微流控芯片SERS衬底：制备工艺与生物检测应用的深度剖析

微流控芯片SERS衬底：制备工艺与生物检测应用的深度剖析一、引言1.1研究背景与意义在当今生物检测领域，随着生命科学研究的深入以及临床诊断、疾病预防等实际需求的不断增长，对生物检测技术的准确性、灵敏度、快速性以及微型化、集成化等方面提出了越来越高的要求。传统的生物检测方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）等，虽然在一定程度上满足了部分检测需求，但也存在着诸如检测时间长、操作复杂、灵敏度有限等不足之处。因此，开发新型高效的生物检测技术成为了该领域的研究热点和迫切需求。微流控芯片技术，又称芯片实验室（Lab-on-a-chip），是一种在微米尺度空间中对流体进行精确操控的前沿技术。它能够将化学和生物实验室的基本功能高度集成在一个仅有几平方厘米大小的芯片之上，以微管道网络作为独特的结构特征，将生命科学作为主要的应用对象。微流控芯片具有样品和试剂用量极少、分析速度极快、易于实现自动化和集成化等诸多显著优点，这使得它在分析化学、生命科学以及生物医学器件等众多领域都展现出了巨大的应用潜力，已然成为当前生命科学、化学、微机械和微电子学领域的研究焦点。表面增强拉曼散射（Surface-EnhancedRamanScattering，SERS）技术是一种极具创新性的光谱检测技术。当分子吸附在一些特殊的金属（主要是贵金属，如金、银等）或半导体纳米结构表面时，其拉曼散射信号能够被增强多个数量级，这种神奇的现象赋予了SERS技术快速、简单、灵敏度高、具备指纹识别特性以及可重复性好等突出优势。在化学、生物、医学以及环境等领域，SERS技术都得到了广泛的应用，例如对催化及化学反应过程的深入研究、低浓度物质的精准检测及分析，以及氨基酸、蛋白质、核酸或其它生物色素的准确测定等。将微流控芯片技术与SERS技术有机结合，制备出微流控芯片SERS衬底，为生物检测领域带来了全新的解决方案。这种结合不仅充分发挥了微流控芯片在样品处理和操控方面的优势，能够实现样品的快速进样、混合、反应等过程，极大地提高了检测效率，而且利用了SERS技术超高的检测灵敏度，能够对痕量生物分子进行精准检测，突破了传统检测技术在灵敏度方面的限制。同时，微流控芯片的微型化和集成化特点，使得整个检测系统更加便携、易于操作，为现场快速检测和即时诊断提供了可能，具有重要的现实意义。在临床诊断中，对于疾病相关生物标志物的早期、准确检测至关重要。微流控芯片SERS衬底能够实现对极低浓度生物标志物的快速检测，有助于疾病的早期发现和诊断，为患者的治疗争取宝贵的时间。在生物医学研究中，它可以用于对生物分子间相互作用的实时监测和分析，为深入理解生命过程的分子机制提供有力的技术支持。在食品安全检测和环境监测等领域，该技术也能够快速、准确地检测出有害生物分子和污染物，保障人们的健康和生态环境的安全。综上所述，微流控芯片SERS衬底的研究对于推动生物检测技术的发展具有不可忽视的重要作用，具有广阔的应用前景和深远的研究意义。1.2国内外研究现状微流控芯片SERS衬底的研究是一个跨学科的前沿领域，近年来在国内外都受到了广泛的关注，取得了一系列令人瞩目的研究成果，展现出了广阔的应用前景。在国外，许多科研团队致力于微流控芯片SERS衬底制备方法的创新研究。例如，美国的一些研究小组采用光刻技术结合金属沉积工艺，成功制备出具有高度有序纳米结构的微流控芯片SERS衬底。这种方法能够精确控制纳米结构的尺寸和形状，从而有效提高SERS的增强效果。他们通过优化光刻工艺参数，制备出的纳米结构尺寸精度可达纳米级，使得SERS信号增强因子显著提高，能够实现对极微量生物分子的检测。同时，欧洲的科研人员则专注于利用模板法制备SERS衬底，通过在微流控芯片中引入纳米模板，如多孔氧化铝模板等，在模板的孔隙中沉积金属纳米颗粒，形成具有特殊结构的SERS衬底。这种方法制备的衬底具有较高的比表面积和丰富的纳米间隙，能够提供更多的SERS热点，增强检测灵敏度。在生物检测应用方面，国外研究人员将微流控芯片SERS衬底广泛应用于生物医学诊断、食品安全检测和环境监测等领域。在生物医学诊断中，利用该技术实现了对癌症标志物、病原体等的快速、灵敏检测，为疾病的早期诊断和治疗提供了有力支持。如对乳腺癌相关标志物的检测，能够在早期发现癌症的潜在风险，为患者争取更多的治疗时间。在食品安全检测中，可快速检测食品中的有害物质，如农药残留、兽药残留等，保障食品安全。在环境监测方面，能对水体中的重金属离子、有机污染物等进行实时监测，及时发现环境污染问题。国内在微流控芯片SERS衬底领域也取得了丰硕的研究成果。众多高校和科研机构积极开展相关研究，在制备技术和应用探索方面都取得了重要进展。在制备技术上，我国科研人员提出了多种创新方法。例如，利用化学刻蚀与自组装相结合的方法，在微流控芯片表面构建出具有特殊形貌的金属纳米结构，形成高效的SERS衬底。这种方法不仅操作相对简单，而且成本较低，适合大规模制备。通过精确控制化学刻蚀的条件和自组装的过程，能够制备出具有均匀纳米结构的衬底，提高SERS信号的稳定性和重复性。在生物检测应用方面，国内研究人员将微流控芯片SERS衬底应用于多种生物分子的检测，包括蛋白质、核酸、细胞等。在疾病诊断领域，针对传染病、遗传病等疾病的生物标志物进行检测，为疾病的诊断和治疗提供了新的技术手段。如对乙肝病毒标志物的检测，能够准确判断患者的感染情况和病情发展。在生物医学研究中，利用该技术研究生物分子间的相互作用，深入探索生命过程的分子机制。综合来看，目前微流控芯片SERS衬底的研究呈现出以下几个趋势：一是制备技术不断向更加精准、高效、低成本的方向发展，以满足大规模生产和实际应用的需求；二是在生物检测应用方面，逐渐从单一生物分子检测向多生物分子同时检测发展，提高检测效率和准确性；三是与其他技术的融合不断加深，如与微机电系统（MEMS）技术、纳米技术、生物技术等相结合，开发出功能更加集成化、智能化的检测系统；四是更加注重实际应用中的稳定性、可靠性和重复性，以推动该技术从实验室研究走向临床诊断、食品安全检测、环境监测等实际应用领域。1.3研究内容与创新点本论文围绕微流控芯片SERS衬底展开，深入研究其制备方法以及在生物检测领域的应用，旨在开发出高性能、低成本且易于操作的微流控芯片SERS衬底，为生物检测技术的发展提供新的思路和方法。