狂犬病课题申报书

狂犬病课题申报书一、封面内容

项目名称：狂犬病病毒新型疫苗及免疫机制研究

申请人姓名及联系方式：张华，zhanghua@

所属单位：国家传染病医学中心病毒研究所

申报日期：2023年10月26日

项目类别：应用基础研究

二．项目摘要

狂犬病作为一种由狂犬病病毒（RABV）引起的急性传染病，其致死率极高，一旦发病无有效治疗手段，因此疫苗预防是防控狂犬病的唯一有效途径。然而，现有狂犬病疫苗存在免疫原性不足、接种程序复杂等问题，亟需开发新型高效疫苗。本项目拟基于深度解析RABV抗原蛋白结构与功能的关系，结合新型佐剂技术，构建表达全病毒或关键抗原片段的重组腺病毒载体疫苗，并探索其免疫增强机制。研究将采用冷冻电镜技术解析RABV关键抗原（如G蛋白）的三维结构，结合分子动力学模拟预测其构象变化；通过基因编辑技术优化腺病毒载体骨架，降低免疫原性并提高递送效率；利用动物模型系统评估疫苗诱导的保护性免疫应答，并深入分析T细胞与B细胞协同作用的免疫机制。预期成果包括：获得高免疫原性的新型腺病毒载体疫苗原型，明确其作用靶点与免疫通路，为研发广谱、长效狂犬病疫苗提供理论依据和技术支撑。此外，本研究还将探索RABV感染期间免疫逃逸机制，为开发新型治疗性药物奠定基础。项目的实施将显著提升我国狂犬病防控能力，具有重大公共卫生意义。

三.项目背景与研究意义

狂犬病（Rabies）是一种由狂犬病病毒（RABV）引起的急性传染病，主要感染中枢神经系统，导致几乎100%的感染者死亡，且发病后缺乏有效的治疗手段。尽管全球范围内在狂犬病防控方面取得了显著进展，包括疫苗接种覆盖率提高和动物疫情管理加强，但狂犬病仍是严重威胁人类健康的公共卫生问题，尤其在发展中国家。根据世界卫生（WHO）的统计数据，每年约有5.9万人死于狂犬病，其中约95%的死亡病例发生在非洲和亚洲地区。这些数据凸显了狂犬病防控的紧迫性和重要性。

目前，狂犬病疫苗的研发和接种策略已经取得了长足的进步。传统的狂犬病疫苗主要包括灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗通过杀死病毒来诱导免疫应答，具有较高的安全性，但通常需要多次接种才能达到满意的免疫效果，且免疫持续时间相对较短。减毒活疫苗则利用弱化的活病毒诱导免疫应答，能够提供更持久的免疫保护，但存在一定的潜在风险，如病毒变异或免疫抑制等。然而，无论是灭活疫苗还是减毒活疫苗，都存在一些局限性，如免疫原性不足、接种程序复杂、生产成本高等问题，这些因素限制了疫苗的广泛应用和效果提升。

近年来，随着生物技术的快速发展，新型疫苗平台如腺病毒载体疫苗、mRNA疫苗等逐渐应用于狂犬病疫苗的研发。腺病毒载体疫苗利用腺病毒作为载体递送RABV抗原，能够高效诱导细胞免疫和体液免疫，具有免疫原性强、接种程序简单等优点。然而，腺病毒载体疫苗也存在一些挑战，如免疫原性可能受到宿主既往感染的影响、潜在的免疫原性过强等问题。因此，开发新型高效、安全的狂犬病疫苗仍然是当前研究的热点和难点。

从学术角度来看，深入解析RABV的抗原结构、免疫机制以及病毒逃逸机制对于开发新型疫苗和治疗方法具有重要意义。RABV的G蛋白是其主要的免疫原，能够诱导宿主产生中和抗体和细胞免疫应答。近年来，通过冷冻电镜等高分辨率技术解析RABVG蛋白的结构，为理解其功能和免疫机制提供了重要依据。然而，RABVG蛋白的构象变化、与宿主蛋白的相互作用以及免疫逃逸机制等方面仍存在许多未知问题。此外，RABV的复制和转录机制、病毒与宿主细胞的相互作用等也是当前研究的热点。深入解析这些机制不仅有助于开发新型疫苗，还为开发治疗性药物提供了理论基础。

从社会和经济角度来看，狂犬病的防控对于保障公共卫生安全、促进经济发展具有重要意义。狂犬病不仅威胁人类健康，还严重影响畜牧业发展，造成巨大的经济损失。据估计，全球每年因狂犬病导致的直接和间接经济损失高达数十亿美元。因此，开发新型高效、经济的狂犬病疫苗具有重要的社会经济价值。此外，狂犬病的防控还有助于提高公众的健康意识和自我保护能力，促进社会和谐稳定。

四.国内外研究现状

狂犬病病毒（RABV）的研究历史悠久，但在疫苗开发、免疫机制及病毒致病机理等方面仍面临诸多挑战。国内外学者在狂犬病领域已经取得了显著进展，特别是在疫苗研制和基础研究方面。然而，现有研究仍存在一些问题和空白，亟待进一步探索。

