高中生物动物细胞培养实验教案与试题

高中生物动物细胞培养实验教案与试题一、动物细胞培养实验教案（一）实验目的1.知识目标：理解动物细胞培养的核心原理（细胞体外生存条件、原代与传代培养的本质区别），掌握细胞培养的基本操作流程。2.能力目标：通过实操训练，提升无菌操作、显微观察及实验问题分析能力；学会设计简单实验优化细胞培养条件。3.情感目标：体会细胞培养技术在生物制药、细胞治疗等领域的应用价值，培养科学严谨的实验态度。（二）实验原理动物细胞培养是模拟体内环境（无菌、37℃恒温、pH7.2~7.4、5%CO₂维持酸碱平衡），使细胞在体外存活、增殖的技术。核心过程包括：原代培养：从动物机体（如胚胎、幼龄组织）取出细胞后首次培养，细胞保留原有生物学特性（如分裂能力、分化潜能）。传代培养：原代细胞增殖至“接触抑制”（细胞贴壁生长成单层后，因相互接触停止分裂）时，用胰蛋白酶分解细胞间蛋白质，使细胞分散成单个，再转移至新培养瓶继续培养（部分细胞可能因“转化”获得无限增殖能力）。（三）材料与用具生物材料：幼龄小鼠胚胎（或肝脏、肾脏组织，细胞分裂能力强）、胎牛血清（提供生长因子、贴壁因子）。培养基：DMEM（或RPMI-1640）基础培养基（含氨基酸、维生素、无机盐），添加10%胎牛血清、双抗（青霉素+链霉素，抑制细菌污染）。器械与设备：超净工作台（无菌操作）、CO₂培养箱（控温+控气）、倒置显微镜（观察细胞）、手术剪、镊子、培养瓶、移液管、0.25%胰蛋白酶、PBS缓冲液（清洗组织）。（四）实验步骤（原代培养+传代培养）1.原代培养：组织处理与接种步骤1：组织获取与处理无菌条件下取出胚胎（或幼龄组织），用PBS冲洗3次（去除血污）；将组织剪碎成1~2mm³的小块，加入适量0.25%胰蛋白酶，37℃消化10~15分钟（观察细胞变圆、脱离组织块时，加入含血清的培养基中和胰蛋白酶）。步骤2：细胞接种用移液管吹打消化后的组织/细胞悬液，使细胞分散成单个；将悬液转移至离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清（去除杂质）；加入新鲜培养基重悬细胞，调整密度至1×10⁵个/mL，接种于培养瓶（每瓶5~10mL），标记后放入37℃、5%CO₂培养箱。2.传代培养：细胞分散与扩增步骤1：观察与准备培养2~3天后，显微镜下观察细胞：若贴壁生长成单层（接触抑制），需传代。提前预热胰蛋白酶、培养基，超净台紫外灭菌30分钟。步骤2：细胞消化与传代弃旧培养基，用PBS冲洗细胞（去除残留血清）；加入适量胰蛋白酶，37℃消化3~5分钟（细胞变圆、脱离瓶壁时，加入培养基终止）；吹打瓶壁使细胞完全分散，按1:2~1:4的比例转移至新培养瓶，补充培养基后继续培养。（五）注意事项（核心操作规范）1.无菌操作：所有器械、试剂需灭菌（移液管高压灭菌，培养基过滤除菌）；操作时关闭超净台紫外灯，佩戴手套、口罩，避免交谈。2.胰蛋白酶处理：时间过短→细胞未分散，过长→细胞膜蛋白被分解（细胞死亡）。可通过显微镜观察“细胞变圆、悬浮”判断终止时机，或用血清（含蛋白酶抑制剂）快速中和。3.环境控制：CO₂培养箱需定期消毒（75%酒精擦拭），温度、CO₂浓度每日校准；培养基需现配现用，避免反复冻融。4.污染防控：若培养基浑浊（细菌污染）或出现菌丝（真菌污染），立即丢弃污染瓶，彻底消毒操作台；实验前用75%酒精擦拭培养瓶、器械。（六）教学过程设计1.导入（5分钟）展示“新冠疫苗生产（Vero细胞培养）”“单克隆抗体研发”的流程图，提问：“如何在实验室‘复制’体内的细胞环境？动物细胞培养需要哪些条件？”引发学生兴趣。2.