在制备方法方面，探索多种创新制备技术。尝试将纳米压印技术与金属溅射工艺相结合，利用纳米压印技术能够精确复制纳米结构的特点，在微流控芯片表面制备出具有高度有序纳米图案的模板，然后通过金属溅射在模板上沉积金属层，形成SERS衬底。研究不同的纳米压印模具材料和工艺参数对纳米结构复制精度的影响，以及金属溅射过程中溅射功率、时间等因素对SERS衬底性能的影响。同时，开展基于电化学沉积法制备SERS衬底的研究，通过控制电化学沉积的电位、时间和电解液成分，在微流控芯片的电极表面生长出具有特殊形貌和尺寸的金属纳米结构，如纳米颗粒、纳米线等，以获得高效的SERS活性衬底。分析不同金属材料（如金、银、铜等）在电化学沉积过程中的生长行为和SERS增强效果，优化制备工艺，提高SERS衬底的灵敏度和稳定性。针对生物检测应用，选择多种具有代表性的生物分子作为检测对象，全面研究微流控芯片SERS衬底的检测性能。将其应用于蛋白质检测，以癌胚抗原（CEA）等肿瘤标志物蛋白质为例，利用抗原-抗体特异性结合的原理，在SERS衬底表面修饰相应的抗体，实现对蛋白质的特异性识别和检测。通过优化抗体的固定化方法和检测条件，提高检测的灵敏度和选择性，研究不同浓度蛋白质在SERS衬底上的拉曼信号变化规律，建立蛋白质浓度与SERS信号强度之间的定量关系，实现对蛋白质的定量检测。此外，还将其应用于核酸检测，以乙肝病毒DNA等特定核酸序列为检测目标，采用核酸杂交技术，在SERS衬底表面修饰与目标核酸互补的探针序列，当样品中存在目标核酸时，会与探针发生杂交反应，通过检测杂交后的SERS信号实现对核酸的检测。探索不同的核酸杂交条件和信号放大策略，提高对核酸的检测灵敏度和准确性，研究微流控芯片SERS衬底在复杂生物样品（如血清、细胞裂解液等）中对核酸的检测能力，评估其实际应用价值。本研究的创新点主要体现在以下几个方面：一是在制备技术上，提出了纳米压印与金属溅射相结合以及电化学沉积法制备SERS衬底的新方法，相较于传统制备方法，这些新方法具有更高的制备精度和可控性，能够实现纳米结构的精准设计和调控，有望提高SERS衬底的性能和一致性，且电化学沉积法还具有设备简单、成本低的优势，为大规模制备SERS衬底提供了新的途径；二是在生物检测应用方面，针对多种生物分子建立了系统的检测方法，不仅实现了对蛋白质和核酸的高灵敏度检测，还深入研究了在复杂生物样品中的检测性能，拓展了微流控芯片SERS衬底的应用范围，为实际生物检测提供了更全面、有效的解决方案；三是首次将微流控芯片SERS衬底应用于多生物分子同时检测的研究，通过在同一芯片上设计多个检测区域，并结合不同的生物识别探针，实现了对多种生物分子的同步检测，提高了检测效率，为生物检测技术的发展开辟了新的方向。二、微流控芯片SERS衬底原理2.1SERS基本原理2.1.1局域表面等离子共振表面增强拉曼散射（SERS）技术的核心原理之一是局域表面等离子共振（LocalizedSurfacePlasmonResonance，LSPR）。当外界光照射到金属纳米结构时，若入射光的频率与金属纳米结构中传导电子的集体振荡频率相匹配，就会引发局域表面等离子共振现象。在金属材料中，存在着大量的自由电子，这些自由电子在金属晶格中自由移动。当受到外界光激发时，这些自由电子会发生集体振荡，形成表面等离子体。以金、银等贵金属纳米颗粒为例，当光照射到这些纳米颗粒表面时，由于纳米颗粒的尺寸与光的波长在同一数量级，且金属内部存在自由电子，光与金属纳米颗粒相互作用，使得纳米颗粒表面的自由电子发生集体振荡，产生局域表面等离子共振。这种共振现象会导致金属纳米结构表面的局域电场得到极大的增强。从物理本质上看，局域表面等离子共振是光与金属纳米结构中自由电子相互作用的结果，其共振频率与金属纳米结构的尺寸、形状、材料以及周围介质的折射率等因素密切相关。当纳米颗粒的尺寸减小，其表面原子的比例增加，表面效应增强，会导致局域表面等离子共振频率发生蓝移；而当周围介质的折射率增大时，局域表面等离子共振频率则会发生红移。这种增强的局域电场对拉曼散射光的放大起着关键作用。当分子吸附在金属纳米结构表面时，分子所处的局域电场得到增强，分子与光的相互作用被放大。根据经典电磁理论，分子在电场中的极化强度与电场强度成正比，极化强度的变化会导致分子的拉曼散射光强度增强。在局域表面等离子共振的作用下，金属纳米结构表面的局域电场强度可以比入射光场强度增强几个数量级，从而使得吸附在其表面的分子的拉曼散射信号得到显著增强。例如，在对某些生物分子的检测中，由于生物分子本身的拉曼散射信号非常微弱，难以直接检测。但当这些生物分子吸附在具有局域表面等离子共振效应的金属纳米结构表面时，其拉曼散射信号能够被增强到可检测的水平，为生物分子的检测提供了可能。2.1.2拉曼信号增强机制在SERS效应中，拉曼信号的增强主要源于物理增强机制和化学增强机制，其中物理增强机制起主导作用。物理增强机制主要基于局域表面等离子共振引起的电磁场增强。当金属纳米结构发生局域表面等离子共振时，其表面会产生强烈的局域电磁场，吸附在表面的分子所感受到的电场强度大幅增加。根据拉曼散射的经典理论，拉曼散射光强度I_{RS}与分子所处电场强度E的平方成正比，即I_{RS}\proptoE^{2}。在SERS体系中，由于局域表面等离子共振导致的电场增强因子为G_{E}，则SERS信号强度I_{SERS}与普通拉曼信号强度I_{RS}的关系可以表示为：I_{SERS}=G_{E}^{4}I_{RS}。这表明，在物理增强机制下，SERS信号强度与电场增强因子的四次方成正比，电场增强因子越大，SERS信号增强效果越显著。例如，当金属纳米颗粒之间形成纳米间隙时，在局域表面等离子共振的作用下，纳米间隙处的电场会发生“热点”效应，电场强度急剧增强。有研究表明，在一些精心制备的金纳米颗粒二聚体结构中，纳米间隙处的电场增强因子可达10^{4}以上，此时吸附在纳米间隙处的分子的SERS信号强度相较于普通拉曼信号强度可增强10^{16}倍以上。化学增强机制则主要源于分子与金属表面之间的化学相互作用。当分子吸附在金属表面时，分子与金属之间会发生电荷转移，形成化学键或表面络合物，导致分子的电子云分布发生变化，分子的极化率改变，从而增强拉曼散射信号。