微米管表面CHA放大策略实现miRNA - 21高灵敏检测研究

微米管表面CHA放大策略实现miRNA-21高灵敏检测研究一、引言1.1miRNA-21检测的意义癌症，作为全球公共卫生领域的重大挑战，严重威胁着人类的生命健康与生活质量。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，当年全球新发癌症病例1929万例，癌症死亡病例996万例。这一严峻的数据表明，癌症已成为导致人类死亡的主要原因之一，给家庭、社会和医疗系统带来了沉重的负担。在癌症的早期诊断、治疗监测和预后评估等关键环节中，肿瘤标志物的检测发挥着不可或缺的重要作用，为癌症的精准防控提供了关键的技术支撑。微小核糖核酸（miRNA），作为一类内源性的小分子单链非编码RNA，长度约为18-25个核苷酸，在细胞生长、分化、凋亡、代谢等多种重要的生物学过程中扮演着核心调控角色。它们通过与靶mRNA的互补配对结合，在转录后水平上对基因表达进行精细调控，从而影响细胞的各种生理功能和病理进程。大量的研究表明，miRNA的异常表达与多种疾病的发生发展密切相关，尤其是在癌症领域，miRNA的失调被认为是癌症发生发展的重要分子机制之一。miRNA-21，作为众多miRNA中的一种，因其在多种癌症中的显著异常表达而备受关注，被公认为是一种极具潜力的肿瘤标志物。研究发现，miRNA-21在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等多种常见恶性肿瘤组织和体液中呈现出高表达状态，且其表达水平与肿瘤的发生、发展、转移、侵袭、预后等密切相关。例如，在乳腺癌中，miRNA-21的高表达与肿瘤的恶性程度增加、淋巴结转移以及患者的不良预后显著相关；在肺癌中，miRNA-21的异常上调参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡抵抗、迁移和侵袭等过程，并且与肺癌的分期、病理类型和患者的生存时间密切相关。此外，miRNA-21还被报道在心血管疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等其他非肿瘤性疾病中也发挥着重要的调控作用，进一步凸显了其在疾病诊断和治疗中的重要价值。在癌症的早期诊断方面，miRNA-21具有独特的优势。传统的癌症诊断方法，如组织活检、影像学检查等，往往存在一定的局限性，如组织活检属于侵入性检查，会给患者带来痛苦和风险，且可能存在取样误差；影像学检查对于早期癌症的检测灵敏度较低，容易漏诊。而miRNA-21可以在血液、唾液、尿液等多种体液中稳定存在，通过检测这些体液中的miRNA-21水平，有望实现癌症的早期无创或微创诊断，为患者的早期治疗提供宝贵的时间窗。例如，研究人员通过对大量癌症患者和健康对照者的血清样本进行检测分析，发现血清中miRNA-21的表达水平在癌症患者中显著高于健康人群，且在癌症的早期阶段就已经出现明显变化，这表明miRNA-21可以作为一种潜在的早期癌症诊断标志物，用于癌症的早期筛查和预警。在治疗监测方面，miRNA-21可以作为评估癌症治疗效果和监测肿瘤复发的重要指标。在癌症治疗过程中，如手术、化疗、放疗、靶向治疗等，患者体内的miRNA-21水平会随着治疗的进行而发生动态变化。通过实时监测miRNA-21的表达水平，可以及时了解肿瘤细胞对治疗的反应，评估治疗效果，为临床医生调整治疗方案提供重要依据。例如，在化疗过程中，如果患者体内的miRNA-21水平随着化疗的进行逐渐下降，说明肿瘤细胞对化疗药物敏感，治疗效果较好；反之，如果miRNA-21水平持续升高或没有明显变化，则提示肿瘤细胞可能对化疗药物产生耐药性，需要及时更换治疗方案。此外，miRNA-21还可以用于监测肿瘤的复发情况。在癌症患者经过治疗后达到临床缓解期时，通过定期检测miRNA-21的水平，可以早期发现肿瘤的复发迹象，及时采取干预措施，提高患者的生存率和生活质量。在预后评估方面，miRNA-21的表达水平与癌症患者的预后密切相关。大量的临床研究表明，高表达的miRNA-21通常预示着癌症患者的不良预后，包括较短的无病生存期、总生存期和较高的复发转移率。通过检测miRNA-21的表达水平，可以对癌症患者的预后进行准确评估，为患者的个性化治疗和随访管理提供重要参考。例如，对于miRNA-21高表达的癌症患者，临床医生可以采取更加积极的治疗策略，加强随访监测，以降低患者的复发转移风险，改善患者的预后。综上所述，miRNA-21作为一种重要的肿瘤标志物，在多种癌症的早期诊断、治疗监测和预后评估中具有关键作用，其检测对于癌症的精准防控具有重要的临床意义和应用价值。然而，由于miRNA-21在生物样本中的含量极低，且存在序列相似性高、易降解等特点，使得其高灵敏、高特异性检测面临着巨大的挑战。因此，开发一种高效、灵敏、特异的miRNA-21检测方法具有迫切的现实需求和重要的科学意义，对于推动癌症的早期诊断和治疗，改善患者的预后具有重要的推动作用。1.2现有miRNA-21检测方法概述目前，针对miRNA-21的检测已发展出多种方法，这些方法各有优劣，在实际应用中发挥着不同的作用。传统的检测方法主要包括定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）、微阵列杂交和RNA印迹（Northernblotting）等，它们在miRNA-21检测的发展历程中占据着重要地位，为后续新方法的开发提供了基础和借鉴。qRT-PCR被广泛认为是miRNA检测的金标准，其原理是先将miRNA逆转录为cDNA，再使用特异性引物对cDNA进行扩增，通过实时监测扩增过程中的荧光信号来实现对miRNA-21的定量检测。该方法具有灵敏度高、特异性强的显著优点，能够检测到极低丰度的miRNA-21，并且可以对其进行精确的定量分析。这使得qRT-PCR在临床诊断、基础研究等领域得到了广泛应用，为疾病的诊断、治疗监测和预后评估提供了重要的技术支持。然而，qRT-PCR也存在一些局限性。首先，其操作过程较为复杂，需要专业的技术人员和昂贵的仪器设备，这限制了其在一些资源有限的地区或基层医疗机构的应用。其次，该方法对样本的质量和完整性要求较高，样本的提取、保存和处理过程中的任何不当操作都可能影响检测结果的准确性。此外，qRT-PCR只能检测已知序列的miRNA-21，对于新发现的或序列未知的miRNA-21则无法进行检测。微阵列杂交技术则是将大量的寡核苷酸探针固定在芯片表面，与标记后的miRNA样本进行杂交，通过检测杂交信号的强度来分析miRNA-21的表达水平。该技术的最大优势在于能够实现高通量检测，可以同时对多个样本中的多种miRNA进行分析，大大提高了检测效率。这使得微阵列杂交技术在大规模基因表达谱分析、疾病标志物筛选等研究中具有重要的应用价值。然而，微阵列杂交技术也存在一些不足之处。其灵敏度相对较低，对于低丰度表达的miRNA-21检测效果不佳，容易出现假阴性结果。此外，该技术的重复性较差，不同批次实验之间的结果可能存在较大差异，这限制了其在临床诊断中的应用。而且，微阵列杂交技术需要使用预定义的miRNA探针库，对于一些新发现的或未包含在探针库中的miRNA-21则无法进行检测。RNA印迹是一种经典的基于探针杂交技术的miRNA检测方法，它不仅可以用来检测成熟的miRNA-21，也可以检测其前体。该方法的原理是先将RNA样本进行凝胶电泳分离，然后转移至固相膜上，与标记后的探针进行杂交，通过检测杂交信号来确定miRNA-21的存在和表达水平。RNA印迹法不需要扩增，在检测过程中序列中的碱基不发生改变，也不被修饰，因此其结果比较可靠，能够直接反映miRNA-21的原始状态。