类器官共培养模拟阿尔茨海默病脑区相互作用

类器官共培养模拟阿尔茨海默病脑区相互作用演讲人引言：阿尔茨海默病研究的复杂性与模型革新需求01挑战与展望：迈向更精准的AD脑区互作模型02类器官共培养技术：构建AD脑区互作模型的理论基础03总结：类器官共培养——模拟AD脑区相互作用的核心范式04目录类器官共培养模拟阿尔茨海默病脑区相互作用01引言：阿尔茨海默病研究的复杂性与模型革新需求引言：阿尔茨海默病研究的复杂性与模型革新需求阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease,AD）作为一种进行性神经退行性疾病，其病理特征不仅表现为单一脑区的神经元丢失，更涉及多个脑区间复杂的相互作用网络。从临床前期的内侧颞叶记忆障碍到中晚期的广泛皮层萎缩，AD的进展轨迹始终与特定脑区间的功能连接和物质传递密切相关——例如海马与内嗅皮层间的突触失联、基底前脑胆碱能系统对皮层的支配异常、以及小胶质细胞介导的跨脑区神经炎症扩散。这些相互作用构成了AD病理进程的“核心引擎”，却也因传统研究模型的局限性而成为长期未被充分解析的“黑箱”。在传统AD研究中，我们曾依赖两种主流模型：一是离体培养的单一脑区细胞（如海马神经元），虽能模拟细胞内病理事件（如Aβ沉积、Tau过度磷酸化），却无法再现脑区间动态互作；二是整体动物模型（如APP/PS1转基因小鼠），虽保留了脑区解剖连接，引言：阿尔茨海默病研究的复杂性与模型革新需求但因物种差异（如脑区结构、免疫代谢特征）难以完全模拟人类AD进程。更重要的是，这两种模型均无法捕捉AD早期“脑区间功能失衡先于神经元丢失”的关键特征——正如临床影像学研究所揭示的：AD患者在出现明显认知下降前，默认网络、额顶网络等关键脑区间的功能连接已显著减弱。这种“系统性互作失调”的缺失，使得我们在药物研发中屡屡遭遇“靶点有效但临床失败”的困境。正是这些亟待突破的瓶颈，推动我们转向更具仿生性的研究工具。类器官（Organoid）技术，凭借其干细胞来源的3D自组织特性，能够模拟人脑特定脑区的细胞组成与空间结构；而共培养（Co-culture）体系的建立，则进一步打破了单一类器官的“孤立状态”，为重现脑区间物质传递、信号转导和功能整合提供了可能。引言：阿尔茨海默病研究的复杂性与模型革新需求当“类器官”与“共培养”结合，一种能够模拟AD脑区相互作用的新型模型应运而生。作为长期从事神经退行性疾病模型构建的研究者，我在构建首个海马-皮层类器官共培养体系时，曾因观察到皮层来源的Aβ寡聚体经突触传递至海马神经元并诱发Tau磷酸化的现象而震撼——这不仅是技术上的突破，更让我们首次在体外重现了AD“跨脑区病理传播”的核心过程。本文将从AD脑区相互作用的病理机制出发，系统阐述类器官共培养模型的技术构建、验证方法、应用价值及未来挑战，以期为破解AD复杂网络提供新的研究范式。二、阿尔茨海默病脑区相互作用的病理机制：从“孤立病变”到“网络失联”1AD关键脑区的解剖与功能关联AD的病理进展并非随机分布，而是遵循特定的“脑区传播路径”。这一网络以内侧颞叶记忆系统为核心，向外围皮层逐步扩散：-内嗅皮层（EntorhinalCortex,EC）与海马（Hippocampus）：作为记忆形成与整合的中枢，EC是AD最早受累的区域之一。其第II层的淀粉样前体蛋白（APP）阳性神经元向海马齿状回发出穿通纤维，而Aβ在EC的沉积会通过突触传递“逆行”影响海马CA1区，导致突触可塑性下降——这一过程在临床前即可通过EC-海马功能连接的磁共振成像（fMRI）检测到。-基底前脑胆碱能系统（BasalForebrainCholinergicSystem,BFCN）：起源于Meynert基底核的胆碱能神经元广泛投射至皮层、海马，调节觉醒、注意与记忆。