化学增强机制对拉曼信号的增强倍数通常在10-10^{2}之间。以吡啶分子吸附在银表面为例，吡啶分子通过氮原子与银表面发生化学吸附，形成表面络合物，使得吡啶分子的电子云分布发生变化，其拉曼信号得到增强。这种化学增强机制不仅能增强拉曼信号强度，还可能改变拉曼光谱的峰位和峰形，提供分子与金属表面相互作用的信息。在实际的SERS体系中，物理增强机制和化学增强机制往往同时存在，共同作用于拉曼信号的增强。不同的金属纳米结构、分子种类以及实验条件会导致两种增强机制的相对贡献不同。在一些体系中，物理增强机制的贡献可能占主导地位，而在另一些体系中，化学增强机制也可能对SERS信号的增强起到重要作用。深入理解这两种增强机制，对于优化SERS衬底的设计和提高SERS检测的灵敏度具有重要意义。二、微流控芯片SERS衬底原理2.2微流控芯片与SERS技术结合优势2.2.1样品操控与分析优势微流控芯片能够精确操控微量液体，其微通道尺寸通常在微米级，这使得在纳升级甚至皮升级的液体体积内实现各种复杂的操作成为可能。在微流控芯片中，通过微泵、微阀门等微流控元件的协同作用，可以对液体的流速、流量进行精确控制，从而实现样品的快速进样、混合和反应。例如，在核酸检测实验中，利用微流控芯片可以将核酸提取试剂、扩增试剂以及待测样品精确地混合在一起，并且能够在短时间内完成核酸的提取、扩增等一系列操作，大大缩短了检测时间。这种精确的操控能力还使得微流控芯片能够实现多组分同时分析。在芯片上可以设计多个独立的微通道和反应区域，每个区域可以分别对不同的生物分子进行检测。以蛋白质组学研究为例，通过在微流控芯片上构建多个检测单元，可以同时对多种蛋白质进行检测和分析，获取大量的蛋白质信息。与传统的检测方法相比，微流控芯片的多组分同时分析能力极大地提高了检测效率，减少了样品和试剂的用量，为高通量生物检测提供了有力的技术支持。同时，微流控芯片的集成化特点使得整个检测系统更加紧凑，便于携带和操作，适用于现场快速检测等实际应用场景。在食品安全现场检测中，操作人员可以携带小型化的微流控芯片检测设备，对食品中的多种有害物质进行快速筛查，及时发现食品安全问题。2.2.2增强SERS检测性能微流控芯片为SERS检测提供了稳定的环境，有效增加了检测的灵敏度、稳定性和重现性。在传统的SERS检测中，样品与SERS衬底的接触方式往往不够稳定，导致检测结果的重复性较差。而在微流控芯片中，样品可以在微通道中稳定地流动，与SERS衬底充分接触，减少了样品分布不均匀等因素对检测结果的影响。通过在微流控芯片中设计特殊的结构，如微混合器、微反应器等，可以促进样品与SERS衬底之间的相互作用，提高SERS信号的强度和稳定性。在对生物小分子的检测中，利用微流控芯片中的微混合器可以使生物小分子与SERS衬底上的金属纳米颗粒充分混合，增加分子与纳米颗粒的吸附概率，从而提高SERS信号的强度。微流控芯片还能够实现对检测条件的精确控制，进一步优化SERS检测性能。通过控制微流控芯片中的温度、pH值等参数，可以为SERS检测提供最适宜的环境，提高检测的灵敏度和准确性。在研究生物分子与金属纳米结构之间的相互作用时，通过调节微流控芯片中的温度，可以研究温度对SERS信号的影响，深入了解SERS增强机制。同时，微流控芯片的自动化操作功能使得检测过程更加标准化，减少了人为因素的干扰，提高了检测结果的重现性。在多次重复检测相同样品时，微流控芯片能够保证每次检测的条件一致，从而获得稳定且可靠的检测结果。三、微流控芯片SERS衬底制备方法3.1模板法3.1.1AAO模板制备透明SERS衬底以阳极氧化铝（AAO）模板为基础制备透明SERS衬底是一种较为常用的方法，其制备过程主要包括AAO模板的制备以及后续的金属沉积步骤。首先是AAO模板的制备。选用高纯铝片作为起始材料，将其进行预处理，以去除表面的杂质和油污，保证后续氧化过程的顺利进行。预处理通常采用有机溶剂清洗和去离子水冲洗的方法，如先用丙酮超声清洗，再用无水乙醇清洗，最后用去离子水冲洗干净，并在干燥箱中烘干。随后进行阳极氧化处理，这是制备AAO模板的关键步骤。将预处理后的高纯铝片置于电解液中，一般选用0.2-0.4mol/L的草酸溶液，在30-50V的直流电压下进行阳极氧化，氧化时间为5-7h。在阳极氧化过程中，铝片表面会形成一层氧化铝膜，其内部逐渐形成纳米级的孔洞结构。一次阳极氧化后，表面的氧化铝膜可能存在不规则的孔洞，需要进行去除处理。将一次阳极氧化后的样品浸泡在50-70°C的6wt%磷酸和1.8wt%铬酸的混合溶液中8-10h，以除去表面不规则孔的氧化铝膜。接着进行二次阳极氧化，将去除氧化铝膜后的样品再次放入0.2-0.4mol/L的草酸溶液中，在30-50V直流电压下阳极氧化30-50s，然后在30-50°C下5%的磷酸溶液中扩孔1-3min。通过多次重复氧化和扩孔过程，可以精确控制AAO模板中纳米孔洞的尺寸和规则性。最后，将得到的表面带有尖端纳米结构的AAO模板在原有的氧化条件下继续阳极氧化8-12h，然后选用饱和四氯化锡、氯化汞、氯化铜溶液中任一种去除模板背部的铝片，从而得到透明AAO模板。在获得透明AAO模板后，进行金属沉积以形成具有SERS活性的衬底。通常采用溅射或热蒸发的方法在AAO模板表面沉积金属，如Ag或Au。在溅射过程中，溅射距离控制在1-3cm，溅射电流设置为10-30mA，溅射时间为5-30min。在该过程中，金属颗粒会聚集在暴露出的AAO模板的锥形孔的孔壁上端面，形成纳米柱阵列，同时AAO模板的锥形孔的内壁也会获得纳米颗粒。有研究表明，当溅射时间为14min时，制备的透明SERS衬底具有较好的SERS性能。热蒸发法中，需要将样品放入高真空环境中，通过加热使金属蒸发并沉积在AAO模板表面，具体的蒸发温度和时间根据金属种类和所需沉积厚度进行调整。3.1.2模板法优势与局限性模板法制备SERS衬底具有诸多优势。从结构规整性方面来看，以AAO模板为例，其具有高度有序的纳米孔洞结构，孔洞大小均匀且排列规则。这种规整的结构使得在模板上沉积金属后形成的SERS衬底具有均匀的纳米结构分布，能够提供大量均匀分布的SERS热点。与其他一些制备方法（如纳米颗粒自组装法，其纳米颗粒的分布具有一定随机性）相比，模板法制备的SERS衬底在结构上更加规整，这有助于提高SERS信号的均匀性和稳定性。