在疫苗研制方面，传统的灭活疫苗和减毒活疫苗是目前主要的狂犬病疫苗。灭活疫苗安全性高，但需要多次接种，免疫持续时间较短。例如，人用狂犬病疫苗（HRV）通常需要接种多次，且免疫保护期有限。减毒活疫苗免疫持续时间较长，但存在一定的潜在风险，如病毒变异或免疫抑制等。例如，贝格尔疫苗（Begleitervaccine）是一种常用的减毒活疫苗，但其免疫原性相对较低，且存在一定的免疫风险。近年来，随着基因工程和生物技术的发展，新型疫苗平台如腺病毒载体疫苗、mRNA疫苗等逐渐应用于狂犬病疫苗的研发。腺病毒载体疫苗利用腺病毒作为载体递送RABV抗原，能够高效诱导细胞免疫和体液免疫，具有免疫原性强、接种程序简单等优点。例如，以色列疫苗公司Inov-8开发的腺病毒载体狂犬病疫苗在动物实验中表现出良好的免疫效果。mRNA疫苗则通过编码RABV抗原的mRNA进入宿主细胞，直接翻译产生抗原，诱导免疫应答。例如，美国Moderna公司开发的mRNA狂犬病疫苗在临床前研究中显示出良好的免疫原性和安全性。

尽管新型疫苗平台在狂犬病疫苗研制方面取得了一定的进展，但仍存在一些问题和挑战。首先，腺病毒载体疫苗的免疫原性可能受到宿主既往感染的影响，因为腺病毒在自然界中广泛存在，宿主可能已经存在针对腺病毒的抗体，从而影响疫苗的免疫效果。其次，腺病毒载体疫苗的潜在免疫原性过强，可能导致宿主产生免疫反应，增加疫苗的安全性风险。mRNA疫苗虽然具有高效、安全等优点，但在递送和稳定性方面仍面临挑战，例如mRNA易被核酸酶降解，需要特殊的递送载体和保护策略。

在基础研究方面，国内外学者对RABV的基因组、蛋白结构、复制和转录机制等方面进行了深入研究。RABV的基因组为单股负链RNA，长约11kb，编码5个蛋白质：N、P、M、G和L。其中，N蛋白为病毒衣壳蛋白，P和M蛋白组成病毒核衣壳，L蛋白为RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）复合物的组分，G蛋白为病毒表面的糖蛋白，负责病毒附着和侵入宿主细胞。近年来，通过冷冻电镜等高分辨率技术解析RABV关键抗原（如G蛋白）的三维结构，为理解其功能和免疫机制提供了重要依据。例如，2018年，中国科学院大连化学物理研究所的研究团队解析了RABVG蛋白的二聚体结构，揭示了其与宿主细胞受体的结合模式。此外，RABV的复制和转录机制也是当前研究的热点。RABV的复制和转录过程高度保守，与逆转录病毒类似，但具体机制仍存在许多未知问题。例如，RABV的L蛋白如何识别RNA模板、如何合成正链RNA等机制仍需进一步研究。

然而，在RABV免疫逃逸机制、病毒与宿主细胞的相互作用等方面仍存在一些研究空白。RABV在感染过程中能够逃避免疫系统的监控，其机制尚不明确。例如，RABVG蛋白如何避免被MHC-I途径降解、如何抑制NK细胞活性等机制仍需深入研究。此外，RABV与宿主细胞的相互作用也是当前研究的热点。RABV需要通过宿主细胞膜进入细胞质，然后通过核孔进入细胞核进行复制和转录。然而，RABV如何识别和利用宿主细胞膜、如何穿过核孔等机制仍需进一步研究。

在治疗方面，目前尚无有效的狂犬病治疗方法。虽然有一些治疗案例报道，但成功率极低。因此，开发新型治疗性药物是当前研究的重要方向。例如，一些研究小组正在探索使用单克隆抗体、干扰素等药物进行治疗。然而，这些药物的治疗效果仍需进一步验证。

综上所述，国内外在狂犬病领域已经取得了显著进展，但在疫苗研制、免疫机制及病毒致病机理等方面仍面临诸多挑战。深入解析RABV的抗原结构、免疫机制以及病毒逃逸机制对于开发新型疫苗和治疗方法具有重要意义。因此，本项目拟基于深度解析RABV抗原蛋白结构与功能的关系，结合新型佐剂技术，构建表达全病毒或关键抗原片段的重组腺病毒载体疫苗，并探索其免疫增强机制，具有重要的理论意义和应用价值。

五.研究目标与内容

本项目旨在通过多学科交叉approach，深入解析狂犬病病毒（RABV）的致病机制与免疫应答，并在此基础上开发新型高效、安全的狂犬病疫苗及阐明其作用机制，最终为狂犬病的防控提供创新性的策略和理论依据。研究目标与内容具体如下：

1.**研究目标**

(1)**总体目标**：构建并评价一种基于重组腺病毒载体的新型狂犬病疫苗，阐明其诱导免疫保护的具体机制，揭示RABV关键抗原（尤其是G蛋白）的免疫原性及构象变化规律，为开发广谱、长效、安全的狂犬病疫苗提供关键的理论支撑和技术平台。