AD患者BFCN的丢失不仅直接影响皮层胆碱能神经传递，还会通过减少乙酰胆碱（ACh）释放，削弱对Aβ生成的抑制（ACh可调节α7烟碱型乙酰胆碱受体介导的Aβ清除），形成“胆碱能缺失-Aβ沉积”的恶性循环。1AD关键脑区的解剖与功能关联-小胶质细胞与星形胶质细胞介导的“炎症级联”：小胶质细胞作为脑内固有免疫细胞，在AD中表现为“双刃剑”：早期可通过TREM2受体清除Aβ，但持续激活后释放IL-1β、TNF-α等促炎因子，不仅直接损伤神经元，还可通过细胞外囊泡（EVs）将炎症信号传递至远隔脑区；星形胶质细胞则通过“反应性胶质化”形成胶质瘢痕，阻碍神经营养因子扩散，加剧脑区间营养失衡。2脑区间病理物质传递的“三个关键路径”AD脑区相互作用的本质是病理分子与细胞信号的跨区域传递，目前已明确三条核心路径：-Aβ的“解剖扩散路径”：Aβ在EC的沉积可沿穿通纤维扩散至海马，再经海马-皮层投射纤维至额顶联合皮层，这一过程与Bra分期（AD病理分期标准）的BraIII-V期高度吻合。值得注意的是，Aβ的扩散并非简单的“物理迁移”，而是通过“突触传递”实现：Aβ寡聚体可与突触后膜NMDA受体结合，促进内吞作用，进而被神经元摄取并沿轴突运输至远端突触。-Tau蛋白的“朊病毒样传播”：过度磷酸化的Tau（p-Tau）具有“种子效应”，可通过突触间隙、细胞外囊泡或神经元间的直接连接，从“病变脑区”传播至“正常脑区”。例如，EC来源的p-Tau可经内嗅皮层-海马通路进入海马，再通过海马-皮层投射扩散至新皮层，这一过程与患者认知下降的“阶段性恶化”直接相关。2脑区间病理物质传递的“三个关键路径”-神经营养因子剥夺的“功能性失联”：脑源性神经营养因子（BDNF）主要在皮层合成，通过逆行运输至海马神经元，维持突触可塑性。AD患者皮层神经元因Aβ沉积导致BDNF合成减少，海马神经元因缺乏BDNF支持而出现树突棘丢失，这种“营养剥夺”效应早于神经元丢失，是认知障碍的早期驱动因素。3传统模型在模拟“脑区互作”中的固有缺陷尽管我们对AD脑区相互作用的认知不断深入，但传统模型始终无法完全再现这一复杂过程：-离体单脑区培养：如海马神经元培养，虽可观察Aβ或Tau的细胞内效应，但缺乏皮层来源的BDNF、胆碱能输入等关键互作信号，无法模拟“跨脑区病理传递”；-转基因动物模型：APP/PS1小鼠虽能在皮层和海马沉积Aβ，但小鼠与人类的脑区连接模式存在显著差异（如小鼠缺乏明显的人类化EC结构），且Tau传播路径与人类不符；-脑片培养：保留了一定的脑区解剖结构，但培养过程中神经元活性迅速下降，且难以长期模拟慢性病理进程。3传统模型在模拟“脑区互作”中的固有缺陷这些缺陷直接导致我们在药物研发中难以识别“跨脑区治疗靶点”——例如，靶向单一脑区的Aβ清除药物虽在动物模型中有效，但因无法阻断Aβ从EC向海马的传播，临床疗效有限。因此，构建一种能够同时模拟人脑特定脑区结构、细胞组成及互作关系的新型模型，成为AD研究突破的关键。02类器官共培养技术：构建AD脑区互作模型的理论基础1类器官技术：从“单一脑区”到“仿生脑区”类器官技术的核心优势在于其“干细胞来源的自组织性”。通过模拟胚胎发育过程中的信号通路，多能干细胞（PSCs，包括胚胎干细胞ESCs和诱导多能干细胞iPSCs）可分化为具有特定脑区特征的3D结构：-脑区特异性类器官的构建：通过调控Wnt、SHH、FGF等信号通路的时空组合，可定向诱导iPSCs分化为海马类器官（HippocampalOrganoids,Hipo）、皮层类器官（CorticalOrganoids,Corto）等。