在对罗丹明6G分子的检测中，利用AAO模板制备的SERS衬底能够获得更加均匀的拉曼信号，减少信号的波动，提高检测的准确性。在信号稳定性方面，模板法制备的SERS衬底表现出色。由于其结构的规整性和稳定性，在多次检测过程中，SERS衬底能够保持相对稳定的性能。与一些胶体溶液法制备的SERS衬底相比，模板法制备的衬底不易受到外界环境因素（如温度、湿度等）的影响，能够在不同的实验条件下保持较好的信号稳定性。在长时间的检测实验中，基于模板法制备的SERS衬底对同一样品的检测信号波动较小，能够为实验提供可靠的数据支持。然而，模板法也存在一定的局限性。制备过程复杂是其主要缺点之一。以AAO模板制备透明SERS衬底为例，需要经过多步阳极氧化、扩孔以及金属沉积等过程，每一步都需要精确控制实验条件，如电解液浓度、电压、时间等参数。任何一个环节的参数偏差都可能影响最终SERS衬底的性能。而且制备过程中涉及到的化学试剂较多，如草酸、磷酸、铬酸等，这些试剂的使用不仅增加了实验操作的复杂性，还可能对环境造成一定的污染。模板法的制备成本相对较高。制备AAO模板需要使用高纯铝片等原材料，并且在制备过程中需要高精度的设备，如直流电源、真空溅射设备等。这些设备的购置和维护成本较高，使得模板法制备SERS衬底的成本增加。同时，由于制备过程复杂，实验失败的概率相对较高，进一步增加了制备成本。这在一定程度上限制了模板法在大规模生产和实际应用中的推广。3.2光刻法3.2.1正性光刻胶与负性光刻胶结合工艺在制备微流控芯片SERS衬底时，正性光刻胶与负性光刻胶结合工艺是一种较为独特且有效的方法，其能够制备出具有特殊三维悬空结构的SERS衬底，显著提升SERS检测性能。首先是SERS衬底基板的准备。选取刚性硬质衬底，如硅片、玻璃片等，这些衬底具有良好的机械性能和化学稳定性，能够为后续的光刻工艺提供稳定的支撑。在刚性硬质衬底上旋涂正性光刻胶，旋涂过程中需精确控制旋涂速度和时间，以确保正性光刻胶均匀地覆盖在衬底表面，形成厚度均匀的正性光刻胶层。一般来说，旋涂速度可控制在3000-5000转/分钟，旋涂时间为30-60秒，形成的正性光刻胶层厚度在0.5-2μm之间。旋涂完成后，将衬底放入烘箱中烘干，烘干温度通常设定在90-110°C，时间为5-10分钟，以去除光刻胶中的溶剂，增强光刻胶与衬底之间的粘附力。接着，在正性光刻胶层上旋涂负性光刻胶，同样要控制好旋涂条件，使负性光刻胶均匀覆盖，形成负性光刻胶层。至此，完成了包含刚性硬质衬底、正性光刻胶层和负性光刻胶层的SERS衬底基板的准备工作。随后进行光刻工艺的关键步骤。利用光刻系统对负性光刻胶层进行曝光，光刻系统通常采用紫外光源，通过掩模版将设计好的图案投射到负性光刻胶层上。曝光过程中，需要精确控制曝光剂量和时间，以确保负性光刻胶层能够准确地记录下图案信息。曝光剂量一般控制在10-50mJ/cm²，曝光时间为10-30秒。曝光结束后，将曝光后的SERS衬底基板放入显影液中进行显影。若负性光刻胶层所用的负性光刻胶为HSQ，显影液可选用TMAH显影液或包含浓度比例为1%-2%的NaOH及浓度比例为3%-5%的NaCl的水溶液。在显影过程中，曝光区域的负性光刻胶会发生交联反应，变得不溶于显影液，而未曝光区域的负性光刻胶则会被显影液溶解去除，从而得到至少一个多聚体结构。显影完成后，对SERS衬底基板进行清洗并吹干，去除残留的显影液和杂质。接着，将得到的多聚体结构作为掩模，对正性光刻胶层进行刻蚀。刻蚀过程可采用反应离子刻蚀（RIE）等技术，通过精确控制刻蚀气体的种类、流量、功率以及刻蚀时间等参数，使多聚体结构与其下方的正性光刻胶层形成上宽下窄的三维悬空结构。在反应离子刻蚀中，常用的刻蚀气体有CF₄、O₂等，刻蚀功率一般为50-150W，刻蚀时间为5-15分钟。最后进行金属沉积，以形成具有SERS活性的衬底。基于低温沉积对三维悬空结构进行金属沉积，可采用电子束蒸发、磁控溅射等方法。在电子束蒸发过程中，将样品放入高真空环境中，通过电子束加热金属（如金、银等）使其蒸发，金属原子在三维悬空结构表面沉积并逐渐形成金属层。蒸发速率一般控制在0.1-1nm/s，沉积厚度为30-80nm。磁控溅射则是在氩气等惰性气体环境中，利用磁场和电场的作用，使氩离子轰击金属靶材，溅射出的金属原子沉积在样品表面形成金属层。溅射功率通常为50-150W，溅射时间为10-30分钟。通过这些步骤，最终得到包括三维悬空金属结构的SERS衬底，这种衬底由于其特殊的三维悬空结构，能够提供更多的SERS热点，有效提高表面增强拉曼光谱检测的灵敏度。3.2.2光刻法在复杂结构制备中的应用光刻法在制备具有复杂图案和结构的SERS衬底方面展现出独特的优势，能够满足不同生物检测需求。在生物检测中，不同的生物分子具有不同的特性和检测要求，因此需要设计和制备与之相匹配的SERS衬底结构。例如，在对蛋白质进行检测时，为了提高蛋白质与SERS衬底的结合效率和检测灵敏度，可利用光刻法制备具有纳米级凹槽或凸起结构的SERS衬底。通过光刻工艺，精确控制凹槽或凸起的尺寸、形状和间距，使其能够与蛋白质分子的大小和形状相适配，增加蛋白质分子与衬底表面的接触面积和相互作用。在制备过程中，利用光刻系统将设计好的凹槽或凸起图案通过掩模版投射到光刻胶层上，经过曝光、显影和刻蚀等步骤，在衬底表面形成相应的结构。刻蚀过程中，通过调整刻蚀参数，如刻蚀气体的流量、功率和时间等，精确控制凹槽或凸起的深度和形状。实验研究表明，当凹槽的宽度为50-100nm，深度为30-50nm，间距为100-200nm时，对蛋白质的吸附和检测效果较好。对于核酸检测，为了实现对特定核酸序列的快速、准确识别和检测，可制备具有微阵列结构的SERS衬底。利用光刻法在衬底表面制备出高密度的微阵列，每个微阵列单元可以固定不同的核酸探针。在光刻过程中，通过多次曝光和显影，结合不同的掩模版，在衬底上构建出精确排列的微阵列图案。微阵列单元的尺寸可控制在1-10μm之间，间距为2-20μm。这样的微阵列结构能够同时对多种核酸进行检测，大大提高了检测效率和准确性。当样品中的核酸与固定在微阵列单元上的探针发生杂交反应时，通过检测杂交后的SERS信号，即可实现对核酸的检测。有研究利用这种具有微阵列结构的SERS衬底对乙肝病毒DNA进行检测，能够在短时间内准确检测出病毒的存在和含量。