(2)**具体目标**：

a.**结构解析与抗原表位识别**：解析狂犬病病毒主要衣壳蛋白（N蛋白）和糖蛋白（G蛋白）的高分辨率三维结构，特别是G蛋白在天然感染或免疫应答过程中可能存在的不同构象状态，并通过生物信息学和实验方法（如肽段扫描、ELISA、细胞结合实验）精确定位关键的B细胞表位和T细胞表位（包括MHC-I和MHC-II限制性表位）。

b.**新型疫苗构建与优化**：基于已识别的关键抗原表位，设计并构建表达单一或组合抗原（如N-G双表达、多表位融合蛋白）的重组腺病毒载体疫苗。同时，探索新型佐剂（如TLR激动剂、CD40L激动剂等）的应用，优化疫苗配方，以增强抗原递送效率和免疫应答强度，特别是细胞免疫。

c.**免疫机制研究**：通过建立完善的动物模型（包括小鼠、犬等），系统评价新型腺病毒载体疫苗的免疫原性、安全性及保护力。利用流式细胞术、ELISPOT、免疫组化、免疫荧光等技术，深入分析疫苗诱导的体液免疫（抗体类型、滴度、中和活性）和细胞免疫（特异性T细胞亚群分化、细胞因子分泌、细胞毒性T细胞活性）的动态变化，阐明不同免疫组分在提供保护性免疫中的作用及协同机制。

d.**结构与功能关联研究**：将解析的G蛋白等关键抗原的晶体结构或计算模拟结构，与疫苗诱导的免疫应答数据进行关联分析，验证结构特征（如表位构象、柔性区域）与免疫原性、免疫逃逸能力之间的关系，为疫苗设计和改进提供结构生物学指导。

e.**免疫逃逸机制探索**：初步探究RABV在自然感染中可能存在的免疫逃逸策略，例如通过G蛋白等表面蛋白的构象变化或与其他宿主蛋白的相互作用来躲避免疫监视，为设计能够克服逃逸机制的新型疫苗提供线索。

2.**研究内容**

(1)**狂犬病病毒关键抗原的结构与功能研究**：

***研究问题**：狂犬病病毒衣壳蛋白N和糖蛋白G的关键结构域及其在病毒感染、免疫逃逸中的作用是什么？这些蛋白的构象变化如何影响其免疫原性？

***研究假设**：RABVN蛋白具有高度保守的构象，是有效的T细胞抗原；G蛋白的N端和C端特定区域存在关键的B细胞表位和T细胞表位，其构象状态在感染早期和免疫应答过程中发生改变，影响疫苗诱导的保护性免疫。

***具体措施**：利用X射线晶体学或冷冻电镜技术解析N蛋白和G蛋白的高分辨率结构；通过分子动力学模拟研究G蛋白在模拟生理环境下的动态构象变化；利用定点突变和结构生物学手段验证关键氨基酸残基对结构稳定性和抗原性的影响。

(2)**新型重组腺病毒载体疫苗的构建与表征**：

***研究问题**：如何选择合适的腺病毒载体骨架和优化抗原表达策略，以最大化疫苗的免疫原性和安全性？新型佐剂能否有效增强疫苗效果？

***研究假设**：通过基因工程手段改造腺病毒骨架，降低其免疫原性和潜在毒性；同时，将经过表位优化的N和/或G蛋白基因克隆至腺病毒表达载体中，联合使用新型佐剂能够显著提升疫苗诱导的免疫应答强度和持久性。

***具体措施**：筛选并改造复制缺陷型腺病毒载体（如腺病毒5、chimpanzeeadenovirus71等）；设计合成包含关键免疫表位的N-G融合基因或多表位嵌合基因；构建重组腺病毒表达载体并进行包装、纯化；对疫苗原液进行生物学活性、纯度、滴度及潜在毒性（如溶血试验、细胞毒性测试）的全面表征。

(3)**新型狂犬病疫苗的免疫原性、安全性与保护力评价**：

***研究问题**：新型腺病毒载体疫苗在不同动物模型中能否诱导强烈的、持续的体液免疫和细胞免疫？其保护力如何？安全性如何？

***研究假设**：与现有疫苗相比，新型腺病毒载体疫苗能够诱导更广谱、更强、更持久的特异性抗体（特别是中和抗体）和T细胞应答；在动物挑战实验中能提供更有效的保护；在规定剂量下具有良好的安全性，无明显的免疫原性相关副作用。

***具体措施**：建立小鼠和犬狂犬病感染模型；将构建的疫苗进行不同剂量、不同途径的免疫动物实验，设立空白对照、阴性对照（如安慰剂或传统疫苗）；定期采集血清和脾脏等样本，检测总抗体水平、中和抗体滴度、特异性抗体亚型；通过流式细胞术分析外周血和淋巴（如脾脏、淋巴结）中CD4+、CD8+T细胞的分群、增殖、细胞因子（如IFN-γ,IL-4,IL-10）分泌情况；进行淋巴结和脑的免疫化学染色，观察T细胞浸润情况；在完成免疫程序后，用强毒株进行攻击，观察动物的存活率、发病时间、临床症状，评估疫苗的保护效果；密切监测免疫动物的体重变化、行为观察、血液生化指标，评估疫苗的安全性。

(4)**疫苗诱导免疫应答的机制研究**：

***研究问题**：疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫之间存在怎样的协同关系？关键免疫细胞亚群（如CD8+T细胞）在保护性免疫中扮演什么角色？

***研究假设**：新型疫苗诱导的保护性免疫是体液免疫和细胞免疫协同作用的结果，其中高滴度的中和抗体和有效的细胞毒性T细胞应答是关键；CD8+T细胞在清除病毒、抵抗感染中起核心作用。

***具体措施**：利用ELISPOT技术检测特异性细胞因子（如IFN-γ）的产生细胞数；通过细胞毒性试验（如LDH释放试验、流式细胞术胞质染色）评估效应T细胞对病毒靶细胞的杀伤能力；分析不同免疫阶段淋巴结和脾脏中免疫细胞（B细胞、T细胞亚群、巨噬细胞等）的表型变化和功能状态；采用相关基因芯片或转录组测序技术，分析疫苗刺激后免疫细胞内的基因表达谱变化，深入理解免疫应答的调控网络。