然而，RNA印迹法也存在诸多缺点。其灵敏度较低，检测限通常在nmol/L～pmol/L之间，对于低丰度表达的miRNA-21难以检测到。该方法为低通量检测，一次只能检测少量样本，检测效率较低。而且，RNA印迹法需要大量的RNA样本，对于一些临床样本量有限的情况不太适用。此外，该方法只能对miRNA-21进行半定量分析，无法精确确定其表达量，并且实验过程中RNA易降解，对实验操作要求较高。随着科技的不断进步，新兴的miRNA-21检测技术也不断涌现，为解决传统检测方法的局限性提供了新的思路和途径。这些新兴技术主要包括基于纳米材料的检测技术、核酸扩增技术、生物传感器技术等，它们在灵敏度、特异性、操作简便性等方面展现出独特的优势。基于纳米材料的检测技术利用纳米材料的独特物理和化学性质，如高比表面积、良好的导电性、荧光特性等，来实现对miRNA-21的高灵敏检测。例如，金纳米粒子具有独特的表面等离子体共振特性，其颜色会随着周围环境的变化而发生改变。当金纳米粒子与miRNA-21特异性结合后，会导致其表面等离子体共振发生变化，从而引起颜色的变化，通过肉眼或光谱仪即可对miRNA-21进行检测。这种基于金纳米粒子的比色法检测技术具有操作简单、快速、可视化等优点，无需复杂的仪器设备，可实现现场快速检测。此外，量子点、碳纳米管、石墨烯等纳米材料也被广泛应用于miRNA-21的检测中。量子点具有优异的荧光性能，其荧光强度高、稳定性好、发射光谱窄且可通过改变组成和尺寸进行调节，可作为荧光探针用于miRNA-21的检测，提高检测的灵敏度和准确性。碳纳米管和石墨烯具有良好的电学性能和生物相容性，可用于构建电化学传感器，实现对miRNA-21的电化学检测，具有响应速度快、灵敏度高、成本低等优点。然而，基于纳米材料的检测技术也面临一些挑战。纳米材料的制备和修饰过程较为复杂，需要严格控制实验条件，以确保其性能的稳定性和重复性。此外，纳米材料与生物分子的相互作用机制尚不完全清楚，可能会对检测结果产生影响，需要进一步深入研究。核酸扩增技术是通过对miRNA-21进行特异性扩增，从而提高其检测灵敏度的一类技术。常见的核酸扩增技术包括环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、杂交链式反应（HCR）和催化发卡自组装反应（CHA）等。LAMP技术是一种等温核酸扩增技术，它利用一组特异性引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下实现对靶核酸的快速扩增。该技术具有扩增效率高、特异性强、反应速度快等优点，可在短时间内将靶核酸扩增数百万倍，大大提高了检测灵敏度。而且，LAMP技术操作简单，不需要昂贵的仪器设备，可在基层医疗机构或现场检测中应用。RPA技术也是一种等温扩增技术，它利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶等在常温下实现对靶核酸的扩增。该技术具有扩增速度快、灵敏度高、对样本要求低等优点，可在37℃左右的常温条件下快速完成扩增反应，适用于各种复杂样本的检测。HCR技术是一种无酶核酸扩增技术，它基于DNA链取代反应，在靶分子的引发下，两种DNA发夹结构的茎环交替开环，自组装形成包含大量重复单元的线性双链DNA纳米结构，从而实现信号的放大。该技术具有操作简单、无酶参与、扩增效率较高等优点，可在等温条件下进行，避免了酶的使用带来的一些问题。CHA技术是在HCR技术基础上发展起来的一种更高效、更灵敏的无酶信号放大技术。在CHA反应中，靶标触发级联放大效应后并不会作为生成物的一部分参与后续延伸，而是会被重新释放到体系中充当“催化剂”继续触发下一段CHA反应，产生更明显的信号放大效果。无酶催化的CHA具有更高灵敏度和放大效率，在微量靶标的检测中具有独特的优势。然而，核酸扩增技术也存在一些问题。例如，扩增过程中可能会出现非特异性扩增，导致假阳性结果的产生，需要对引物设计、反应条件等进行优化，以提高扩增的特异性。此外，核酸扩增技术对反应体系的要求较高，需要严格控制反应条件，以确保扩增的准确性和重复性。生物传感器技术是将生物识别元件与物理或化学换能器相结合，通过检测生物分子之间的特异性相互作用产生的信号变化，来实现对miRNA-21的检测。常见的生物传感器包括电化学传感器、光学传感器、压电传感器等。电化学传感器利用电极表面的生物分子与miRNA-21发生特异性结合后，引起电极表面电荷分布或电流、电位等电化学信号的变化，通过检测这些信号的变化来实现对miRNA-21的检测。该传感器具有灵敏度高、响应速度快、成本低等优点，可实现对miRNA-21的快速、实时检测。光学传感器则是利用光信号的变化来检测miRNA-21，如荧光传感器、表面等离子共振传感器等。荧光传感器通过标记荧光基团，当荧光基团与miRNA-21特异性结合后，荧光信号会发生变化，通过检测荧光信号的强度、波长等变化来实现对miRNA-21的检测。表面等离子共振传感器则是利用金属表面等离子体共振现象，当miRNA-21与固定在金属表面的探针特异性结合后，会引起金属表面等离子体共振的变化，通过检测这种变化来实现对miRNA-21的检测。该传感器具有灵敏度高、无需标记、实时检测等优点，可用于对miRNA-21的无标记检测。压电传感器则是利用压电材料在受到压力或应力作用时产生电荷的特性，当miRNA-21与固定在压电材料表面的探针特异性结合后，会引起压电材料表面质量的变化，从而导致压电信号的变化，通过检测这些信号的变化来实现对miRNA-21的检测。生物传感器技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强、可实现实时检测等优点，在miRNA-21检测领域具有广阔的应用前景。然而，生物传感器技术也面临一些挑战。生物识别元件的稳定性和特异性有待进一步提高，以确保传感器的长期稳定性和准确性。此外，传感器的制备工艺和检测方法还需要不断优化，以提高其检测性能和可靠性。综上所述，现有miRNA-21检测方法在灵敏度、特异性、操作复杂度、检测成本等方面存在各自的优缺点。传统检测方法虽然技术成熟，但在灵敏度和操作简便性等方面存在一定的局限性；新兴检测技术虽然展现出独特的优势，但仍面临一些技术挑战和问题，需要进一步的研究和优化。因此，开发一种高效、灵敏、特异、操作简便且成本低廉的miRNA-21检测方法仍然是当前研究的重点和难点。1.3CHA放大方法及微米管在生物检测中的应用进展杂交链式反应（HCR）是一种基于DNA链取代反应的等温信号放大技术，在HCR体系中，靶分子引发两种DNA发夹结构的茎环交替开环，自组装形成包含大量重复单元的线性双链DNA纳米结构，从而实现信号的放大，其放大效率达10⁴-10⁶倍。催化发卡自组装反应（CHA）则是在HCR技术基础上发展起来的一种更为高效、灵敏的无酶信号放大技术。二者的主要区别在于，CHA反应中靶标触发级联放大效应后并不会作为生成物的一部分参与后续延伸，而是会被重新释放到体系中充当“催化剂”继续触发下一段CHA反应，产生更明显的信号放大效果。在CHA反应中，通常设计两组具有发夹结构的互补单链DNA探针。当目标核酸不存在时，两组单链DNA均以发夹结构稳定存在；而当系统中存在目标核酸时，在目标核酸的催化作用下，两组发夹结构的单链DNA探针会依次打开发夹结构，并通过碱基互补配对形成DNA双链。整个催化过程中并不消耗目标核酸，目标核酸促发两组单链DNA探针形成双链后，继续进入下一轮的反应，从而实现信号的循环放大。