光刻法还可以制备出具有三维复杂结构的SERS衬底，以满足更复杂的生物检测需求。通过多层光刻和刻蚀技术，结合正性光刻胶与负性光刻胶的不同特性，制备出具有立体纳米结构的SERS衬底。在制备过程中，先在衬底上旋涂一层光刻胶，进行第一次光刻和刻蚀，形成第一层结构；然后再旋涂另一层光刻胶，进行第二次光刻和刻蚀，与第一层结构相结合，形成三维立体结构。这种三维复杂结构能够提供更多的SERS热点，增强SERS信号，提高检测灵敏度。在对细胞表面标志物的检测中，利用这种三维复杂结构的SERS衬底，能够更有效地捕获细胞，增强细胞表面标志物与衬底之间的相互作用，从而实现对细胞表面标志物的高灵敏度检测。3.3飞秒激光技术3.3.1飞秒激光诱导金属三维周期结构飞秒激光作为一种具有超短脉冲宽度和高峰值功率的激光，在材料加工领域展现出独特的优势。利用飞秒激光在玻璃微流道底部加工金属三维周期结构作为SERS基底，为SERS技术的发展开辟了新的路径。飞秒激光诱导金属三维周期结构的原理基于其与物质相互作用的特殊机制。飞秒激光的脉冲宽度极短，通常在飞秒量级（10^{-15}秒），这使得它能够在极短的时间内将能量集中注入到材料表面的微小区域。当飞秒激光照射到金属表面时，由于其超高的峰值功率，会在金属表面产生极高的光场强度，引发多光子吸收和雪崩电离等非线性过程。这些过程导致金属表面的电子迅速获得能量，形成高温、高密度的电子气。电子气与金属晶格之间的强烈相互作用，使得金属晶格在短时间内被加热到极高的温度，甚至超过金属的熔点和沸点，从而引发金属的熔化、汽化和等离子体的形成。在玻璃微流道底部加工金属三维周期结构时，首先需要在微流道底部沉积一层金属薄膜，如金、银等贵金属薄膜。这可以通过物理气相沉积（PVD）、化学气相沉积（CVD）等方法实现。以物理气相沉积中的磁控溅射为例，在氩气等惰性气体环境中，利用磁场和电场的作用，使氩离子轰击金属靶材，溅射出的金属原子在玻璃微流道底部沉积形成薄膜。溅射功率一般控制在50-150W，溅射时间为10-30分钟，以获得厚度适宜的金属薄膜，通常薄膜厚度在30-80nm之间。随后，利用飞秒激光对沉积的金属薄膜进行加工。将飞秒激光聚焦到金属薄膜表面，通过精确控制飞秒激光的参数，如脉冲能量、脉冲宽度、重复频率、扫描速度等，以及光束的聚焦方式和扫描路径，实现对金属薄膜的微纳加工。在加工过程中，飞秒激光的能量被金属薄膜吸收，导致金属薄膜表面的局部区域发生熔化、蒸发和再凝固等过程。通过合理设计扫描路径，如采用周期性的扫描方式，可以在金属薄膜表面形成周期性的微纳结构。在扫描过程中，扫描行间距控制在30-90μm，扫描速率为1mm/s，脉冲能量为1-10μJ，重复频率为1kHz，这样可以制备出具有特定周期和形貌的三维周期结构。这种三维周期结构具有高度的周期性和规则性，能够提供大量均匀分布的SERS热点，有效增强SERS信号。3.3.2飞秒激光技术在微流控芯片中的独特优势飞秒激光技术在微流控芯片中具有精确灵活形成纳米结构的优势。飞秒激光的超短脉冲特性使其能够实现对材料的“冷加工”，即在加工过程中几乎不会产生热扩散和热损伤，从而可以精确地控制加工区域和加工深度。在制备微流控芯片SERS衬底时，通过聚焦飞秒激光，可以在微流控芯片的特定位置形成纳米级别的结构，如纳米孔洞、纳米柱、纳米线等。与传统的光刻技术相比，飞秒激光加工不受光刻胶分辨率的限制，能够制备出更加精细、复杂的纳米结构。在制备具有纳米级凹槽的SERS衬底时，飞秒激光可以精确地控制凹槽的宽度、深度和间距，使其达到纳米尺度，而光刻技术在制备如此精细的结构时会面临分辨率的瓶颈。飞秒激光还可以通过调整光束的聚焦方式和扫描路径，灵活地改变纳米结构的形状和排列方式，以满足不同生物检测的需求。通过飞秒激光的双光子聚合技术，可以在微流控芯片中制备出三维立体的纳米结构，为生物分子的吸附和检测提供更多的活性位点。飞秒激光技术能够实现原位制备，这是其在微流控芯片中的又一显著优势。原位制备是指在微流控芯片的制作过程中，直接在芯片内部或表面制备出所需的功能结构，无需额外的后处理步骤。在微流控芯片中，利用飞秒激光可以直接在微流道的底部或侧壁上加工出金属三维周期结构，形成SERS衬底。这种原位制备的方式不仅简化了制备工艺，减少了制备过程中的误差和污染，还能够更好地与微流控芯片的其他结构集成，提高芯片的整体性能。与传统的制备方法相比，传统方法通常需要先制备SERS衬底，然后再将其与微流控芯片进行组装，这个过程中可能会出现衬底与芯片不匹配、连接不紧密等问题。而飞秒激光原位制备技术可以避免这些问题，直接在微流控芯片内部构建SERS衬底，确保了衬底与芯片的紧密结合和良好的兼容性。在生物检测过程中，原位制备的SERS衬底能够更好地与微流控芯片中的微流道、微混合器等结构协同工作，实现样品的快速处理和高效检测。3.4化学法3.4.1自组装-化学镀法制备SERS基底以某课题组的研究成果为例，其提出了一种新颖的通过自组装-化学镀法在微流控通道中原位制备SERS基底的方法。该方法的具体过程如下：首先对微流控芯片的通道表面进行预处理，使其表面带有特定的官能团，以利于后续纳米颗粒的自组装。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对通道表面进行修饰，将微流控芯片浸泡在浓度为5%的APTES乙醇溶液中30分钟，然后用去离子水冲洗干净并烘干。APTES分子中的乙氧基会与通道表面的羟基发生反应，从而在通道表面引入氨基官能团。接着，将经过修饰的微流控芯片浸泡在纳米银颗粒溶液中，纳米银颗粒会通过与氨基官能团的相互作用，自组装在通道表面。纳米银颗粒溶液的浓度控制在10-3mol/L，浸泡时间为1小时，以确保纳米银颗粒能够均匀地自组装在通道表面。在完成纳米银颗粒的自组装后，进行化学镀过程。将含有化学镀液的溶液注入微流控通道中，化学镀液中包含金属盐（如氯金酸）、还原剂（如柠檬酸钠）以及其他添加剂。在一定的温度和反应时间下，化学镀液中的金属离子会在纳米银颗粒的催化作用下被还原，在纳米银颗粒表面沉积形成金属层，从而构建出具有高活性的SERS基底。化学镀过程中，反应温度控制在60°C，反应时间为30分钟，氯金酸的浓度为10-4mol/L，柠檬酸钠的浓度为10-3mol/L。