纳米siRNA制剂的免疫原性降低策略

纳米siRNA制剂的免疫原性降低策略演讲人CONTENTS纳米siRNA制剂的免疫原性降低策略siRNA分子修饰：从源头阻断免疫识别递送载体优化：构建“免疫惰性”纳米屏障给药途径与靶向递送：减少“非必要免疫暴露”联合免疫调节：多维度“协同减毒”挑战与展望：迈向“临床转化”的最后一公里目录01纳米siRNA制剂的免疫原性降低策略纳米siRNA制剂的免疫原性降低策略作为RNA干扰（RNAi）疗法的核心工具，小干扰RNA（siRNA）通过特异性降解靶标mRNA，在肿瘤、遗传性疾病、病毒感染等领域展现出巨大治疗潜力。然而，siRNA制剂的临床转化长期面临一个关键瓶颈——免疫原性。作为外源双链RNA（dsRNA），siRNA易被模式识别受体（PRRs）如Toll样受体3（TLR3）、TLR7/8、RIG-I样受体（RLRs）等识别，触发I型干扰素（IFN-α/β）、前炎性细胞因子（如IL-6、TNF-α）的级联释放，导致免疫相关不良反应（如发热、肝毒性、血小板减少），甚至掩盖siRNA的基因沉默效应。因此，通过多维度策略降低纳米siRNA制剂的免疫原性，是提升其安全性、有效性及临床可及性的核心任务。本文将从siRNA分子修饰、递送载体优化、给药途径调控及联合免疫调节四个维度，系统阐述当前纳米siRNA制剂免疫原性降低的研究进展与作用机制，并结合临床转化挑战展望未来方向。02siRNA分子修饰：从源头阻断免疫识别siRNA分子修饰：从源头阻断免疫识别siRNA自身的结构特征（如未修饰的磷酸二酯骨架、特定序列基序）是触发免疫反应的根源。通过化学修饰改变siRNA的分子结构，可阻断其与PRRs的结合，或破坏免疫识别所需的构象，从而从源头降低免疫原性。1核糖修饰：破坏免疫识别的“关键接触点”核糖2'位是siRNA与PRRs（如TLR7/8）结合的关键作用位点。通过对核糖2'位进行修饰，可改变siRNA的空间构象，阻止其与PRRs的免疫识别结构域结合。-2'-O-甲基（2'-OMe）修饰：2'-OMe修饰是最早应用于siRNA免疫原性调控的化学修饰之一。其通过在核糖2'位引入甲基基团，stericallyhinderTLR7/8与siRNA的GU-rich基序结合。研究表明，全链2'-OMe修饰可使siRNA对TLR7/8的激活能力降低100倍以上，且不影响RISC介导的基因沉默效率。例如，在治疗原发性轻链淀粉样变性的siRNA药物Patisiran（Onpattro）中，siRNA的正义链与反义链均采用2'-OMe修饰，显著降低了LNP递送系统引起的IFN-α释放。1核糖修饰：破坏免疫识别的“关键接触点”-2'-氟（2'-F）修饰：2'-F修饰通过电负性氟原子替代2'-羟基，增强siRNA与Ago2蛋白的结合稳定性，同时破坏TLR7/8的识别。与2'-OMe修饰相比，2'-F修饰对RISC装载的促进作用更显著，且可部分抵抗核酸酶降解。例如，Inclisiran（Leqvio）中siRNA的反义链采用2'-F修饰，结合GalNAc靶向递送，使得皮下给药后免疫原性极低，患者耐受性良好。-2'-甲氧基乙基（2'-MOE）与锁定核酸（LNA）修饰：2'-MOE修饰通过引入乙氧基侧链，增强siRNA的血清稳定性，同时阻断TLR识别；LNA修饰通过“锁定”核糖构象，显著提高结合亲和力，但需谨慎修饰位置（通常仅在两端修饰），避免过度抑制RISC活性。2碱基修饰：规避“免疫激活基序”siRNA序列中的特定基序（如GU-rich、UGUGU）是PRRs识别的核心。通过碱基修饰改变这些基序，可降低免疫激活风险。-假尿嘧啶（ψ）修饰：ψ修饰将尿嘧啶的尿嘧啶碱基异构化为假尿嘧啶，破坏GU基序的氢键网络，阻断TLR7/8识别。