(5)**狂犬病病毒免疫逃逸机制的初步探索**：

***研究问题**：RABV在感染过程中是否存在通过抗原变异或分子伪装等策略逃避免疫监视的现象？

***研究假设**：RABVG蛋白在感染过程中可能发生构象变化或与宿主蛋白相互作用，从而影响其被MHC-I途径提呈或被NK细胞识别，实现免疫逃逸。

***具体措施**：收集临床分离的RABV毒株，比较其G蛋白基因序列与标准毒株的差异；通过免疫荧光和共聚焦显微镜观察感染细胞中G蛋白与其他宿主蛋白（如MHC-I分子、TAP、NK细胞受体等）的共定位情况；利用体外细胞模型和动物模型，研究G蛋白不同变异体对免疫应答的影响；探索抑制RABV免疫逃逸的策略，为疫苗设计提供新思路。

六.研究方法与技术路线

1.**研究方法与实验设计**

本项目将采用多学科交叉的研究方法，整合结构生物学、分子生物学、免疫学、病毒学及动物模型技术，系统开展狂犬病病毒新型疫苗及免疫机制的研究。具体方法与实验设计如下：

(1)**结构生物学研究方法**：

***方法**：X射线晶体学、冷冻电子显微镜（Cryo-EM）、分子动力学模拟（MD）。

***实验设计**：针对RABV衣壳蛋白N和糖蛋白G，进行基因克隆、表达纯化、晶体筛选与培养；利用高通量晶体筛选技术获得高质量晶体；使用同步辐射或旋转阳极X射线源收集衍射数据；解析N蛋白和G蛋白的高分辨率晶体结构（分辨率目标3.0Å或更高）；对G蛋白结构进行MD模拟，研究其在生理条件下的动态构象变化和多态性；结合结构信息，利用生物信息学工具预测并验证B细胞表位和T细胞表位。

(2)**重组腺病毒载体构建与表达调控**：

***方法**：基因克隆、载体构建（基于pShuttle等腺病毒穿梭载体系统）、酶切鉴定、PCR验证、质粒提取、大肠杆菌感受态细胞扩增、腺病毒包装、纯化。

***实验设计**：根据结构生物学确定的抗原表位信息，设计合成编码表位优化或融合的多表位抗原的基因序列；将目的基因亚克隆入腺病毒穿梭载体，经酶切和PCR验证后转染腺病毒包装细胞；在辅助病毒系统支持下包装产生重组腺病毒；通过滴定实验测定病毒滴度，并进行纯化；对纯化后的疫苗进行质量鉴定（如空壳病毒比例、结构蛋白表达分析等）。

(3)**免疫学评价方法**：

***方法**：细胞培养、ELISA（检测总抗体、特异性抗体、细胞因子）、流式细胞术（FACS）、ELISPOT、WesternBlot、免疫荧光（IF）、免疫组化（IHC）。

***实验设计**：

***抗体检测**：免疫动物后，收集血清，采用ELISA检测总抗体水平（如IgG、IgM、IgA）；利用重组RABV抗原或合成肽段包被ELISA板，检测特异性中和抗体滴度；通过ELISA或WesternBlot检测特异性抗体亚型（如IgG1/IgG2a比例）。

***细胞免疫检测**：分离免疫动物的脾细胞或淋巴结细胞，利用FACS检测CD4+、CD8+T细胞的分群（如CD8α、CD27、CD127等标志物），分析T细胞亚群比例变化；通过ELISPOT检测CD4+和CD8+T细胞分泌的特异性细胞因子（如IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-4,IL-10）；进行体外细胞增殖试验和细胞毒性试验（如LDH释放法、细胞穿孔素/颗粒酶染色）；通过IF和IHC检测脾脏、淋巴结、肝脏等中T细胞的浸润定位和活化状态。

(4)**动物模型研究方法**：

***方法**：SPF级小鼠、犬模型饲养管理、免疫程序设计、病毒攻击、临床症状观察、样本采集、病理学检查。

***实验设计**：

***免疫学评价模型**：选择C57BL/6小鼠（用于快速评价疫苗免疫原性）和Beagle犬（作为更接近人类的largeanimal模型，用于评估疫苗的保护力和安全性，并模拟临床接种程序）。设计分组免疫方案（不同剂量疫苗、不同佐剂、对照组），按预定程序（如肌肉注射、皮下注射）接种；定期采血、采脾脏等样本，采用上述免疫学方法检测免疫应答。

***保护力评价模型**：在完成免疫程序后，将免疫动物和对照动物用高致病性狂犬病病毒株（如ChallengeStrn）进行攻击；密切观察记录动物的体重变化、行为异常（如流涎、瘫痪、攻击性增强）、体温等临床症状；设定攻击后观察期，记录动物存活情况及死亡时间；存活动物在规定时间点处死，采集脑进行病理学检查（如染色观察是否存在神经元炎症、嗜神经细胞包涵体）和病毒学检测（如RT-PCR、印迹）；计算保护率。