为了验证该SERS基底的性能，课题组以罗丹明6G作为目标物质进行检测。将不同浓度的罗丹明6G溶液注入制备好的微流控芯片SERS基底通道中，利用拉曼光谱仪对其进行检测。实验结果表明，该SERS基底对罗丹明6G具有良好的检测效果，能够检测到低至10-8mol/L浓度的罗丹明6G。在浓度为10-8mol/L时，罗丹明6G在SERS基底上的拉曼信号强度明显高于其在普通基底上的信号强度，且信号具有较好的稳定性和重复性。通过对不同浓度罗丹明6G的拉曼信号强度进行分析，发现拉曼信号强度与罗丹明6G浓度之间呈现出良好的线性关系，相关系数达到0.98以上，为定量检测提供了可靠的依据。3.4.2原位电沉积与置换法制备纳米结构Parisi等人提出了一种通过原位电沉积和置换法制备新型纳米墙结构微流控SERS芯片的方法。在制备过程中，他们选用了具有特定结构的微流控芯片，在芯片的微通道底部预先设置了电极。首先进行原位电沉积步骤，将含有金属离子的电解液注入微流控通道中，在电极两端施加一定的电压，使金属离子在电场的作用下向电极表面迁移，并在电极表面发生还原反应，沉积形成金属纳米结构。以沉积银纳米结构为例，电解液中硝酸银的浓度为10-2mol/L，施加的电压为1V，电沉积时间为10分钟。在电沉积过程中，通过控制电压、时间和电解液浓度等参数，可以精确调控金属纳米结构的生长速率、尺寸和形貌。随后进行置换法处理，将电沉积后的微流控芯片浸泡在含有另一种金属离子的溶液中，由于金属活动性的差异，电沉积形成的金属纳米结构会与溶液中的金属离子发生置换反应。将电沉积有银纳米结构的芯片浸泡在氯金酸溶液中，银纳米结构会与氯金酸中的金离子发生置换反应，在银纳米结构表面生长出金纳米颗粒，形成银-金复合纳米结构。氯金酸溶液的浓度为10-3mol/L，浸泡时间为5分钟。这种复合纳米结构具有独特的纳米墙形貌，能够提供丰富的SERS热点，有效增强SERS信号。该方法制备的微流控SERS芯片在生物检测中展现出了良好的应用前景。他们将该芯片应用于对DNA片段的检测，利用DNA与纳米结构表面的相互作用，以及SERS技术的高灵敏度，实现了对特定DNA片段的快速、准确检测。在对一段长度为100bp的DNA片段的检测中，该芯片能够检测到低至10-15mol/L浓度的DNA，检测时间仅需15分钟。通过对不同浓度DNA的拉曼信号分析，建立了DNA浓度与SERS信号强度之间的定量关系，为DNA的定量检测提供了新的技术手段。四、微流控芯片SERS衬底在生物检测中的应用4.1生物分子痕量检测4.1.1DNA分子检测案例分析日本理化学研究所的KojiSugioka教授团队展示的新型液面辅助SERS（LI-SERS）微流控技术，为DNA分子的痕量检测提供了新的思路和方法，在生物医学检测领域展现出巨大的潜力。该技术的检测原理基于表面增强拉曼散射（SERS）效应以及独特的液面辅助机制。SERS效应的核心是利用贵金属纳米材料的近场效应，当外界光激发小于光波长的金属纳米结构时，电子会发生集体振荡，形成局域表面等离子共振现象，使得金属表面的局域电场增强，从而对拉曼散射光进行放大。在LI-SERS微流控技术中，通过在玻璃微流道底部构建飞秒激光诱导的金属三维周期结构（LIPSS）作为SERS基底，进一步增强了这种电场增强效果。具体来说，玻璃微流道底部通过飞秒激光选区金属化的方式形成150mm×150mm银金属薄膜，然后利用线偏振飞秒激光二次正交方式扫描刻蚀银薄膜，在其表面形成周期为140nm、沟壑宽40nm的二维结构。这种特殊的二维结构能够产生耦合局域增强电场，即“热点”，使得在金属沟壑内的被检测分子的拉曼信号受到激发，产生10⁶数量级以上的放大。为了进一步提高拉曼信号的增强倍数，LI-SERS技术引入了液面辅助机制。在微流道内部，当拉曼激发光恰好被聚焦在被探测分子溶液的空气-液体界面时，可获得近单分子水平的拉曼信号，实现单分子水平检测本领。这是因为激光照射会引发一系列物理效应，其中激光诱导的Marangoni流与光俘获的协同作用是LI-SERS的关键机制。激光照射使液体界面附近的温度分布不均匀，从而产生Marangoni流，这种流会将分析物分子引导到“热点”区域。同时，光俘获作用会使聚集到“热点”的分子被光学力捕获，从而使分析物分子固定在SERS底物上，实现了强拉曼散射。LI-SERS方法所获得的拉曼增强倍数比传统SERS技术高5-6个数量级，能够实现10¹⁴数量级拉曼信号放大。其实验过程如下：首先采用飞秒激光辅助化学法进行玻璃微流道制备，构建出微流控芯片的基本结构。然后在玻璃微流道底部加工飞秒激光诱导的金属三维周期结构，形成具有高活性的SERS基底。将含有不同碱基构成的DNA分子溶液注入微流控芯片的微流道中。在检测时，精确调整拉曼激发光的聚焦位置，使其聚焦在DNA分子溶液的空气-液体界面。实验结果令人瞩目，该技术成功实现了近单分子水平的脱氧核糖核酸链（DNA）的快速区分和鉴定。从检测灵敏度来看，能够检测到低至10fM浓度的DNA分子，这一检测限远远低于传统检测技术，极大地提高了对痕量DNA分子的检测能力。在区分不同DNA分子方面，通过对比不同碱基构成的DNA分子链的拉曼峰位置和强度，能够快速准确地实现低浓度下核酸物质的鉴别。对于由不同碱基构成的两种DNA分子链，在10fM的低浓度下，通过LI-SERS方法得到的拉曼光谱图中，两种DNA分子的拉曼峰位置和强度存在明显差异，从而可以清晰地区分它们。这一结果表明，LI-SERS微流控技术在DNA分子检测方面具有极高的灵敏度和特异性，为DNA检测领域带来了新的突破，有望在基因诊断、疾病早期检测等领域发挥重要作用。4.1.2蛋白质等生物大分子检测应用SERS微流控芯片在蛋白质检测中具有重要的应用价值，能够实现对蛋白质的高灵敏度、快速检测，为蛋白质相关的生物医学研究和临床诊断提供了有力的技术支持。在检测过程中，首先需要对SERS微流控芯片进行修饰，使其能够特异性地识别和捕获目标蛋白质。通常采用抗体修饰的方法，将针对目标蛋白质的特异性抗体固定在SERS微流控芯片的表面。抗体固定的方法有多种，如物理吸附、化学偶联等。物理吸附是利用抗体与芯片表面之间的范德华力、静电作用等将抗体吸附在芯片表面，操作相对简单，但抗体的固定稳定性较差。化学偶联则是通过化学反应在抗体和芯片表面引入特定的官能团，使两者发生共价结合，这种方法固定的抗体稳定性好，但操作较为复杂，需要精确控制反应条件。