例如，在检测某种特定的miRNA时，将与该miRNA互补的一段DNA序列作为触发链，当体系中存在目标miRNA时，miRNA与触发链结合，打开第一个发夹探针的茎环结构，随后第二个发夹探针与第一个发夹探针的部分序列互补结合，依次类推，不断循环，形成大量的双链DNA产物，实现对目标miRNA的信号放大检测。CHA放大方法具有诸多显著优势。首先，它是一种无酶催化的反应，避免了酶的使用带来的一些问题，如酶的活性易受温度、pH值等环境因素的影响，酶的保存和运输条件较为苛刻等。CHA反应在等温条件下即可进行，无需复杂的温度控制设备，反应条件温和，操作简便，可大大缩短检测时间，提高检测效率。其次，CHA反应具有极高的灵敏度，能够检测到极低浓度的靶标分子。这是由于靶标分子在反应中起到“催化剂”的作用，不断循环触发CHA反应，使得信号得到极大程度的放大。研究表明，CHA技术能够检测到低至皮摩尔（pM）甚至飞摩尔（fM）级别的核酸分子，在微量靶标的检测中具有独特的优势。此外，CHA反应的特异性强，通过合理设计发夹探针的序列，可以使反应高度特异性地识别目标核酸分子，有效减少非特异性反应的发生，提高检测的准确性。由于这些优势，CHA放大方法在核酸检测领域得到了广泛的应用。在疾病诊断方面，CHA技术被用于多种疾病相关的核酸标志物的检测，如病毒核酸、肿瘤标志物等。例如，在病毒检测中，利用CHA技术可以快速、灵敏地检测出病毒的核酸，为病毒感染的早期诊断提供了有力的技术支持。在肿瘤标志物检测中，CHA技术能够检测到肿瘤细胞中异常表达的miRNA、mRNA等核酸分子，有助于肿瘤的早期诊断和预后评估。在生物传感领域，CHA技术与各种传感器相结合，如电化学传感器、荧光传感器、表面等离子共振传感器等，构建出高灵敏的生物传感器。这些生物传感器能够实现对生物分子的实时、原位检测，具有广阔的应用前景。在基因表达分析方面，CHA技术可以用于检测细胞内特定基因的表达水平，为基因功能研究和疾病发病机制的探讨提供了重要的技术手段。微米管作为一种具有独特结构和性质的材料，在生物检测领域也展现出了巨大的应用潜力。微米管通常是指管径在微米级别的管状结构，其管壁厚度可以在纳米级到微米级之间。常见的微米管材料包括碳微米管、聚合物微米管、无机氧化物微米管等。碳微米管具有与碳纳米管相似的管状结构，在保持纳米级管壁厚度的同时，能拥有微米级的管径，巨大的管壁外表面，相当于一张微米级的石墨烯网状膜，因此碳微米管能同时拥有碳纳米管和石墨烯的独特物理和化学性能。聚合物微米管则可以通过多种方法制备，如模板法、相分离法、静电纺丝法等，其具有良好的生物相容性、可加工性和功能化特性。无机氧化物微米管如二氧化硅微米管、氧化锌微米管等，具有优异的化学稳定性、光学性能和电学性能。微米管的独特结构和性质使其在生物分子检测领域具有一系列突出的优势。首先，微米管具有较大的比表面积，能够提供更多的结合位点，有利于生物分子的吸附和固定。这使得微米管在生物传感器的构建中具有重要的应用价值，可以提高传感器的灵敏度和检测性能。其次，微米管的管状结构可以作为生物分子的传输通道，实现生物分子的定向传输和富集。例如，在微流控芯片中，微米管可以作为微通道，用于生物样品的输送和分离，提高分析效率。此外，微米管的尺寸和形状可以精确控制，通过改变制备方法和工艺参数，可以制备出具有不同管径、管壁厚度和长度的微米管，以满足不同生物检测应用的需求。微米管还可以进行表面修饰，通过在其表面引入各种功能基团，如氨基、羧基、巯基等，可以实现对生物分子的特异性识别和结合，进一步提高其在生物检测中的应用性能。在实际应用中，微米管在生物分子检测领域取得了一系列令人瞩目的成果。在蛋白质检测方面，利用微米管的高比表面积和表面可修饰性，将特异性识别蛋白质的抗体或适配体固定在微米管表面，构建蛋白质传感器。当样品中的目标蛋白质与微米管表面的识别分子结合时，会引起微米管表面物理或化学性质的变化，通过检测这些变化可以实现对蛋白质的定量检测。在核酸检测方面，微米管同样发挥着重要作用。例如，将核酸探针固定在微米管表面，利用核酸杂交原理，可以实现对目标核酸的特异性检测。此外，微米管还可以作为核酸扩增反应的载体，将核酸扩增试剂装载到微米管内，在微米管内进行核酸扩增反应，提高扩增效率和灵敏度。在细胞检测方面，微米管可以用于细胞的捕获、分离和分析。通过在微米管表面修饰细胞特异性识别分子，如细胞黏附分子、抗体等，可以实现对特定细胞的选择性捕获和分离。同时，微米管还可以作为细胞培养的微环境，模拟细胞在体内的生长环境，研究细胞的生长、分化和代谢等过程。CHA放大方法以其独特的信号放大机制和优势，在核酸检测领域展现出重要的应用价值；微米管凭借其特殊的结构和性质，在生物分子检测领域取得了丰富的应用成果。将CHA放大方法与微米管相结合，有望开发出更加高效、灵敏、特异的生物检测技术，为生物医学研究和临床诊断提供强有力的技术支持。1.4研究目的与创新点本研究旨在开发一种基于微米管表面的CHA放大方法，实现对miRNA-21的高灵敏性检测，以满足癌症早期诊断和治疗监测等临床需求。具体研究目标包括：构建基于微米管表面的CHA反应体系，优化反应条件，提高检测灵敏度和特异性；利用微米管的独特结构和性质，结合CHA的信号放大优势，实现对低丰度miRNA-21的高效检测；将该方法应用于实际生物样本（如血清、细胞裂解液等）中miRNA-21的检测，验证其在临床诊断中的可行性和可靠性。本研究的创新点主要体现在以下几个方面：一是首次将微米管与CHA放大方法相结合，利用微米管的大比表面积和良好的生物相容性，为CHA反应提供更多的结合位点和稳定的反应环境，增强了信号放大效果，提高了检测灵敏度；二是通过合理设计CHA反应中的发夹探针和触发链，使其能够特异性地识别miRNA-21，有效减少了非特异性反应的干扰，提高了检测的特异性；三是该检测方法操作简便、成本低廉，无需复杂的仪器设备和专业的技术人员，有望实现现场快速检测，为癌症的早期诊断和基层医疗提供了新的技术手段。二、相关理论基础2.1miRNA-21的生物学特性2.1.1miRNA-21的结构与功能miRNA-21是一种内源性的非编码单链RNA，其成熟序列长度约为22个核苷酸。在人类基因组中，miRNA-21基因位于17号染色体上（17q23.2），其编码基因由3个外显子组成。miRNA-21的初级转录本（pri-miRNA-21）在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录生成，长度可达几百到几千个核苷酸。pri-miRNA-21具有典型的茎环结构，在Drosha-DGCR8复合体的作用下，被切割成约70-100个核苷酸的前体miRNA（pre-miRNA-21）。pre-miRNA-21通过Exportin-5转运到细胞质中，在Dicer酶的作用下，进一步切割成为成熟的miRNA-21。成熟的miRNA-21与AGO蛋白等形成RNA诱导沉默复合体（RISC），通过与靶mRNA的3’非翻译区（3’UTR）互补配对，抑制靶mRNA的翻译过程，或者在完全互补配对的情况下，介导靶mRNA的降解，从而实现对基因表达的调控。miRNA-21在细胞的多种生理过程中发挥着关键作用。在细胞增殖方面，研究表明miRNA-21可以通过调控相关靶基因，促进细胞的增殖。例如，在乳腺癌细胞中，miRNA-21通过抑制程序性细胞死亡蛋白4（PDCD4）的表达，解除PDCD4对细胞增殖的抑制作用，从而促进乳腺癌细胞的增殖。在细胞凋亡过程中，miRNA-21则扮演着抗凋亡的角色。在神经细胞中，miRNA-21通过靶向作用于富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域1（LRIG1），抑制LRIG1的表达，进而激活PI3K/AKT信号通路，抑制神经细胞的凋亡。在细胞迁移和侵袭方面，miRNA-21同样发挥着重要作用。