研究表明，将siRNA中的尿嘧啶替换为ψ，可使其对TLR7的激活能力降低90%以上，且不影响基因沉默效果。例如，在抗HBVsiRNA研究中，全链ψ修饰的siRNA联合LNP递送，小鼠血清中IFN-α水平显著低于未修饰组。-5-甲基胞嘧啶（5-mC）与5-溴尿嘧啶（5-BrU）修饰：5-mC修饰通过甲基化胞嘧啶，减少CpG基序对TLR9的激活（尽管TLR9主要识别DNA，但dsRNA可能间接激活先天免疫）；5-BrU修饰通过溴原子替代尿嘧啶5位位阻，干扰PRRs与碱基的接触。3磷酸骨架修饰：增强稳定性与隐蔽性未修饰的磷酸二酯骨架（PO）易被核酸酶降解，释放的小片段RNA可能被PRRs识别。通过硫代磷酸酯（PS）修饰，可增强siRNA的血清稳定性，减少降解产物引起的免疫反应。-PS修饰：PS修饰将非桥接氧原子替换为硫原子，增强对核酸酶的抵抗能力，同时通过改变siRNA的构象，减少与PRRs的结合。但PS修饰可能影响RISC装载效率，因此通常仅在siRNA的末端1-3个核苷酸进行修饰，平衡稳定性与活性。例如，在siRNA药物Givosiran（Givlaari）中，PS修饰与2'-F修饰协同使用，显著降低了免疫原性并延长了半衰期。3序列优化：规避内源免疫激活序列通过生物信息学工具筛选siRNA序列，避免与内源免疫激活RNA（如miRNA、病毒RNA）的同源性，可降低“非特异性免疫激活”风险。例如，避免使用富含GU、UGU的序列，优先选择A/U含量较低的序列（<50%），可显著降低TLR7/8的激活概率。03递送载体优化：构建“免疫惰性”纳米屏障递送载体优化：构建“免疫惰性”纳米屏障裸siRNA易被血浆中的核酸酶降解并被免疫细胞吞噬，而纳米递送载体通过包封siRNA，可形成物理屏障，减少其与PRRs的直接接触，同时通过载体材料本身的免疫调节特性，进一步降低免疫原性。1脂质纳米粒（LNP）：调控“两亲性”与“电负性”LNP是目前siRNA药物最常用的递送系统（如Patisiran、Inclisiran、Vutrisiran），其免疫原性主要取决于脂质组成与表面性质。-可电离阳离子脂质：可电离阳离子脂质（如DLin-MC3-DMA、SM-102）在酸性条件下（如内吞体）质子化带正电，促进siRNA从内吞体逃逸，而在中性生理条件下呈电中性，减少与带负电的细胞膜（如免疫细胞表面）的非特异性结合，降低巨噬细胞吞噬和TLR激活。例如，DLin-MC3-DMA组成的LNP在肝细胞中高效递送siRNA，同时血浆中IFN-α水平显著低于传统阳离子脂质（如DOTAP）。-辅助脂质优化：磷脂（如DSPC）、胆固醇与PEG化脂质的比例影响LNP的稳定性与免疫原性。胆固醇可增强LNP的膜流动性，促进内吞体逃逸，减少溶酶体降解导致的免疫激活；PEG化脂质可形成“亲水冠层”，1脂质纳米粒（LNP）：调控“两亲性”与“电负性”减少血清蛋白吸附（opsonization），降低巨噬细胞吞噬。但长期或高剂量PEG可能诱导“抗PEG抗体”，导致加速血液清除（ABC现象），因此需优化PEG分子量（通常为2000Da）与修饰密度。-表面电荷调控：LNP表面ζ电位接近中性（-10mV至+10mV）可减少对带负电免疫细胞（如树突状细胞、巨噬细胞）的吸引，降低免疫激活。研究表明，ζ电位为-5mV的LNP递送siRNA时，小鼠脾脏中TNF-α水平显著低于ζ电位为+20mV的LNP。1脂质纳米粒（LNP）：调控“两亲性”与“电负性”2.2高分子聚合物载体：引入“免疫调节单元”高分子聚合物（如聚乙烯亚胺PEI、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、树枝状聚合物）可通过自身降解特性或修饰功能基团，调控免疫原性。