例如，海马类器官的构建需在早期激活Wnt信号（模拟海马发育的背侧化），随后抑制SHH信号（避免向基底神经节分化），最终表达海马标志物Prox1、CA1区特异性标志物NeuN和RBPMS；1类器官技术：从“单一脑区”到“仿生脑区”-细胞组成的多样性：成熟的脑区类器官不仅包含神经元，还包含星形胶质细胞（GFAP阳性）、小胶质细胞（P2RY12阳性）、少突胶质细胞前体细胞（OLIG2阳性），甚至血管内皮细胞（若添加内皮诱导），可模拟人脑的“细胞微环境”；-功能的成熟性：通过延长培养时间（可达6-12个月）或引入“成熟因子”（如BDNF、NT-3），类神经元可形成功能性突触，表达电压门控钠通道（Nav1.6），并产生自发性动作电位，部分接近人脑发育晚期的电生理特征。2共培养体系：打破“孤立类器官”的互作壁垒单一脑区类器官虽能模拟局部病理，但无法重现脑区间相互作用。共培养体系的建立，通过物理连接或信号分子交换，实现了不同类器官的功能整合：-物理共培养（DirectCo-culture）：将两种类器官直接接触或在微流控芯片中通过微通道连接，允许细胞间突触形成、轴突投射及细胞外囊泡的直接传递。例如，将Hipo与Corto直接共培养，可观察到皮层类神经元的轴突延伸至海马类器官，形成“突触连接样结构”，免疫荧光显示突触前标志物Synapsin-1与突触后标志物PSD-95共定位；-间接共培养（IndirectCo-culture）：采用Transwell小室（孔径0.4μm，允许可溶性因子通过但阻挡细胞迁移）或条件培养基交换，模拟脑区间可溶性信号分子的传递（如BDNF、炎症因子、Aβ寡聚体）。这种方法适用于研究“神经营养因子剥夺”或“炎症扩散”等非细胞接触依赖的互作；2共培养体系：打破“孤立类器官”的互作壁垒-动态共培养系统：结合微流控芯片（Organ-on-a-Chip），通过精准控制类器官的位置、培养基流速及浓度梯度，模拟脑区间的“物质流动”与“信号动态”。例如，在芯片中构建“皮层-海马”双室系统，通过泵控培养基流动，模拟脑脊液循环对Aβ清除的影响。3AD类器官共培养模型的“病理加载”策略为了模拟AD的病理状态，需在共培养体系中引入“病理刺激”，目前已建立三种主流策略：-遗传学修饰：将AD相关基因突变（如APPswe、PSEN1M146V）导入iPSCs，再分化为类器官进行共培养。这种方法可模拟AD的“起始阶段”，观察突变蛋白的跨脑区传播；-外源病理物质添加：向共培养体系中加入外源Aβ42寡聚体、重组Tau蛋白或脑脊液（来自AD患者），模拟AD的“病理侵入”过程。例如，将Aβ42寡聚体添加至皮层类器官侧，24小时后可在海马类器官检测到Aβ内化及Tau磷酸化；-炎症诱导：使用脂多糖（LPS）或IL-1β激活类器官内的小胶质细胞，模拟AD的“慢性炎症”状态，观察炎症因子向远隔脑区的扩散。四、类器官共培养模型的构建与验证：从“形态仿生”到“功能互作”1AD脑区类器官的构建：以海马-皮层共培养为例作为AD研究中最关键的脑区对，海马-皮层类器官共培养模型的构建需遵循严格的步骤：-iPSCs的获取与鉴定：采用AD患者来源的iPSCs（携带APPswe/PSEN1M146V突变）或健康iPSCs（通过CRISPR/Cas9技术导入AD突变），通过多能性标志物（OCT4、NANOG、SOX2）及核型分析确保细胞质量；-脑区定向分化：采用“单阶段诱导法”或“两阶段诱导法”：-海马类器官：第0-3天，ActivinA（100ng/mL）诱导形成中内胚层；第4-7天，Wnt3a（50ng/mL）+DKK1（100ng/mL）诱导神经上皮形成；第8-21天，SHH抑制剂（Cyclopamine，1μM）促进海马背侧化，最终形成直径约500μm的类器官，表达Prox1（海马标志物）、TBR1（皮层深层神经元标志物，避免皮层污染）；1AD脑区类器官的构建：以海马-皮层共培养为例-皮层类器官：第0-7天，FGF2（20ng/mL）+EGF（20ng/mL）诱导神经球形成；第8-21天，BMP4（10ng/mL）促进皮层patterning，表达PAX6（放射状胶质细胞标志物）、TBR1（皮层深层神经元）、SATB2（皮层上层神经元标志物）；-共培养体系的建立：将第21天的Hipo与Corto以1:1数量比接种于低粘附培养板，或通过微流控芯片双室系统连接，培养于Neurobasal-A培养基（含B27、BDNF、NGF），每3天半量换液，培养至第60天（相当于人脑胚胎晚期至新生儿期）。