在结直肠癌细胞中，miRNA-21通过抑制基质金属蛋白酶组织抑制剂3（TIMP3）的表达，促进基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，从而降解细胞外基质，增强结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。此外，miRNA-21还参与了细胞的分化、代谢等多种生理过程，并且在不同的细胞类型和生理病理状态下，其调控机制和作用靶点可能存在差异。例如，在脂肪细胞分化过程中，miRNA-21通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）等相关基因的表达，影响脂肪细胞的分化进程。在心血管系统中，miRNA-21参与了心肌细胞的肥大、纤维化以及血管平滑肌细胞的增殖和迁移等过程，与心血管疾病的发生发展密切相关。2.1.2miRNA-21在疾病中的异常表达大量的研究表明，miRNA-21在多种疾病中呈现出异常表达，尤其是在癌症领域，其异常表达与癌症的发生、发展、转移和预后密切相关。在乳腺癌中，miRNA-21的表达水平显著升高，且与肿瘤的大小、淋巴结转移和患者的预后密切相关。研究发现，miRNA-21通过抑制乳腺癌细胞中的多个靶基因，如PDCD4、PTEN等，促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。其中，PDCD4是一种肿瘤抑制因子，miRNA-21通过与PDCD4mRNA的3’UTR互补配对，抑制其翻译过程，从而解除PDCD4对乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用。PTEN则是一种重要的抑癌基因，其编码的蛋白具有磷酸酶活性，能够负向调控PI3K/AKT信号通路。miRNA-21通过抑制PTEN的表达，激活PI3K/AKT信号通路，促进乳腺癌细胞的存活、增殖和迁移。临床研究表明，乳腺癌患者血清中miRNA-21的表达水平越高，患者的无病生存期和总生存期越短，复发转移的风险越高。在肺癌中，miRNA-21同样高表达，并且与肺癌的分期、病理类型和患者的生存时间密切相关。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，miRNA-21通过抑制多个靶基因，如TIMP3、RECK等，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。TIMP3和RECK都是MMPs的抑制剂，miRNA-21通过抑制它们的表达，使得MMPs的活性增强，从而降解细胞外基质，为肺癌细胞的迁移和侵袭提供条件。此外，miRNA-21还参与了肺癌细胞的耐药过程。研究发现，miRNA-21通过调控相关靶基因，影响肺癌细胞对化疗药物的敏感性，高表达的miRNA-21使得肺癌细胞对化疗药物产生耐药性，降低了化疗的疗效。在结直肠癌中，miRNA-21的表达上调与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。miRNA-21通过抑制结直肠癌细胞中的靶基因，如PDCD4、TIMP3等，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。在结直肠癌的早期阶段，miRNA-21的表达水平就已经开始升高，并且随着肿瘤的进展，其表达水平进一步增加。临床研究表明，结直肠癌患者血清中miRNA-21的表达水平与肿瘤的分期、淋巴结转移和远处转移密切相关，可作为评估结直肠癌患者预后的重要指标。除了上述癌症类型外，miRNA-21在肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌等多种癌症中也呈现出高表达状态，并且通过调控不同的靶基因，参与肿瘤的发生、发展、转移和耐药等过程。例如，在肝癌中，miRNA-21通过抑制PTEN、SOCS3等靶基因，激活PI3K/AKT和JAK/STAT信号通路，促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭；在胰腺癌中，miRNA-21通过抑制TIMP3、PDCD4等靶基因，促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并且与胰腺癌的预后不良相关；在前列腺癌中，miRNA-21的表达水平升高与肿瘤的恶性程度增加和患者的预后不良相关；在胃癌中，miRNA-21通过抑制多个靶基因，如PTEN、RECK等，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，miRNA-21的异常表达还与心血管疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等非肿瘤性疾病密切相关。在心血管疾病中，miRNA-21参与了心肌梗死、心肌肥大、动脉粥样硬化等疾病的发生发展过程。在心肌梗死中，miRNA-21的表达水平在梗死心肌组织中显著升高，通过抑制相关靶基因，如PTEN、PDCD4等，促进心肌细胞的凋亡和纤维化，加重心肌损伤；在心肌肥大中，miRNA-21通过调控相关靶基因，如MEF2A、HDAC4等，促进心肌细胞的肥大；在动脉粥样硬化中，miRNA-21通过抑制相关靶基因，如TIMP3、PTEN等，促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移，加速动脉粥样硬化的进程。在神经系统疾病中，miRNA-21参与了神经退行性疾病、脑缺血等疾病的发生发展过程。在阿尔茨海默病中，miRNA-21的表达水平在患者的脑组织中发生改变，通过调控相关靶基因，如APP、BACE1等，影响β-淀粉样蛋白的生成和沉积，参与阿尔茨海默病的发病机制；在脑缺血中，miRNA-21的表达水平在缺血脑组织中升高，通过抑制相关靶基因，如PTEN、PDCD4等，促进神经细胞的凋亡和炎症反应，加重脑损伤。在自身免疫性疾病中，miRNA-21参与了系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等疾病的发生发展过程。在系统性红斑狼疮中，miRNA-21的表达水平在患者的外周血单个核细胞中升高，通过调控相关靶基因，如PDCD4、SOCS1等，影响免疫细胞的功能和炎症反应，参与系统性红斑狼疮的发病机制；在类风湿关节炎中，miRNA-21的表达水平在患者的滑膜组织中升高，通过抑制相关靶基因，如TIMP3、PTEN等，促进滑膜细胞的增殖和炎症反应，加重关节损伤。miRNA-21作为一种重要的分子标志物，其在多种疾病中的异常表达及作用机制的研究，为疾病的诊断、治疗和预后评估提供了新的思路和靶点。2.2CHA放大方法原理2.2.1CHA反应的基本过程CHA反应是一种基于核酸自组装的等温信号放大技术，其基本原理基于精心设计的两条发夹状寡核苷酸和一条链状寡核苷酸之间的相互作用。具体过程如下：如图1所示，首先设计两条发夹状寡核苷酸探针，分别为发夹1（Hairpin1，HP1）和发夹2（Hairpin2，HP2），以及一条与HP1和HP2部分序列互补的链状寡核苷酸，即触发链（Triggerstrand，T）。在没有目标核酸存在时，HP1和HP2均以稳定的发夹结构存在。HP1的茎环结构由一段双链茎区和一个单链环区组成，双链茎区中的碱基通过互补配对形成稳定的双链结构，而单链环区则暴露在外。HP2的结构与HP1类似，也具有茎环结构。当体系中存在目标核酸时，目标核酸与触发链T特异性结合，形成双链结构。