***安全性评价模型**：密切监测免疫期间动物的体重、饮食、行为、粪便性状；定期检测血液生化指标（肝功能、肾功能、血常规等）；必要时进行尸检，观察主要脏器病理变化。

(5)**数据分析方法**：

***方法**：统计学软件（如GraphPadPrism,SPSS）、生物信息学工具、结构生物学分析软件。

***实验设计**：所有实验数据将采用合适的统计学方法进行检验（如t检验、ANOVA等），以评估差异的显著性。抗体滴度、细胞频率等数据将进行非参数转换或对数转换以满足统计要求。结构数据将使用Phylosophic等软件进行分析。免疫细胞表型、细胞因子分泌等数据将采用多因素分析或相关性分析。实验结果将以表形式清晰展示。

2.**技术路线**

本项目的技术路线遵循“基础研究-应用开发-机制验证”的逻辑顺序，分为以下几个关键阶段，各阶段环环相扣，相互支撑：

(1)**阶段一：关键抗原结构与功能解析(约6个月)**

***步骤1.1**：获取并纯化RABVN蛋白和G蛋白。

***步骤1.2**：利用X射线晶体学或Cryo-EM解析N蛋白和G蛋白的高分辨率结构。

***步骤1.3**：通过分子动力学模拟研究G蛋白的动态构象。

***步骤1.4**：结合生物信息学和实验方法（如肽段扫描、ELISA、细胞结合实验）确定N蛋白和G蛋白的关键B细胞和T细胞表位。

(2)**阶段二：新型疫苗构建与优化(约9个月)**

***步骤2.1**：根据表位信息，设计合成编码表位优化抗原或多表位融合蛋白的基因序列。

***步骤2.2**：将基因序列克隆入腺病毒穿梭载体，并进行验证。

***步骤2.3**：在腺病毒包装系统中包装产生重组腺病毒疫苗原液。

***步骤2.4**：对疫苗原液进行纯化和质量鉴定。

***步骤2.5**：探索并筛选新型佐剂，优化疫苗配方（如与佐剂混合）。

(3)**阶段三：疫苗免疫原性、安全性与保护力初步评价(约12个月)**

***步骤3.1**：在C57BL/6小鼠模型中，通过皮下或肌肉注射等方式进行初步免疫评价，检测体液免疫（抗体）和细胞免疫（脾细胞增殖、细胞因子分泌）应答。

***步骤3.2**：在Beagle犬模型中，按照接近临床应用的程序进行免疫评价，包括免疫原性（血清学、细胞学）、初步安全性（短期观察、血液学指标）。

***步骤3.3**：选择免疫效果较好的疫苗候选株，在C57BL/6小鼠或犬模型中进行保护力评价，确定最佳免疫程序和剂量。

(4)**阶段四：免疫机制深入研究(约9个月)**

***步骤4.1**：在完成免疫程序的小鼠或犬模型中，深入分析疫苗诱导的免疫细胞亚群分化、迁移、功能激活情况。

***步骤4.2**：通过免疫化学等方法，观察免疫细胞在淋巴结、脾脏、肝脏等关键免疫器官的浸润定位。

***步骤4.3**：结合结构生物学结果，分析免疫应答与抗原结构、表位暴露之间的关系。

(5)**阶段五：总结与深化(约6个月)**

***步骤5.1**：整理所有实验数据，进行统计学分析和结果解释。

***步骤5.2**：撰写研究论文，提交项目结题报告。

***步骤5.3**：根据研究初步结果，探讨进一步优化的方向，如针对免疫逃逸机制的干预策略等。

整个技术路线强调结构功能结合、体外体内印证、宏观微观并重，旨在系统、深入地解决狂犬病疫苗研发中的关键科学问题，并为最终开发出高效安全的狂犬病疫苗奠定坚实的基础。

七．创新点

本项目在狂犬病病毒研究及疫苗开发领域拟开展一系列工作，具有以下显著的创新性：

(1)**在结构生物学层面，深度融合高分辨率结构与免疫表位分析**：

***创新性**：本项目不仅致力于解析狂犬病病毒衣壳蛋白N和糖蛋白G的高分辨率三维结构，更关键的是，将结构生物学信息与免疫表位鉴定紧密结合。通过冷冻电镜等先进技术获取精确的结构，结合分子动力学模拟预测抗原分子的动态变化，并利用这些结构信息指导关键B细胞表位和T细胞表位（包括MHC-I和MHC-II限制性表位）的精确定位和验证。这超越了以往仅依赖序列分析或粗略结构预测来寻找表位的方法，能够更准确地识别在天然感染或免疫应答中起关键作用的免疫决定簇，特别是那些可能处于易接触构象或发生变性的表位，为后续疫苗设计提供更精准的靶点。

***意义**：这种结构驱动的方法有望发现新的、更有效的免疫原表位，优化疫苗抗原设计，提高疫苗诱导免疫应答的特异性和广度，为开发广谱保护性疫苗奠定坚实的结构基础。

(2)**在疫苗构建层面，采用腺病毒载体并整合新型佐剂策略**：

***创新性**：虽然腺病毒载体疫苗已有应用，但本项目在载体选择、抗原表达优化和佐剂应用上寻求创新。首先，将针对现有腺病毒载体的局限性（如免疫原性、潜在免疫干扰），考虑使用新型腺病毒载体（如人源化腺病毒、或来自低免疫背景的腺病毒如ChAd71）或对现有腺病毒进行基因工程改造（如降低E1区表达、优化衣壳蛋白），以增强疫苗的安全性、免疫原性和递送效率。其次，在抗原表达上，将不仅限于表达单一蛋白，更会探索表达抗原多表位融合体或经过构象优化的抗原形式，以同时激活B细胞和T细胞，构建更强大的免疫记忆。最重要的是，本项目将系统性地引入并评估新型佐剂（如TLR激动剂、CD40L激动剂、新型TLI等）与腺病毒载体疫苗的联合应用，旨在通过协同激活先天免疫和适应性免疫通路，显著提升疫苗诱导的保护性免疫应答强度和持久性。这种载体-抗原-佐剂系统的优化组合是本项目的重要创新点。