2共培养模型的“形态学互作”验证构建成功的共培养模型需通过形态学方法确认脑区间互作：-突触连接的免疫荧光鉴定：采用抗Synapsin-1（突触前膜）和抗PSD-95（突触后膜）抗体进行双标，在共聚焦显微镜下观察突触样结构的形成。例如，在Hipo-Corto直接共培养模型中，可清晰观察到皮层来源的Synapsin-1阳性轴突末端与海马来源的PSD-95阳性树突棘形成“突触接触”；-轴突投射的追踪：通过慢病毒载体（如LV-GFP）标记皮层类神经元，3D重建显示GFP阳性轴突沿预设方向延伸至海马类器官，模拟“皮层-海马投射通路”；-细胞外囊泡的传递：采用DiI（红色荧光脂质探针）标记皮层类细胞，24小时后可在海马类细胞检测到DiI信号，通过透射电镜观察到囊泡内含Aβ42，证实病理分子的囊泡介导传递。3共培养模型的“功能互作”验证形态学互作是基础，功能互作才是模型有效性的关键：-电生理记录：采用膜片钳技术记录共培养体系中海马与皮层神经元的突触传递。例如，刺激皮层类神经元可在海马类神经元记录到兴奋性突触后电位（EPSC），且AD突变共培养模型的EPSC振幅较野生型降低40%，反映突触传递功能受损；-钙成像动态监测：通过Fluo-4AM（钙离子荧光指示剂）标记共培养体系，实时观察神经元活性。正常共培养模型中，皮层与海马神经元呈现同步性钙振荡；而AD模型中，这种同步性消失，海马神经元钙振荡频率下降，模拟AD早期“脑区间功能失联”；-分子互作的转录组学验证：通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析共培养体系中不同类器官的基因表达谱。结果显示，AD共培养模型中海马类神经元中“突触功能相关基因”（如SYN1、DLG4）表达下调，“神经炎症相关基因”（如IL1B、TNF）表达上调，且皮层来源的炎症因子（如C1q）可通过EVs传递至海马，验证“跨脑区炎症扩散”。4模型的“病理相关性”验证：模拟AD临床特征最终，类器官共培养模型需能模拟AD的核心临床病理特征：-Aβ与Tau的共沉积：在AD突变Hipo-Corto共培养模型中，免疫荧光显示皮层类神经元首先出现Aβ42沉积（6E10阳性），随后海马类神经元出现过度磷酸化的Tau（AT8阳性），且两者沉积时间差与临床AD早期EC先于海马受累的特征一致；-认知相关行为的体外模拟：采用“类器官行为学”测试，如“类长时程增强（LTP）诱导”：通过电刺激皮层类神经元，记录海马类神经元的LTP幅度。AD模型中LTP诱导率较野生型降低60%，与临床患者“记忆形成障碍”直接相关；-药物反应的临床一致性：给予Aβ单抗（如Aducanumab）或胆碱酯酶抑制剂（如多奈哌齐），AD共培养模型中海马Aβ沉积减少、Tau磷酸化下降、LTP幅度部分恢复，与临床试验结果趋势一致，验证模型的药物预测价值。4模型的“病理相关性”验证：模拟AD临床特征五、类器官共培养模型在AD研究中的应用：从“机制解析”到“药物筛选”1揭示AD脑区相互作用的“动态机制”类器官共培养模型的核心优势在于能够实时观察病理进程的“动态变化”，为解析AD脑区互作提供前所未有的视角：-Aβ跨脑区传播的“时间窗口”：通过在共培养体系中分时添加Aβ42寡聚体，发现Aβ首先在皮层类神经元内化，12小时后出现在EVs中，24小时后经EVs传递至海马类神经元，48小时后诱发海马Tau磷酸化——这一“时间序列”明确了Aβ传播的“潜伏期”，为早期干预提供了窗口；-小胶质细胞的“双相调节”作用：在AD共培养模型中，敲除小胶质细胞特异性基因TREM2，发现Aβ沉积增加、Tau磷酸化加剧，但若在Aβ添加前预先激活小胶质细胞（用IL-4极化至M2型），则Aβ清除效率提升50%，证实小胶质细胞在AD不同阶段的不同作用；1揭示AD脑区相互作用的“动态机制”-胆碱能系统对“跨脑区病理”的调控：将胆碱能类器官（由iPSCs分化而来）与Hipo-Corto共培养，发现胆碱能神经元释放的ACh可激活海马神经元M1受体，抑制GSK-3β活性，从而减少Tau磷酸化，为“胆碱能治疗”提供了直接机制证据。