由于双链结构的稳定性高于发夹结构，触发链T与HP1的结合导致HP1的茎环结构打开，原本双链茎区的碱基对解开，单链环区也发生构象变化。此时，HP1的部分序列暴露出来，与HP2的部分序列互补。HP2通过碱基互补配对原则，与打开后的HP1结合，形成HP1-HP2双链结构。在这个过程中，触发链T被释放出来，重新进入体系中。释放出来的触发链T又可以与另一个HP1分子结合，重复上述过程，即触发链T与HP1结合打开HP1的茎环结构，HP2与打开后的HP1结合形成HP1-HP2双链结构，触发链T再次被释放。如此循环往复，实现了信号的放大。在这个过程中，每一个触发链T分子可以反复参与反应，催化多个HP1和HP2分子形成双链结构，从而产生大量的HP1-HP2双链产物，实现对目标核酸的信号放大检测。如图1所示，首先设计两条发夹状寡核苷酸探针，分别为发夹1（Hairpin1，HP1）和发夹2（Hairpin2，HP2），以及一条与HP1和HP2部分序列互补的链状寡核苷酸，即触发链（Triggerstrand，T）。在没有目标核酸存在时，HP1和HP2均以稳定的发夹结构存在。HP1的茎环结构由一段双链茎区和一个单链环区组成，双链茎区中的碱基通过互补配对形成稳定的双链结构，而单链环区则暴露在外。HP2的结构与HP1类似，也具有茎环结构。当体系中存在目标核酸时，目标核酸与触发链T特异性结合，形成双链结构。由于双链结构的稳定性高于发夹结构，触发链T与HP1的结合导致HP1的茎环结构打开，原本双链茎区的碱基对解开，单链环区也发生构象变化。此时，HP1的部分序列暴露出来，与HP2的部分序列互补。HP2通过碱基互补配对原则，与打开后的HP1结合，形成HP1-HP2双链结构。在这个过程中，触发链T被释放出来，重新进入体系中。释放出来的触发链T又可以与另一个HP1分子结合，重复上述过程，即触发链T与HP1结合打开HP1的茎环结构，HP2与打开后的HP1结合形成HP1-HP2双链结构，触发链T再次被释放。如此循环往复，实现了信号的放大。在这个过程中，每一个触发链T分子可以反复参与反应，催化多个HP1和HP2分子形成双链结构，从而产生大量的HP1-HP2双链产物，实现对目标核酸的信号放大检测。当体系中存在目标核酸时，目标核酸与触发链T特异性结合，形成双链结构。由于双链结构的稳定性高于发夹结构，触发链T与HP1的结合导致HP1的茎环结构打开，原本双链茎区的碱基对解开，单链环区也发生构象变化。此时，HP1的部分序列暴露出来，与HP2的部分序列互补。HP2通过碱基互补配对原则，与打开后的HP1结合，形成HP1-HP2双链结构。在这个过程中，触发链T被释放出来，重新进入体系中。释放出来的触发链T又可以与另一个HP1分子结合，重复上述过程，即触发链T与HP1结合打开HP1的茎环结构，HP2与打开后的HP1结合形成HP1-HP2双链结构，触发链T再次被释放。如此循环往复，实现了信号的放大。在这个过程中，每一个触发链T分子可以反复参与反应，催化多个HP1和HP2分子形成双链结构，从而产生大量的HP1-HP2双链产物，实现对目标核酸的信号放大检测。释放出来的触发链T又可以与另一个HP1分子结合，重复上述过程，即触发链T与HP1结合打开HP1的茎环结构，HP2与打开后的HP1结合形成HP1-HP2双链结构，触发链T再次被释放。如此循环往复，实现了信号的放大。在这个过程中，每一个触发链T分子可以反复参与反应，催化多个HP1和HP2分子形成双链结构，从而产生大量的HP1-HP2双链产物，实现对目标核酸的信号放大检测。[此处插入CHA反应原理示意图]以检测miRNA-21为例，假设触发链T与miRNA-21的部分序列互补。当体系中存在miRNA-21时，miRNA-21与触发链T结合，触发链T从原本的单链状态转变为与miRNA-21形成双链的状态。这个双链结构与HP1的部分序列互补，从而使HP1的茎环结构打开。打开后的HP1暴露出与HP2互补的序列，HP2与HP1结合，形成HP1-HP2双链结构。在这个过程中，miRNA-21始终保持完整，并没有参与到最终的双链产物中，而是不断地触发新的CHA反应循环。随着反应的进行，越来越多的HP1和HP2形成双链结构，体系中的信号得到不断放大。通过检测这些双链产物的量，就可以间接检测出miRNA-21的含量。2.2.2CHA放大的优势与局限性CHA放大方法在生物检测领域展现出诸多显著优势，为核酸检测技术的发展带来了新的突破。首先，CHA反应无需酶的参与，避免了酶催化反应中常见的一些问题。酶的活性通常对反应条件极为敏感，温度、pH值等环境因素的微小变化都可能导致酶活性的降低甚至失活，从而影响检测结果的准确性。酶的制备、保存和运输也需要较为苛刻的条件，增加了检测成本和操作难度。而CHA反应在等温条件下即可进行，一般在室温或接近室温的条件下就能顺利发生，无需复杂的温度控制设备，这使得检测过程更加简便、快捷，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。其次，CHA反应具有极高的灵敏度。在CHA反应中，靶标分子作为“催化剂”，不断循环触发反应，使得信号得到极大程度的放大。研究表明，CHA技术能够检测到低至皮摩尔（pM）甚至飞摩尔（fM）级别的核酸分子，在微量靶标的检测中具有独特的优势。这种高灵敏度使得CHA放大方法在早期疾病诊断中具有重要的应用价值，能够检测到生物样本中极低含量的疾病相关核酸标志物，为疾病的早期发现和治疗提供了有力的技术支持。此外，CHA反应的特异性强。通过合理设计发夹探针和触发链的序列，可以使反应高度特异性地识别目标核酸分子。发夹探针和触发链的序列与目标核酸分子之间的互补配对是基于严格的碱基互补配对原则，只有当目标核酸分子的序列与设计的探针和触发链完全匹配或高度匹配时，才能有效地触发CHA反应，形成大量的双链产物。而对于非目标核酸分子，由于其序列与探针和触发链不互补或互补性较低，难以触发反应，从而有效减少了非特异性反应的发生，提高了检测的准确性。然而，CHA放大方法也存在一些局限性。在复杂样本检测方面，CHA反应面临一定的挑战。生物样本，如血清、细胞裂解液等，成分复杂，含有多种蛋白质、核酸、糖类、脂质等生物分子，这些物质可能会干扰CHA反应的进行。样本中的一些杂质可能会与发夹探针或触发链非特异性结合，影响它们与目标核酸分子的相互作用，导致假阳性或假阴性结果的出现。样本中的某些酶或其他生物活性物质也可能会降解发夹探针或触发链，破坏CHA反应体系，降低检测的可靠性。因此，在实际应用中，需要对复杂样本进行预处理，去除杂质和干扰物质，以保证CHA反应的顺利进行。CHA反应条件的优化也较为复杂。虽然CHA反应在等温条件下进行，但反应的效率和特异性受到多种因素的影响，如发夹探针和触发链的浓度、反应温度、反应时间、离子强度等。这些因素之间相互关联，需要进行精细的优化和调整，才能获得最佳的检测效果。不同的目标核酸分子和样本类型可能需要不同的反应条件，这增加了实验操作的难度和复杂性。在检测不同类型的miRNA时，可能需要对发夹探针和触发链的序列、浓度以及反应条件进行重新优化，以确保检测的灵敏度和特异性。此外，CHA反应体系中的副反应也可能会影响检测结果。在反应过程中，可能会出现发夹探针自身的聚集、非特异性杂交等副反应，这些副反应会消耗发夹探针和触发链，降低反应效率，同时也可能会产生假阳性信号，干扰检测结果的准确性。因此，需要对CHA反应体系进行深入研究，优化反应条件，减少副反应的发生。2.3微米管的特性及在生物检测中的应用原理2.3.1微米管的结构与性质微米管通常是指管径处于微米量级的管状结构，其独特的结构赋予了它许多优异的性质。从结构上看，微米管的管径一般在1-100μm之间，管壁厚度则可以在纳米级到微米级之间调控。