***意义**：有望开发出免疫原性更强、接种程序更简便（可能减少接种次数）、保护效果更持久的狂犬病疫苗，提升疫苗的可及性和使用意愿，尤其对于资源有限的地区。

(3)**在免疫机制研究层面，系统解析新型疫苗诱导的复杂免疫应答网络**：

***创新性**：本项目不仅关注疫苗诱导的抗体水平和细胞毒性T细胞活性，更强调对整个免疫应答网络的系统解析。将利用多参数流式细胞术、ELISPOT、空间转录组学（如适用）等多种高维技术手段，深入探究疫苗诱导的体液免疫与细胞免疫之间的动态协同关系，特别是CD4+辅助T细胞（Th1,Th2,Tfh等亚群）在B细胞活化、抗体类别转换、以及CD8+细胞毒性T细胞分化和功能维持中的作用。此外，还将结合前期结构生物学获得的抗原信息，尝试解析不同免疫细胞亚群识别特定抗原表位的机制，以及疫苗诱导的免疫记忆形成的细胞和分子基础。

***意义**：全面深入的理解疫苗诱导的免疫机制，不仅有助于解释疫苗为何有效，更能为未来根据特定需求（如增强黏膜免疫、诱导特定细胞应答）对疫苗进行个性化设计和改进提供理论指导。

(4)**在研究模型与应用结合方面，兼顾小鼠快速评价与大动物（犬）模拟**：

***创新性**：本项目同时采用小鼠和犬作为评价模型。小鼠模型能够快速、经济地筛选疫苗候选株、评估免疫原性和初步安全性，加速研发进程。而犬作为大型哺乳动物，其生理和免疫反应与人类更为接近，使用狂犬病病毒进行攻击实验能够更真实地模拟自然感染和疫苗的保护效果，为疫苗进入临床试验前提供关键的安全性（尤其是免疫原性相关副作用）和有效性数据支持。在狂犬病疫苗研发领域，充分利用不同层次模型的优势，形成互补，是一种高效的研究策略。

***意义**：提高了研究效率和结果的可靠性，缩短了从基础研究到潜在应用的时间，为开发出真正适用于人类且安全有效的狂犬病疫苗提供了有力支撑。

综上所述，本项目在结构解析精度、疫苗设计理念、免疫机制研究深度以及模型应用策略上均体现了创新性，有望在狂犬病基础研究和疫苗开发方面取得突破性进展，具有重要的科学意义和潜在的应用价值。

八．预期成果

本项目通过系统深入的研究，预期在理论层面和实践应用层面均取得一系列重要成果：

(1)**理论成果**：

***预期获得RABV关键抗原的高分辨率结构信息**：成功解析狂犬病病毒衣壳蛋白N和糖蛋白G的高分辨率三维结构（预期分辨率达到3.0Å或更高），并可能揭示G蛋白在不同生理状态下的构象变化。这些结构信息将首次在原子水平上揭示RABV主要抗原分子的空间结构特征、抗原表位的精确位置和空间排布，为理解病毒与宿主免疫系统的相互作用机制提供结构基础。

***阐明RABV免疫逃逸的分子机制**：通过结合结构生物学、免疫学和病毒学方法，初步探索RABV在感染过程中可能存在的免疫逃逸策略，例如G蛋白表面关键抗原表位的构象变化如何影响其被MHC-I途径提呈或被NK细胞识别。预期揭示病毒逃避宿主免疫监视的关键分子事件，为开发能够克服免疫逃逸的新型疫苗提供重要理论依据。

***深化对狂犬病免疫应答机制的认识**：系统阐明新型腺病毒载体疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫的动态变化规律，特别是CD4+T细胞在B细胞活化、抗体类别转换和CD8+T细胞应答中的调控作用。预期阐明疫苗诱导的保护性免疫所依赖的核心免疫细胞亚群和功能网络，以及不同免疫应答组分之间的协同机制，为优化疫苗设计提供理论指导。

***建立结构-功能-免疫表位关联**：预期将解析的抗原结构信息与实验确定的免疫表位数据相结合，建立关键抗原表位的空间构象与其免疫原性、免疫逃逸能力之间的关联，为疫苗抗原的设计和优化提供结构生物学指导原则。

(2)**实践应用成果**：

***开发新型高效狂犬病疫苗原型**：基于结构解析结果和免疫机制研究，成功构建并优化表达关键抗原（单一或组合）的重组腺病毒载体疫苗，并辅以新型佐剂。预期获得的疫苗原型在动物模型中展现出比现有疫苗更强的免疫原性、更广的免疫谱和更长的免疫保护期。