原理讲解（10分钟）结合PPT动画，讲解“细胞生存的体外环境（温度、pH、气体）”“原代vs传代培养的本质区别”“胰蛋白酶的作用机制”，用类比（如“细胞贴壁像种子扎根土壤”“接触抑制像人群拥挤时停止移动”）帮助理解。3.实操训练（25分钟）分组：4人一组，明确“组织处理员”“接种员”“记录员”职责。教师示范：无菌操作（超净台使用、器械灭菌）、胰蛋白酶消化的“时间-形态”判断。学生实操：按步骤处理组织、接种细胞，教师巡视纠正（如“移液管避免触碰瓶口”“胰蛋白酶处理后及时中和”）。4.总结与反思（5分钟）提问：“原代培养的关键步骤是什么？传代时为何要‘分散细胞’？”引导学生回顾核心逻辑。反思：“若细胞贴壁率低，可能的原因有哪些？（如血清质量差、胰蛋白酶过度消化、培养瓶未包被）”，培养问题分析能力。（七）教学反思学生常见问题：①无菌操作不规范（如超净台内快速移动、器械交叉污染）；②胰蛋白酶处理时间失控（导致细胞死亡或未分散）；③观察记录不及时（错过传代最佳时机）。后续需强化“操作-观察-记录”的连贯性训练，增设“污染模拟”（如故意滴加菌液，观察污染特征）提升防控意识。二、动物细胞培养实验试题（分层考察）（一）选择题（基础应用）1.动物细胞培养中，最适宜的组织材料是（）A.老年动物的肌肉组织B.胚胎或幼龄动物的肝脏组织C.癌变的肿瘤组织D.成年动物的神经组织*答案：B（胚胎/幼龄组织细胞分裂能力强，易培养；神经组织高度分化，难增殖）*2.CO₂培养箱的核心作用是（）A.提供O₂供细胞呼吸B.提供CO₂刺激细胞分裂C.维持温度和pH稳定D.营造无菌环境*答案：C（37℃模拟体温，5%CO₂使培养基中NaHCO₃分解为H₂CO₃，维持pH7.2~7.4）*（二）简答题（原理分析）1.简述原代培养与传代培养的区别（从细胞来源、生物学特性、应用场景分析）。*参考答案：①来源：原代培养是“直接从机体取组织→培养”，传代是“原代细胞增殖后→分瓶培养”；②特性：原代细胞保留原有分化潜能（如肝细胞仍能合成白蛋白），传代细胞可能因“转化”获得无限增殖能力（如HeLa细胞）；③应用：原代培养用于短期研究（如药物毒性测试），传代培养用于大规模扩增（如疫苗生产）。*2.动物细胞培养中，胰蛋白酶的作用及处理注意事项是什么？*参考答案：作用：分解细胞间的胶原蛋白、黏连蛋白，使细胞分散成单个，便于接种或传代。注意：①处理前用PBS冲洗（去除血清，避免中和酶）；②37℃消化（加速酶活性），但时间≤5分钟（防止分解细胞膜蛋白）；③细胞变圆、悬浮时，立即加血清终止。*（三）实验设计题（综合创新）某小组发现“培养的细胞生长缓慢，增殖能力弱”，推测可能与血清浓度（或温度、pH）有关。请设计实验探究“血清浓度对细胞生长的影响”，写出实验思路（自变量、因变量、无关变量控制）。*参考答案：①自变量：血清浓度（设梯度：0%、5%、10%、20%，以基础培养基为对照）；②因变量：细胞密度（每日用血细胞计数板计数）、生长速率（绘制生长曲线）；③无关变量：接种密度（每瓶1×10⁵个细胞）、温度（37℃）、CO₂浓度（5%）、培养瓶规格（一致）；④实验步骤：a.取对数生长期的细胞，调整密度为1×10⁵个/mL；b.分组：将细胞悬液分为4组，分别加入含0%、5%、10%、20%血清的培养基，每组3个重复；c.接种后放入CO₂培养箱，每日同一时间取样，计数并记录；d.绘制生长曲线，分析血清浓度与细胞生长的关系。*（四）案例分析题（问题解决）某同学的细胞培养出现“培养基浑浊，细胞形态异常（变圆、脱落）”，结合实验原理，分析可能的污染类型及处理措施。*参考答案：①污染类型：细菌污染（培养基浑浊，镜下可见大量短杆状/球状细菌）或真菌污染（培养基表面有菌丝，镜下可见分支状菌丝）。②处理措施：立即丢弃污染的培养瓶，避免交叉污染；用75%酒精擦拭超净台、