以癌胚抗原（CEA）检测为例，可将抗CEA抗体通过化学偶联的方式固定在SERS微流控芯片表面。将含有双硫键的自组装单分子层修饰在芯片表面，然后利用双硫键与抗体上的巯基发生反应，实现抗体的固定。当含有目标蛋白质的样品进入微流控芯片的微流道后，蛋白质会与固定在芯片表面的抗体发生特异性结合。由于SERS微流控芯片的微流道结构能够精确控制液体的流动和混合，使得蛋白质与抗体的结合效率大大提高，能够在短时间内完成反应。结合后的蛋白质会吸附在SERS活性位点附近，在激光激发下，产生表面增强拉曼散射信号。通过检测拉曼信号的强度和特征峰，可以确定蛋白质的存在和浓度。在对不同浓度的CEA进行检测时，随着CEA浓度的增加，SERS信号强度呈现出明显的上升趋势，且拉曼光谱中的特征峰也具有良好的稳定性和可重复性，从而可以建立CEA浓度与SERS信号强度之间的定量关系，实现对CEA的定量检测。然而，在蛋白质检测过程中也面临着一些问题。生物样品的复杂性是一个主要挑战，生物样品中往往含有多种蛋白质、核酸、细胞碎片等成分，这些成分可能会干扰目标蛋白质与抗体的结合，或者对SERS信号产生干扰。血清样品中除了目标蛋白质外，还含有大量的白蛋白、球蛋白等其他蛋白质，这些蛋白质可能会与抗体发生非特异性结合，导致检测结果出现假阳性。此外，生物样品中的杂质可能会吸附在SERS微流控芯片表面，影响SERS活性位点的性能，降低检测灵敏度。为了解决这些问题，研究人员采取了一系列有效的解决方案。在样品预处理方面，采用离心、过滤、免疫沉淀等方法对生物样品进行纯化和富集，去除杂质和干扰物质。通过离心可以去除细胞碎片等较大的颗粒物质，过滤可以进一步去除小分子杂质，免疫沉淀则可以特异性地富集目标蛋白质，提高目标蛋白质的浓度，减少杂质的干扰。在芯片设计方面，优化芯片的表面修饰和微流道结构，提高芯片的选择性和抗干扰能力。在芯片表面修饰一层抗非特异性吸附的材料，如聚乙二醇（PEG）等，减少非特异性蛋白质的吸附。同时，合理设计微流道的形状和尺寸，优化液体的流动模式，提高蛋白质与抗体的结合效率，减少杂质的影响。通过这些解决方案，能够有效提高SERS微流控芯片在蛋白质检测中的准确性和可靠性，推动其在生物医学领域的广泛应用。4.2疾病诊断应用4.2.1阿尔茨海默病早期诊断阿尔茨海默病（AD）是一种严重的神经退行性疾病，其主要病理特征之一是大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集，形成老年斑。Aβ是由淀粉样前体蛋白（APP）经β-和γ-分泌酶水解后产生的一种含有39-43个氨基酸的多肽。在AD的发病过程中，Aβ的聚集会导致神经元损伤和死亡，进而影响大脑的正常功能，出现认知障碍、记忆力减退等症状。目前，AD的早期诊断面临着诸多挑战，传统的诊断方法如临床症状评估、神经心理学测试等往往在疾病发展到一定阶段后才能检测出来，无法实现早期干预和治疗。因此，开发高灵敏度、高特异性的AD早期诊断方法具有重要的临床意义。利用LI-SERS技术检测Aβ为AD的早期诊断提供了新的途径。LI-SERS技术基于表面增强拉曼散射效应，通过在微流控芯片中构建特殊的SERS基底，结合液面辅助机制，实现了对Aβ的超灵敏检测。在LI-SERS微流控芯片中，通过飞秒激光在玻璃微流道底部加工出金属三维周期结构（LIPSS）作为SERS基底。这种基底具有高度规则的纳米结构，能够产生耦合局域增强电场，即“热点”，使被检测分子的拉曼信号得到极大增强。当Aβ分子进入微流道并吸附在SERS基底表面时，在激光激发下，Aβ分子的拉曼信号会被“热点”区域的增强电场放大。在微流道内部，当拉曼激发光聚焦在Aβ分子溶液的空气-液体界面时，激光诱导的Marangoni流与光俘获的协同作用会将Aβ分子引导到“热点”区域，并使分子被光学力捕获，固定在SERS底物上，进一步增强拉曼信号。这种独特的检测机制使得LI-SERS技术能够实现对Aβ的高灵敏度检测，检测限可达1fM。LI-SERS技术在AD早期诊断方面具有广阔的应用前景。由于AD的早期症状不明显，传统检测方法难以在早期发现Aβ的异常变化。而LI-SERS技术的高灵敏度能够在疾病早期检测到极微量的Aβ聚集，为AD的早期诊断提供有力的依据。通过对疑似AD患者脑脊液或血液中的Aβ进行检测，可以在疾病早期发现Aβ的异常升高，从而实现早期诊断和干预。LI-SERS技术还具有检测速度快、操作简便等优点，适合大规模的临床筛查。与传统的检测方法如免疫分析法相比，LI-SERS技术无需复杂的标记和抗体制备过程，能够快速得到检测结果，提高了检测效率。这使得LI-SERS技术有望成为AD早期诊断的重要工具，为AD的防治带来新的希望。4.2.2癌症相关标志物检测癌症严重威胁人类健康，早期诊断对于提高癌症患者的生存率和治疗效果至关重要。微小核糖核酸（miRNA）作为一类非编码RNA，在细胞的生长、分化、凋亡等过程中发挥着重要的调控作用。研究发现，miRNA表达水平的变化与肿瘤细胞的发育和死亡密切相关，因此miRNA成为癌症早期检测的潜在生物标记物。在众多与癌症相关的miRNA中，miR-92a和miR-339-3p具有重要的研究价值。miR-92a在非小细胞肺癌（NSCLC）中过度表达，它能够促进NSCLC细胞的增殖和侵袭，并与NSCLC的不良预后呈正相关。通过比较NSCLC患者和健康人的血清，发现miR-339-3p在NSCLC患者中显著上调，对NSCLC患者具有诊断预测价值。传统的miRNA检测方法，如PCR、Northern印迹和微阵列等，存在灵敏度低、操作复杂、价格昂贵等缺点，不适用于临床大规模检测。而SERS微流控芯片的出现为miRNA检测带来了新的解决方案。SERS微流控芯片利用表面增强拉曼散射技术，能够对miRNA进行高灵敏度检测。在芯片制备过程中，通常采用金银纳米碗阵列等具有独特形貌和良好信号增强特性的结构作为SERS基底。金银纳米碗阵列在颗粒内外形成了许多间隙和边缘，从而形成了更多的“热点”，提高了分析的灵敏度和均一性。在检测miR-92a和miR-339-3p时，首先在SERS基底表面修饰与目标miRNA互补的探针序列。当含有目标miRNA的样品进入微流控芯片的微流道后，miRNA会与探针发生特异性杂交反应。