***获得疫苗安全性数据**：通过在犬模型中的安全性评价，预期获得关于新型疫苗安全性（包括急性毒性、免疫原性相关副作用等）的关键数据，为后续的临床试验研究和疫苗注册提供重要依据。

***形成疫苗研发的技术储备**：项目执行过程中，将建立一套完整的从抗原设计、载体构建、佐剂筛选到动物评价的标准化研发流程和技术平台。掌握新型腺病毒载体疫苗开发的关键技术，为后续针对其他传染病开发类似疫苗奠定基础。

***推动狂犬病防控策略的改进**：项目成果有望为开发出更安全、更有效、更易推广的狂犬病疫苗提供支撑，从而提升全球特别是发展中国家的狂犬病防控水平，减少狂犬病相关死亡和发病，保障公众健康安全。同时，对免疫逃逸机制的研究也可能为开发新的治疗性干预措施提供线索。

综上所述，本项目预期在狂犬病病毒结构与免疫机制研究方面取得重要理论突破，并成功开发出具有临床应用前景的新型疫苗原型，为全球狂犬病防治事业贡献关键性的科学成果和技术支撑。

九.项目实施计划

本项目实施周期预计为5年，将按照研究目标和内容，分阶段、有步骤地推进各项研究任务。项目时间规划和风险管理策略如下：

(1)**项目时间规划**

**第一阶段：关键抗原结构与功能解析(第1-12个月)**

***任务分配**：

*第1-3个月：文献调研，优化N蛋白和G蛋白的表达纯化方案。

*第4-6个月：开展N蛋白晶体筛选与培养，开始G蛋白结构解析准备工作。

*第7-9个月：解析N蛋白晶体结构，进行初步结构分析。

*第10-12个月：解析G蛋白晶体结构，利用MD模拟研究其动态构象，结合生物信息学和实验方法（肽段扫描、ELISA、细胞结合实验）初步鉴定N蛋白和G蛋白的免疫表位。