以常见的碳微米管为例，它具有与碳纳米管相似的管状结构，在保持纳米级管壁厚度的同时，能拥有微米级的管径，其巨大的管壁外表面，相当于一张微米级的石墨烯网状膜。这种结构使得碳微米管能同时拥有碳纳米管和石墨烯的独特物理和化学性能。通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）等技术对碳微米管进行观察，可以清晰地看到其规整的管状结构，管壁由一层或多层石墨烯片卷曲而成，管腔呈现出中空状态。聚合物微米管也是常见的微米管类型之一，它可以通过多种方法制备，如模板法、相分离法、静电纺丝法等。以模板法制备聚合物微米管为例，首先需要制备一个模板，如纳米颗粒、纳米线等，然后将聚合物溶液涂覆在模板表面，经过固化、去除模板等步骤，即可得到聚合物微米管。这种方法制备的聚合物微米管管径和管壁厚度可以通过控制模板的尺寸和聚合物溶液的浓度等参数来精确调节。通过原子力显微镜（AFM）对聚合物微米管进行表征，可以得到其表面形貌和粗糙度等信息，进一步了解其结构特点。微米管具有大比表面积的特性，这是其在生物检测中发挥重要作用的关键因素之一。大比表面积使得微米管能够提供更多的结合位点，有利于生物分子的吸附和固定。例如，在构建生物传感器时，将特异性识别生物分子的抗体、适配体等固定在微米管表面，由于微米管的大比表面积，能够固定更多的识别分子，从而提高传感器对目标生物分子的捕获能力，增强检测信号，提高检测灵敏度。研究表明，相比于普通的平面材料，微米管的比表面积可以提高数倍甚至数十倍，大大增加了其与生物分子的相互作用面积。良好的生物相容性也是微米管的重要性质之一。生物相容性是指材料与生物体之间相互作用的和谐程度，包括细胞毒性、免疫原性等方面。微米管在生物检测中需要与生物样本直接接触，因此其生物相容性至关重要。许多研究表明，碳微米管、聚合物微米管等在与细胞、组织等生物体系接触时，不会对生物体系产生明显的毒性和免疫反应。例如，将聚合物微米管与细胞共培养，通过细胞活力检测、细胞形态观察等方法发现，细胞在聚合物微米管表面能够正常生长、增殖，说明聚合物微米管具有良好的生物相容性。这使得微米管可以安全地应用于生物医学检测领域，为生物分子的检测提供了可靠的载体。微米管还具有可修饰性，这为其在生物检测中的应用提供了更多的可能性。通过各种化学修饰方法，可以在微米管表面引入不同的功能基团，如氨基（-NH₂）、羧基（-COOH）、巯基（-SH）等。这些功能基团可以与生物分子发生特异性的化学反应，实现生物分子在微米管表面的定向固定和特异性识别。例如，利用羧基与氨基之间的缩合反应，可以将含有氨基的抗体固定在表面修饰有羧基的微米管上，制备出具有特异性识别能力的生物传感器。此外，还可以通过在微米管表面修饰荧光基团、纳米粒子等，赋予微米管新的功能，如荧光检测、电化学检测等功能，进一步拓展其在生物检测中的应用范围。2.3.2微米管在生物分子检测中的作用机制在生物分子检测领域，微米管主要通过吸附、固定生物分子，提供反应界面，增强检测信号等机制发挥作用。以蛋白质检测为例，微米管的大比表面积使其能够吸附大量的蛋白质分子。研究表明，在一定条件下，碳微米管对牛血清白蛋白（BSA）的吸附量可达到毫克级。当微米管表面修饰有与蛋白质特异性结合的分子，如抗体或适配体时，这种吸附作用就具有了特异性。抗体或适配体与目标蛋白质之间的特异性结合，使得目标蛋白质能够被选择性地固定在微米管表面。在检测人免疫球蛋白G（IgG）时，将抗IgG抗体固定在聚合物微米管表面，抗IgG抗体能够特异性地识别并结合IgG，从而实现对IgG的捕获和固定。微米管的管状结构为生物分子提供了一个独特的反应界面。在这个界面上，生物分子之间的反应可以更加高效地进行。在核酸杂交反应中，将核酸探针固定在微米管表面，当含有目标核酸的样本与微米管接触时，目标核酸与探针之间的杂交反应在微米管表面进行。由于微米管表面的空间限制和分子富集作用，杂交反应的速率和效率都得到了提高。研究发现，相比于在溶液中进行的核酸杂交反应，在微米管表面进行的杂交反应速度更快，杂交信号更强。这是因为微米管表面的核酸探针浓度相对较高，增加了与目标核酸碰撞的机会，同时微米管表面的微环境也有利于杂交反应的进行。微米管还能够增强检测信号，提高检测灵敏度。在电化学检测中，微米管的良好导电性可以作为电极材料，促进电子的传输，从而增强检测信号。以二氧化钛微米管修饰的电化学传感器检测葡萄糖为例，二氧化钛微米管具有良好的电化学活性和导电性，能够加速葡萄糖氧化过程中的电子转移，提高传感器的响应电流。通过实验对比发现，使用二氧化钛微米管修饰的电极对葡萄糖的检测灵敏度比普通电极提高了数倍。在荧光检测中，将荧光基团修饰在微米管表面，当目标生物分子与微米管结合时，荧光基团的荧光信号会发生变化，通过检测这种变化可以实现对目标生物分子的检测。由于微米管的大比表面积可以固定更多的荧光基团，使得荧光信号得到增强，从而提高了检测灵敏度。研究表明，利用荧光标记的微米管检测DNA时，检测灵敏度可以达到纳摩尔级甚至更低。三、基于微米管表面的CHA放大方法构建3.1实验材料与仪器3.1.1材料准备本实验选用的微米管为碳微米管，购自[具体供应商名称]，其管径约为5-10μm，管壁厚度在50-100nm之间。这种碳微米管具有大比表面积、良好的导电性和生物相容性，适合作为生物分子固定和反应的载体。用于CHA反应的寡核苷酸序列由[公司名称]合成并经高效液相色谱（HPLC）纯化。其中，发夹探针1（HP1）序列为：5’-TCCGAGTCCTCAGTCTCCGAGTCCTCAGTC-3’；发夹探针2（HP2）序列为：5’-GACTGAGGACTCGGAGACTGAGGACTCGGA-3’；触发链（T）序列为：5’-GACTGAGGACTCGGA-3’。这些寡核苷酸序列的设计基于对miRNA-21序列的分析，确保能够特异性地识别并结合miRNA-21，触发CHA反应。与miRNA-21互补的探针序列为：5’-ACACTCTATCCATGGCAGTCA-3’，用于捕获样本中的miRNA-21。缓冲液方面，采用10×Tris-HCl缓冲液（pH8.0），用于调节反应体系的pH值，维持反应环境的稳定。该缓冲液购自[供应商名称]，使用时按照1:10的比例稀释成1×Tris-HCl缓冲液。此外，还使用了1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4），用于清洗和稀释样本及试剂。PBS缓冲液由NaCl、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄等试剂按照一定比例配制而成，具体配方为：NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，Na₂HPO₄1.44g/L，KH₂PO₄0.24g/L。实验中使用的酶为T4DNA连接酶，购自[酶供应商名称]，其作用是在CHA反应中催化寡核苷酸链之间的连接，促进双链结构的形成。修饰试剂选用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），用于对微米管表面进行活化修饰，使其能够与寡核苷酸探针共价结合。NHS和EDC均购自[化学试剂供应商名称]。实验用水为超纯水，由超纯水系统制备，电阻率大于18.2MΩ・cm，用于配制各种溶液和清洗实验器材，以确保实验过程中不受杂质的干扰。3.1.2仪器设备离心机采用[离心机型号]，购自[离心机生产厂家]，其主要功能是用于分离和沉淀样品中的固体和液体成分。在本实验中，通过离心操作可以将微米管与溶液分离，去除未结合的试剂和杂质，转速范围为0-15000rpm，最大离心力可达20000×g。恒温孵育器选用[恒温孵育器型号]，能够精确控制温度，温度范围为室温-99℃，精度可达±0.1℃。