture</full-title></periodical><pages>69-87</pages><volume>452</volume><section>69</section><dates><year>2016</year></dates><isbn>00448486</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.aquaculture.2015.10.028</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[83]。有研究表明，EHP的致病率不高，但会导致对虾生长缓慢ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[30,84]。CMNV是于2014年在我国首次报道的一种新的RNA病毒，可引起对虾偷死病。CMNV在主要对虾养殖地区的广泛流行，造成严重经济损失。感染CMNV后，凡纳滨对虾发病较为缓慢，伴随着整个养殖周期。患病对虾表现为甲壳变软，肝胰腺萎缩且颜色变淡，部分腹节肌肉发白，患病对虾个体间体长存在大小不均的现象。观察本文发病的凡纳滨对虾外观症状，发现与感染该病的凡纳滨对虾症状存在差异，表明CMNV感染并非是本次凡纳滨对虾突发性死亡的主要原因ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Zhang</Author><Year>2014</Year><RecNum>6</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[3]</style></DisplayText><record><rec-number>6</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zrewsr0f59pdwfeazsb52e0uwww59z2v9xsv"timestamp="1645087392">6</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Zhang,Q.</author><author>Liu,Q.</author><author>Liu,S.</author><author>Yang,H.</author><author>Liu,S.</author><author>Zhu,L.</author><author>Yang,B.</author><author>Jin,J.</author><author>Ding,L.</author><author>Wang,X.%JJournalofGeneralVirology</author></authors></contributors><titles><title>Anewnodavirusisassociatedwithcovertmortalitydiseaseofshrimp</title></titles><pages>2700-2709</pages><volume>95</volume><number>Pt_12</number><dates><year>2014</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[3]。DIV1是一种新发疫病，能够导致对虾的高死亡率。2014年，Qiu等人从浙江某对虾养殖场采集患病凡纳滨对虾，通过研究对比，确认该病是由未知的新虹彩病毒引起的，并于2017年暂时将其命名为虾血细胞虹彩病ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>邱亮；陈蒙蒙；万晓媛；李晨</Author><Year>2017</Year><RecNum>37</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[85]</style></DisplayText><record><rec-number>37</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rpdet0zpoe255i