***进度安排**：此阶段重点在于获得关键抗原的结构信息并初步定位免疫表位。预期在第12个月末完成主要结构解析和初步表位鉴定，为后续疫苗设计提供基础。

**第二阶段：新型疫苗构建与优化(第13-24个月)**

***任务分配**：

*第13-15个月：根据表位信息，设计合成编码表位优化抗原或多表位融合蛋白的基因序列，完成载体构建与初步验证。

*第16-18个月：在腺病毒包装系统中进行重组腺病毒疫苗的包装、纯化，并进行初步质量鉴定。

*第19-21个月：筛选和评估新型佐剂，优化疫苗配方（如佐剂联合、接种途径优化）。

*第22-24个月：完成疫苗原液的大规模制备和质控，为动物实验做准备。

***进度安排**：此阶段核心任务是疫苗的构建和初步优化。预期在第24个月末完成疫苗原液的制备和质控，进入动物实验阶段。

**第三阶段：疫苗免疫原性、安全性与保护力初步评价(第25-42个月)**

***任务分配**：

*第25-30个月：在C57BL/6小鼠模型中开展初步免疫评价（免疫原性、初步安全性），检测体液免疫和细胞免疫应答。

*第31-36个月：在Beagle犬模型中开展免疫评价（免疫原性、初步安全性），确定最佳免疫程序和剂量。

*第37-42个月：选择候选疫苗株，在C57BL/6小鼠或犬模型中进行保护力评价，确定最佳方案。

***进度安排**：此阶段是项目应用价值的关键体现。预期在第42个月末完成初步的免疫、安全性和保护力评价，筛选出有前景的疫苗候选株。

**第四阶段：免疫机制深入研究(第43-54个月)**

***任务分配**：

*第43-48个月：在完成免疫程序的小鼠或犬模型中，深入分析疫苗诱导的免疫细胞亚群分化、迁移、功能激活情况。

*第49-51个月：通过免疫化学等方法，观察免疫细胞在淋巴结、脾脏、肝脏等关键免疫器官的浸润定位。

*第52-54个月：结合结构生物学结果，分析免疫应答与抗原结构、表位暴露之间的关系，系统总结免疫机制。

***进度安排**：此阶段旨在深化对疫苗作用机制的理解。预期在第54个月末完成免疫机制的深入研究，为疫苗优化和未来应用提供理论支持。

**第五阶段：总结与深化(第55-60个月)**

***任务分配**：

*第55-57个月：整理所有实验数据，进行统计学分析和结果解释，撰写研究论文。

*第58-59个月：提交项目结题报告，准备成果汇报。

*第60个月：根据研究初步结果，探讨进一步优化的方向，形成未来研究建议。

***进度安排**：此阶段为项目收尾和成果转化准备阶段。预期在第60个月末完成项目所有研究任务，提交结题报告，并形成未来研究展望。

(2)**风险管理策略**

本项目在实施过程中可能面临以下风险，将采取相应的管理策略：

***结构解析风险**：

***风险描述**：目标蛋白难以表达纯化、晶体质量不佳导致结构解析失败。

***应对策略**：提前进行大量的表达条件优化和纯化条件摸索；采用高通量晶体筛选技术提高获得高质量晶体的概率；若初期解析失败，及时调整方案，尝试不同的表达系统（如昆虫细胞、酵母）或结构生物技术（如Cryo-EM）。

***疫苗构建与表达风险**：

***风险描述**：基因克隆失败、腺病毒包装效率低、疫苗免疫原性不足。

***应对策略**：严格把控基因合成质量和载体构建环节，建立标准化的包装流程；通过结构生物学指导抗原设计，优化抗原序列；同时备选多种抗原设计和佐剂组合，进行并行研究。

***动物实验风险**：

***风险描述**：动物模型反应个体差异大，导致实验结果不稳定；疫苗在动物模型中未显示预期的免疫原性或保护力；动物实验伦理审批延误。

***应对策略**：选择经验丰富的实验动物操作人员；设置足够数量的实验动物和对照组，增加样本量以减少随机误差；在实验设计阶段进行充分的预实验，预估可能的免疫效果；提前完成伦理委员会的申请流程，确保实验合规性。

***经费与资源风险**：

***风险描述**：项目经费拨付延迟或不足；关键仪器设备故障或共享平台使用冲突。

***应对策略**：制定详细的经费预算，并积极与资助方沟通，争取稳定的经费支持；建立仪器设备定期维护制度，并探索共享平台的高效预约机制；在项目申请阶段就充分评估资源需求，确保关键资源到位。

***知识产权风险**：

***风险描述**：研究成果可能存在潜在的知识产权纠纷，特别是在结构新颖性或疫苗组合物方面。

***应对策略**：在项目初期就进行知识产权检索，评估研究成果的独创性和保护价值；建立严格的成果保密制度，及时申请专利保护；明确项目组成员的知识产权归属，避免后续纠纷。

通过上述风险识别和应对策略的制定，将努力保障项目的顺利实施，提高研究成功的可能性，确保项目目标的达成。

十.项目团队

本项目团队由来自国家传染病医学中心病毒研究所、国内顶尖高校及研究机构的资深研究人员组成，团队成员在病毒学、免疫学、结构生物学、分子生物学和动物模型等领域具有丰富的科研经验和深厚的专业积累，能够覆盖本项目所需的各项研究内容，确保项目研究的科学性、系统性和高效性。

(1)**团队成员专业背景与研究经验**：

***项目负责人（张华）**：病毒学研究员，博士，主要研究方向为狂犬病病毒的致病机制与疫苗研发。在国内外知名期刊发表高水平论文20余篇，主持国家自然科学基金面上项目3项，擅长病毒结构解析、抗原设计、疫苗开发及免疫机制研究。具有10年狂犬病相关研究经验，熟悉RABV全基因组结构与功能，对疫苗免疫策略有深入理解。

***结构生物学课题组负责人（李强）**：结构生物学家，教授，博士，专注于病毒结构生物学研究。在Nature、Science等顶级期刊发表论文15篇，擅长X射线晶体学和Cryo-EM技术，曾解析多种病毒及蛋白质复合物的结构。在RABV衣壳蛋白结构解析方面具有丰富经验，为项目提供关键的结构基础。

***免疫学研究组组长（王芳）**：免疫学家，副教授，博士，主要研究方向为疫苗免疫机制与免疫调控。在Immunity、NatureImmunology等权威期刊发表论文10余篇，精通细胞免疫与体液免疫研究技术，在疫苗诱导的免疫应答调控机制方面有突出贡献。负责项目免疫学评价体系的建立和实施，包括动物模型免疫学检测、免疫细胞分选与分析、免疫机制研究等。

***分子生物学与病毒学组负责人（刘伟）**：分子病毒学家，研究员，博士，长期从事狂犬病病毒基因工程疫苗的研发。在PLOSPathogens、Vaccine等期刊发表论文18篇，擅长腺病毒载体构建、基因编辑技术、病毒表达系统优化。成功构建了多种重组腺病毒载体疫苗原型，为项目疫苗平台的搭建提供了核心技术支撑。

***动物模型研究组负责人（赵明）**：实验动物学家，教授，博士，专注于传染病动物模型构建与评价。在VeterinaryResearch、JournalofVirology等期刊发表论文12篇，在多种实验动物模型（小鼠、犬）的病原感染与免疫学研究方面具有丰富经验，擅长动物模型行为学观察、病理学检测及生物样本分析。负责项目动物实验方案的制定和实施，包括免疫程序设计、保护力评价模型建立、免疫病理学分析等。

***生物信息学与数据分析师（孙磊）**：生物信息学专家，研究员，博士，擅长蛋白质结构预测、分子动力学模拟、免疫数据整合分析。在Bioinformatics、PLOSComputationalBiology等期刊发表论文9篇，熟练掌握各类生物信息学分析工具和统计方法。负责项目结构生物学数据的解析、抗原表位预测、免疫应答数据的生物信息学分析和机制解读。

(2)**团队成员角色分配与合作模式**：

**项目负责人（张华）**：全面负责项目总体规划、资源协调、经费管理及对外合作，主持项目关键技术攻关，统筹各研究组工作，确保项目按计划推进，并负责项目成果的整理、撰写及申报。

**结构生物学课题组（李强）**：负责RABVN蛋白和G蛋白的高分辨率结构解析，通过结构信息指导抗原表位设计，为疫苗开发提供结构基础，并参与免疫机制研究中的结构-功能关联分析。

**免疫学研究组（王芳）**：负责建立完善的免疫学评价体系，包括体外细胞实验（如细胞增殖、细胞毒性T细胞检测、细胞因子分析）和体内动物实验（如抗体检测、细胞浸润分析），系统评价疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答，深入解析疫苗作用机制，为疫苗优化提供理论依据。

**分子生物学与病毒学组（刘伟）**：负责新型腺病毒载体疫苗的构建、表达优化及佐剂筛选，建立标准化疫苗制备流程，确保疫苗原型的高效