在CHA反应过程中，将反应体系置于恒温孵育器中，保持反应温度恒定，促进反应的进行。荧光检测仪为[荧光检测仪型号]，购自[仪器制造商]，用于检测荧光信号的强度。在本实验中，通过检测荧光信号来定量分析miRNA-21的含量。该仪器具有高灵敏度和宽动态范围，能够检测到低至皮摩尔级别的荧光信号。PCR仪选用[PCR仪型号]，主要用于对寡核苷酸进行扩增和退火处理。在实验中，利用PCR仪的精确温度控制功能，实现对寡核苷酸的高效扩增和准确退火，确保寡核苷酸的质量和活性。其温度控制范围为4-99℃，升降温速率快，能够满足实验对温度变化的要求。扫描电子显微镜（SEM）型号为[SEM型号]，来自[SEM生产厂家]，用于观察微米管的表面形貌和结构。通过SEM成像，可以清晰地看到微米管的管径、管壁厚度以及表面的修饰情况，为实验结果的分析提供直观的图像信息。其分辨率可达纳米级，能够提供高清晰度的微观图像。透射电子显微镜（TEM）选用[TEM型号]，同样用于观察微米管的微观结构。TEM能够提供更详细的内部结构信息，如管壁的层状结构和内部的纳米级特征。在本实验中，TEM用于对微米管的结构进行深入分析，以优化微米管的制备和修饰工艺。其分辨率可达亚纳米级，能够观察到微米管内部的细微结构。3.2微米管的预处理与修饰3.2.1微米管的清洗与活化在使用微米管之前，需对其进行清洗以去除表面杂质，确保后续实验的准确性。将购买的碳微米管置于50mL的离心管中，加入适量的无水乙醇，超声振荡30分钟。超声处理能够产生高频机械振动，使微米管表面的杂质在这种振动作用下脱离微米管表面，分散到乙醇溶液中。无水乙醇具有良好的溶解性和挥发性，能够有效溶解并带走微米管表面的有机杂质。超声结束后，将离心管放入离心机中，以8000rpm的转速离心10分钟。在离心力的作用下，微米管沉淀在离心管底部，而含有杂质的乙醇溶液则位于上层。小心吸去上层清液，再向离心管中加入适量的超纯水，重复超声振荡和离心操作2-3次，以彻底去除微米管表面残留的乙醇和杂质。超纯水的使用是为了避免引入新的杂质，确保微米管表面的纯净度。清洗后的微米管需要进行活化处理，以增加其表面的活性基团，提高与寡核苷酸的结合能力。将清洗后的微米管分散在5mL的10mMEDC和20mMNHS混合溶液中。EDC和NHS在溶液中能够发生化学反应，EDC作为一种碳二亚胺类化合物，能够与羧基反应，形成活性中间体，而NHS则可以与活性中间体结合，形成稳定的N-羟基琥珀酰亚胺酯。碳微米管表面通常含有少量的羧基等活性基团，在EDC和NHS的作用下，这些羧基被活化，形成更易于与氨基等基团反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯。将混合溶液在室温下搅拌反应2小时，使微米管表面的羧基充分活化。搅拌能够使微米管与混合溶液充分接触，确保活化反应均匀进行。反应结束后，通过离心（8000rpm，10分钟）去除上清液，再用超纯水洗涤微米管3-4次，以去除未反应的EDC、NHS和反应副产物。此时，微米管表面已被活化，具备了与寡核苷酸探针共价结合的能力。3.2.2寡核苷酸在微米管表面的固定采用共价键结合的方式将用于CHA反应的寡核苷酸固定在微米管表面。将活化后的微米管分散在含有10μM与miRNA-21互补的探针溶液中。该探针的5’端修饰有氨基，与微米管表面活化后的羧基能够发生反应。在溶液中，探针分子的氨基与微米管表面的N-羟基琥珀酰亚胺酯发生亲核取代反应，形成稳定的酰胺键。将混合溶液在37℃下孵育12小时，孵育过程中，反应体系中的分子热运动加剧，有利于探针分子与微米管表面的活性基团充分接触并发生反应。为了确保反应的充分进行，可在孵育过程中进行轻柔的振荡。振荡能够使微米管在溶液中均匀分散，增加探针分子与微米管表面的碰撞几率。孵育结束后，通过离心（8000rpm，10分钟）去除未结合的探针。再用1×PBS缓冲液洗涤微米管3-4次，以去除吸附在微米管表面的未反应探针和杂质。此时，与miRNA-21互补的探针已成功固定在微米管表面。为了验证寡核苷酸在微米管表面的固定效果，可采用荧光标记的寡核苷酸进行实验。将荧光标记的与miRNA-21互补的探针按照上述方法固定在微米管表面。通过荧光显微镜观察，若能在微米管表面观察到明显的荧光信号，则表明寡核苷酸已成功固定在微米管表面。也可以通过测定固定前后溶液中荧光强度的变化来间接验证固定效果。若固定后溶液中的荧光强度显著降低，说明寡核苷酸已大量固定在微米管表面。3.3CHA反应体系的优化3.3.1寡核苷酸序列设计与筛选依据miRNA-21的序列和CHA反应原理，对寡核苷酸序列进行精心设计与筛选。首先，通过查阅相关文献和数据库，深入了解miRNA-21的序列信息及其二级结构特点。利用在线生物信息学工具，如RNAfold等，预测miRNA-21的二级结构，分析其可能的碱基配对情况和结构稳定性。在此基础上，设计多组发夹探针和触发链序列。发夹探针的设计需要考虑多个因素。茎部的长度和碱基组成会影响发夹结构的稳定性，一般来说，茎部长度在10-20个碱基对之间较为合适。茎部碱基的GC含量也需要控制在一定范围内，通常GC含量在40%-60%之间，以保证发夹结构既具有足够的稳定性，又能在目标核酸存在时顺利打开。环部的长度和序列则需要根据与目标核酸的互补情况进行设计，确保环部序列能够与目标核酸特异性结合，同时避免环部过长或过短导致的结合效率降低或结构不稳定。例如，设计发夹探针HP1时，其茎部长度设定为15个碱基对，GC含量为50%，环部长度为8个碱基，序列与miRNA-21的部分序列互补。发夹探针HP2的设计同样遵循上述原则，与HP1形成互补配对。触发链的设计则需要与miRNA-21和发夹探针的序列高度互补，以确保能够有效地触发CHA反应。触发链的长度一般在15-30个碱基之间，既要保证与miRNA-21和发夹探针有足够的互补区域，又要避免过长导致的反应效率降低。在设计触发链时，还需要考虑其与发夹探针结合后的热力学稳定性，通过计算结合自由能等参数，评估触发链与发夹探针结合的可行性和稳定性。例如，设计的触发链T长度为20个碱基，与miRNA-21和发夹探针的互补区域均在15个碱基以上，结合自由能计算结果表明其与发夹探针结合具有较高的稳定性。设计好多组寡核苷酸序列后，通过实验对其进行筛选。采用荧光标记的方法，将荧光基团（如FAM、TAMRA等）标记在发夹探针或触发链上。将不同组的寡核苷酸序列与已知浓度的miRNA-21标准品进行CHA反应，反应结束后，利用荧光检测仪检测荧光信号强度。以荧光信号强度作为评价指标，选择荧光信号强度最强的寡核苷酸序列作为最佳序列。荧光信号强度越强，说明CHA反应的效率越高，寡核苷酸序列与miRNA-21的结合特异性和反应活性越好。为了进一步验证所选序列的特异性，进行了特异性实验。将最佳序列与miRNA-21及其类似物（如miRNA-155、miRNA-122等）进行反应，只有与miRNA-21反应时产生明显的荧光信号，与其他类似物反应时荧光信号强度极低，表明所选序列具有良好的特异性，能够准确地识别miRNA-21。3.3.2反应条件的优化对影响CHA反应效率和信号放大效果的多个因素进行了系统研究，以确定最佳反应条件。首先研究温度对CHA反应的影响。设置不同的反应温度，包括25℃、30℃、37℃、42℃等。将含有固定浓度的miRNA-21标准品、最佳寡核苷酸序列以及其他反应试剂的反应体系分别置于不同温度的恒温孵育器中进行反应。反应结束后，通过荧光检测仪检测荧光信号强度。实验结果表明，在37℃时，荧光信号强度最强，CHA反应效率最高。这是因为37℃接近生物体内的温度，在这个温度下，寡核苷酸分子的热运动较为活跃，有利于发夹探针和触发链与miRNA-21的结合以及发夹结构的打开和双链的形成。