在激光激发下，杂交后的复合物会产生表面增强拉曼散射信号。通过检测拉曼信号的强度和特征峰，可以确定miRNA的存在和浓度。在对NSCLC患者血清中的miR-92a进行检测时，SERS微流控芯片能够检测到低至10-15mol/L浓度的miR-92a，且检测结果与患者的病情严重程度具有良好的相关性。SERS微流控芯片在癌症相关标志物检测方面具有重要的意义。它能够实现对癌症相关miRNA的快速、高灵敏度检测，为癌症的早期诊断提供了有力的技术支持。通过检测血清、尿液等生物样品中的miR-92a和miR-339-3p等标志物，可以在癌症早期发现异常，为患者的治疗争取宝贵的时间。SERS微流控芯片还具有高通量、低成本的优势，适合大规模的临床筛查和诊断。与传统检测方法相比，它能够同时检测多个样品，提高检测效率，降低检测成本。这使得SERS微流控芯片有望在癌症早期诊断领域得到广泛应用，推动癌症诊断技术的发展。4.3致病菌检测4.3.1微流控SERS芯片在致病菌检测中的优势微流控SERS芯片在致病菌检测中具有检测速度快的显著优势。传统的致病菌检测方法，如细菌培养法，需要将样品在特定的培养基中培养，以促进细菌的生长和繁殖，这个过程往往需要较长的时间，一般为1-3天。在临床诊断中，对于感染性疾病患者，快速明确致病菌种类至关重要，细菌培养法的长时间等待可能导致患者错过最佳治疗时机。而微流控SERS芯片利用微流控芯片的微通道结构，能够快速实现样品的进样、混合和反应，结合SERS技术的快速检测特性，可在短时间内完成致病菌的检测。通过优化微流控芯片的微通道设计和液体流动控制，能够使样品与SERS衬底在几分钟内充分接触并发生反应，再利用拉曼光谱仪进行检测，整个检测过程通常可在30分钟以内完成，大大缩短了检测时间，为临床快速诊断提供了有力支持。微流控SERS芯片在检测灵敏度方面也表现出色。传统的免疫检测方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA），虽然具有一定的灵敏度，但对于低浓度的致病菌检测存在局限性，其检测限一般在10³-10⁵CFU/mL（CFU：菌落形成单位）。微流控SERS芯片基于表面增强拉曼散射效应，能够将致病菌表面的分子拉曼信号增强多个数量级，从而实现对极低浓度致病菌的检测。通过在微流控芯片中构建具有高活性的SERS基底，如金银纳米碗阵列等，能够提供丰富的SERS热点，进一步提高检测灵敏度。实验研究表明，微流控SERS芯片对某些致病菌的检测限可低至10-10²CFU/mL，比传统免疫检测方法提高了1-3个数量级，能够检测到更微量的致病菌，有助于早期发现感染源，及时采取防控措施。在选择性方面，微流控SERS芯片同样具有明显优势。传统的致病菌检测方法可能存在交叉反应等问题，导致检测结果的准确性受到影响。例如，一些基于抗体的检测方法，由于抗体的特异性并非绝对完美，可能会与其他类似的细菌或生物分子发生非特异性结合，产生假阳性结果。微流控SERS芯片可以通过在SERS衬底表面修饰特异性的识别分子，如抗体、适配体等，实现对特定致病菌的精准识别和检测。这些特异性识别分子能够与目标致病菌表面的抗原或受体发生特异性结合，而对其他非目标生物分子具有较低的亲和力，从而有效提高检测的选择性。在对大肠杆菌O157:H7的检测中，通过在微流控SERS芯片表面修饰针对大肠杆菌O157:H7的特异性抗体，能够准确地检测出该致病菌，而对其他种类的大肠杆菌及常见的肠道细菌几乎没有交叉反应，提高了检测结果的可靠性。4.3.2实际案例分析在一项关于微流控SERS芯片用于致病菌检测的研究中，研究人员针对食源性致病菌大肠杆菌O157:H7展开了实验。实验设计围绕微流控SERS芯片的制备和检测方法的建立进行。在微流控SERS芯片制备方面，采用模板法制备具有高度有序纳米结构的SERS基底。选用阳极氧化铝（AAO）模板，通过精确控制阳极氧化的电压、时间和电解液浓度等参数，制备出具有规则纳米孔洞结构的AAO模板。在0.3mol/L的草酸溶液中，在40V直流电压下阳极氧化6h，制备出一次阳极氧化AAO模板，然后经过去除氧化铝膜、二次阳极氧化和扩孔等步骤，得到最终的AAO模板。在AAO模板表面通过溅射的方法沉积银纳米颗粒，形成具有SERS活性的衬底。溅射过程中，溅射距离控制在2cm，溅射电流为20mA，溅射时间为20min。将制备好的SERS衬底集成到微流控芯片的微通道中，构建出微流控SERS芯片。检测过程如下：首先对待测样品进行预处理，将可能含有大肠杆菌O157:H7的食品样品进行匀浆处理，然后通过离心、过滤等方法进行初步分离和富集，以提高样品中大肠杆菌O157:H7的浓度，减少杂质的干扰。将预处理后的样品注入微流控SERS芯片的微通道中，样品在微通道中与SERS衬底充分接触。由于在SERS衬底表面修饰了针对大肠杆菌O157:H7的特异性抗体，当样品中存在大肠杆菌O157:H7时，细菌会与抗体发生特异性结合，吸附在SERS衬底表面。利用拉曼光谱仪对吸附有大肠杆菌O157:H7的SERS衬底进行检测，在激光激发下，大肠杆菌O157:H7表面的分子会产生表面增强拉曼散射信号。实际应用效果显著。该微流控SERS芯片对大肠杆菌O157:H7的检测限低至50CFU/mL，能够检测到极低浓度的致病菌。在对实际食品样品的检测中，与传统的细菌培养法相比，微流控SERS芯片的检测速度大大提高，从传统方法的2-3天缩短至30分钟以内。在检测10份含有不同浓度大肠杆菌O157:H7的食品样品时，微流控SERS芯片能够准确地检测出其中8份样品中的致病菌，检测准确率达到80%，而传统细菌培养法虽然能够准确检测出所有阳性样品，但检测时间较长。微流控SERS芯片的检测结果与传统方法具有良好的一致性，且具有快速、灵敏的优势，在食源性致病菌检测领域展现出了良好的应用前景，能够为食品安全监测提供高效、准确的检测手段。五、结论与展望5.1研究成果总结本研究围绕微流控芯片SERS衬底展开，在制备方法和生物检测应用方面取得了一系列重要成果。在制备方法上，对多种创新技术进行了深入探索。模板法中，通过精确控制AAO模板的制备工艺，包括阳极氧化、扩孔等步骤，成功制备出具有高度有序纳米结构的透明SERS衬底。在AAO模板制备过程中，对电解液浓度、电压、时间等参数的