2筛选靶向“脑区互作”的新型药物传统药物筛选多基于单一靶点或单一脑区，而类器官共培养模型可评估药物对“跨脑区病理传递”的阻断效果：-靶向Aβ传播的药物：在ADHipo-Corto共培养模型中筛选小分子化合物，发现一种γ-分泌酶调节剂（GSM）不仅能减少皮层Aβ生成，还能抑制Aβ经EVs向海马的传递，使海马Aβ沉积下降70%，优于传统γ-分泌酶抑制剂；-靶向神经炎症的药物：采用微流控动态共培养系统，模拟“炎症从皮层向海马扩散”的过程，筛选发现一种NLRP3炎症小体抑制剂（MCC950）可阻断IL-1β经EVs的传递，使海马神经元炎症反应减轻60%，且不影响皮层小胶质细胞的正常免疫功能；-个性化药物筛选：采用AD患者来源的iPSCs构建Hipo-Corto共培养模型，发现不同患者的“跨脑区病理传播效率”存在显著差异（如携带APOE4纯合子的患者Aβ传播速度较APOE3快3倍），为“精准医疗”提供了个体化用药依据。3探索AD的“早期诊断生物标志物”类器官共培养模型可模拟AD“临床前期”的脑区功能失联，为发现早期诊断标志物提供新思路：-EVs携带的病理分子标志物：收集AD共培养模型的培养基，通过纳米流式细胞术分析EVs，发现皮层来源的EVs中Aβ42/Aβ40比值较野生型升高2倍，且EVs表面标志物L1CAM水平升高，与临床AD患者脑脊液EVs标志物变化一致；-脑区间功能连接的“电生理标志物”：通过多电极阵列（MEA）记录共培养体系中皮层与海马神经元的同步放电，发现AD模型中“跨脑区放电同步性”下降，且这一变化早于Aβ沉积，可作为“电生理诊断标志物”。03挑战与展望：迈向更精准的AD脑区互作模型1现有模型的局限性尽管类器官共培养模型展现出巨大潜力，但仍面临三大核心挑战：-成熟度不足：目前类器官的发育阶段相当于人胎脑或新生儿脑，缺乏成熟神经元的复杂突触结构和电生理特征，无法完全模拟成人AD的慢性病理进程；-血管化与免疫成分缺失：传统类器官缺乏血脑屏障（BBB）结构和完整的免疫细胞组成（如小胶质细胞比例不足、缺乏外周免疫细胞浸润），影响对AD“神经血管单元”和“全身免疫-脑轴”互作的研究；-批次差异与标准化难题：类器官的制备依赖干细胞批次、分化条件等参数，不同批次间存在较大异质性，限制了结果的重复性和临床转化价值。2未来技术发展方向针对上述挑战，未来研究将聚焦三大方向：-“成熟化”策略：通过延长培养时间至12个月以上、引入“机械刺激”（如旋转生物反应器模拟脑脊液流动）或“代谢调节”（如添加酮体替代葡萄糖），促进类神经元轴突髓鞘化和突触成熟；-“血管化与免疫化”整合：将脑区类器官与血管内皮细胞、周细胞共培养形成“血管化类器官”，再与小胶质细胞、外周血单核细胞（PBMCs）共培养，构建“脑区-血管-免疫”互作模型，模拟AD的“慢性炎症”和“血脑屏障破坏”；-标准化与人工智能结合：建立类器官制备的“标准操作规程（SOP）”，结合深度学习算法对类器官形态、细胞组成进行自动鉴定，并通过机器学习预测不同批次间的“互作效率”，实现模型的标准化生产。3跨学科合作：推动AD研究的范式革新类器官共培养模型的发展离不开多学科的深度交叉：-神经科学家与干细胞生物学家：共同优化脑区分化方案，确保类器官的“脑区特异性”；-微流控工程师与生物材料学家：开发更精密的共培养芯片，模拟脑区间的“解剖连接”与“微环境梯度”；-临床医生与药物研发人员：