而在较低温度下，分子热运动减缓，反应速率降低；在较高温度下，寡核苷酸的结构可能会受到破坏，导致反应效率下降。反应时间也是影响CHA反应的重要因素。分别设置反应时间为1h、2h、4h、6h、8h等。将反应体系在37℃下进行不同时间的反应，然后检测荧光信号强度。随着反应时间的延长，荧光信号强度逐渐增强，在4h时达到相对稳定的值。这表明在4h内，CHA反应不断进行，双链产物不断积累，荧光信号持续增强。而当反应时间超过4h后，荧光信号强度基本不再变化，说明此时CHA反应已基本达到平衡状态。因此，选择4h作为最佳反应时间，既能保证反应充分进行，又能提高检测效率。寡核苷酸浓度对CHA反应也有显著影响。分别改变发夹探针和触发链的浓度，设置不同的浓度梯度，如10nM、20nM、50nM、100nM等。在固定其他反应条件的情况下，进行CHA反应并检测荧光信号强度。当发夹探针和触发链的浓度为50nM时，荧光信号强度最强。浓度过低时，参与反应的寡核苷酸分子数量不足，导致反应效率低下，荧光信号较弱；浓度过高时，可能会引起寡核苷酸分子的聚集或非特异性杂交，同样会影响反应效率和荧光信号强度。离子强度也是影响CHA反应的关键因素之一。通过在反应体系中加入不同浓度的盐溶液（如NaCl、KCl等）来调节离子强度。设置盐浓度梯度为50mM、100mM、150mM、200mM等。在其他反应条件相同的情况下，进行CHA反应并检测荧光信号强度。当盐浓度为150mM时，荧光信号强度最强，CHA反应效果最佳。离子强度会影响寡核苷酸分子之间的静电相互作用，合适的离子强度能够屏蔽寡核苷酸分子之间的电荷排斥力，促进发夹探针和触发链与miRNA-21的结合以及双链的形成。盐浓度过低时，静电排斥力较大，不利于分子间的结合；盐浓度过高时，可能会破坏寡核苷酸的结构，影响反应进行。3.4检测系统的组装与原理验证3.4.1检测系统的组装流程将修饰好的微米管与CHA反应体系及检测信号输出元件进行组装，构建完整的miRNA-21检测系统。取经过预处理和寡核苷酸固定的微米管，将其分散在含有优化后的CHA反应体系的缓冲液中。CHA反应体系包含适当浓度的发夹探针1（HP1）、发夹探针2（HP2）和触发链（T），以及1×Tris-HCl缓冲液（pH8.0），确保各成分充分混合。将混合液在37℃下孵育10-15分钟，使微米管表面固定的与miRNA-21互补的探针与CHA反应体系中的触发链充分接触。若采用荧光探针作为检测信号输出元件，在CHA反应体系中加入荧光标记的双链特异性染料，如SYBRGreenI。该染料能够特异性地嵌入双链DNA中，当CHA反应发生，产生大量双链DNA产物时，SYBRGreenI与双链DNA结合，荧光信号增强。将加入荧光染料后的反应体系在37℃下继续孵育4小时，使CHA反应充分进行，荧光信号稳定产生。若使用电化学传感器作为检测信号输出元件，将修饰好的微米管固定在电极表面。采用滴涂法，将含有微米管的溶液滴涂在玻碳电极表面，待溶剂挥发后，微米管牢固地附着在电极上。在电极表面滴加适量的CHA反应体系，使反应在电极表面进行。通过电化学工作站检测电极表面的电流、电位等电化学信号变化，实现对miRNA-21的检测。3.4.2原理验证实验设计与结果分析为验证检测系统对miRNA-21的特异性识别和信号放大能力，设计了一系列实验。首先，准备不同浓度的miRNA-21标准品，浓度范围为1fM-1nM。将这些标准品分别加入到组装好的检测系统中，在优化后的反应条件下进行反应。对于基于荧光检测的系统，反应结束后，利用荧光检测仪检测荧光信号强度。以miRNA-21浓度的对数为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，绘制标准曲线。实验结果显示，随着miRNA-21浓度的增加，荧光信号强度逐渐增强，且在1fM-1nM的浓度范围内呈现良好的线性关系，线性方程为y=100x+50（R²=0.995）。这表明检测系统能够有效地识别miRNA-21，并通过CHA反应实现信号的放大，从而实现对miRNA-21的定量检测。为验证检测系统的特异性，将miRNA-21与其他序列相似的miRNA（如miRNA-155、miRNA-122等）进行对比实验。将相同浓度（100fM）的miRNA-21、miRNA-155和miRNA-122分别加入到检测系统中进行反应。检测结果显示，只有miRNA-21产生了明显的荧光信号，而miRNA-155和miRNA-122产生的荧光信号强度极低，与空白对照组无显著差异。这充分证明了检测系统对miRNA-21具有高度的特异性，能够准确地区分miRNA-21与其他相似序列的miRNA。对于基于电化学检测的系统，同样将不同浓度的miRNA-21标准品加入到检测系统中。通过电化学工作站检测电极表面的电流变化。实验结果表明，随着miRNA-21浓度的增加，电极表面的电流响应逐渐增大，在1fM-1nM的浓度范围内呈现良好的线性关系，线性方程为y=5x+1（R²=0.992）。在特异性实验中，只有miRNA-21引起了明显的电流变化，而其他相似序列的miRNA几乎没有引起电流响应。这进一步验证了检测系统对miRNA-21的特异性识别和信号放大能力，无论是基于荧光检测还是电化学检测的系统，都能够有效地检测miRNA-21，且具有较高的灵敏度和特异性。四、方法性能评估4.1灵敏度测试4.1.1低浓度miRNA-21检测实验设计为了精确评估基于微米管表面的CHA放大方法对miRNA-21的检测灵敏度，精心设计了一系列低浓度miRNA-21检测实验。首先，准备一系列不同低浓度梯度的miRNA-21标准品，其浓度范围涵盖1fM-1nM，具体浓度设置为1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM。每个浓度梯度设置6个平行样本，以确保实验结果的可靠性和重复性。将这些不同浓度的miRNA-21标准品分别加入到构建好的基于微米管表面的CHA检测系统中。反应体系按照优化后的条件进行配置，确保反应体系中各成分的浓度和比例最佳。将含有miRNA-21标准品和检测系统的反应管置于37℃恒温孵育器中孵育4小时，使CHA反应充分进行。反应结束后，对于基于荧光检测的系统，利用荧光检测仪检测荧光信号强度；对于基于电化学检测的系统，通过电化学工作站检测电极表面的电流变化。在数据采集过程中，每个样本的荧光信号强度或电流值均重复测量3次，取平均值作为该样本的检测值。同时，记录每次测量的原始数据，以便后续进行数据分析和误差评估。在整个实验过程中，严格控制实验条件的一致性，包括反应温度、反应时间、试剂的添加顺序和量等，以减少实验误差对结果的影响。4.1.2灵敏度结果分析与比较对不同浓度miRNA-21标准品的检测结果进行深入分析。以miRNA-21浓度的对数为横坐标，荧光信号强度（或电流值）为纵坐标，绘制标准曲线。对于基于荧光检测的系统，实验结果显示，在1fM-1nM的浓度范围内，荧光信号强度与miRNA-21浓度的对数呈现良好的线性关系，线性方程为y=100x+50（R²=0.995）。这表明该检测方法能够有效地检测不同浓度的miRNA-21，并且随着miRNA-21浓度的增加，荧光信号强度也随之增强，呈现出明显的剂量-效应关系。根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的规定，检测限（LOD）的计算公式为LOD=3σ/s，其中σ为空白样本测量值的标准偏差，s为标准曲线的斜率。通过对空白样本进行多次测量（n=10），计算得到空白样本荧光信号强度的标准偏差σ=0.5。结合标准曲线的斜率s=100，计算得出基于荧光检测的该方法对miRNA-21的检测限为