-可降解阳离子聚合物：传统阳离子聚合物（如PEI25k）因其高正电荷密度和不可降解性，易引发细胞毒性并激活NLRP3炎症小体。而可降解阳离子聚合物（如β-氨基酯聚合物、聚β-氨基酯）在细胞内可水解为小分子片段，降低长期滞留引起的免疫反应。例如，聚β-氨基酯包封的siRNA在巨噬细胞中几乎不诱导IL-6释放，而PEI25k组IL-6水平升高10倍以上。-聚乙二醇化（PEGylation）与亲水性修饰：通过在聚合物骨架上接枝PEG，可减少非特异性细胞摄取，降低免疫细胞识别。例如，PEG化PLGA纳米粒递送siRNA时，小鼠血清中IFN-α水平较未PEG化组降低70%。1脂质纳米粒（LNP）：调控“两亲性”与“电负性”-阴离子/两性离子聚合物：阴离子聚合物（如聚丙烯酸）或两性离子聚合物（如聚羧酸甜菜碱）因表面带负电或电中性，可避免阳离子聚合物引起的细胞膜破坏和免疫激活。例如，聚羧酸甜菜碱修饰的siRNA纳米粒在静脉注射后，主要被肝细胞而非枯否细胞摄取，显著降低了炎症因子释放。3无机纳米材料：利用“低免疫原性”与“易修饰性”无机纳米材料（如金纳米粒、介孔二氧化硅、量子点）因其独特的理化性质，在siRNA递送中展现出低免疫原性优势。-金纳米粒（AuNPs）：AuNPs表面易修饰硫醇基团，可高效负载siRNA，且本身具有生物惰性，不易激活先天免疫。例如，AuNPs-siRNA复合物在治疗肝癌时，小鼠肝脏中IFN-β水平显著低于LNP-siRNA组，且基因沉默效率相当。-介孔二氧化硅纳米粒（MSNs）：MSNs具有高比表面积和可调控孔径，可负载大量siRNA，表面硅羟基易于修饰PEG或靶向分子，减少非特异性免疫识别。例如，PEG化MSNs递送抗纤维化siRNA时，大鼠肺泡巨噬细胞中IL-1β表达水平较脂质体组降低50%。4天然来源载体：仿生“免疫逃逸”策略利用细胞膜或外泌体等天然载体包裹siRNA，可“伪装”siRNA，使其逃避免疫识别。-细胞膜包被纳米粒：将红细胞膜、血小板膜或癌细胞膜包裹在LNP核心表面，可赋予纳米粒“自身”特性，减少巨噬细胞吞噬。例如，红细胞膜包被的LNP-siRNA在血液循环时间延长至48小时以上，而未包被组仅6小时，且小鼠血清中IFN-α水平显著降低。-外泌体递送：外泌体作为天然纳米囊泡，可穿透生物屏障（如血脑屏障），且表面膜蛋白（如CD47）可发挥“别吃我”信号，抑制巨噬细胞吞噬。例如，间充质干细胞来源外泌体负载siRNA治疗阿尔茨海默病时，不仅实现了脑靶向递送，还显著降低了小胶质细胞激活和IL-6释放。04给药途径与靶向递送：减少“非必要免疫暴露”给药途径与靶向递送：减少“非必要免疫暴露”给药途径直接影响siRNA在体内的分布与免疫细胞接触概率，通过局部或靶向递送，可减少siRNA在免疫器官（如脾脏、淋巴结）的滞留，降低全身免疫反应。3.1局部给药：绕过全身免疫系统-眼部给药：眼睛作为免疫豁免器官，前房玻璃体注射或滴眼液递送siRNA可直接作用于靶组织（如视网膜），避免全身暴露。例如，siRNA药物QPI-1007（治疗非动脉炎性前部缺血性视神经病变）通过玻璃体注射给药，患者血浆中未检测到IFN-α升高，安全性良好。-呼吸道给药：雾化吸入siRNA可靶向肺部（如治疗COVID-19、肺纤维化），减少肝脏首过效应和全身免疫激活。例如，LNP包封的抗SARS-CoV-2siRNA通过雾化给药，小鼠肺组织中病毒载量降低100倍，而血清中炎症因子水平与空白组无显著差异。给药途径与靶向递送：减少“非必要免疫暴露”-皮肤黏膜给药：透皮或黏膜（如鼻黏膜、阴道黏膜）递送siRNA可局部治疗炎症或感染，避免全身分布。例如，阳离子脂质体-siRNA复合物通过鼻黏膜给药治疗过敏性鼻炎，直接作用于鼻黏膜免疫细胞，显著降低IL-4、IL-5释放，且未引发全身免疫反应。2肝靶向递送：利用“自然清除机制”减少免疫激活肝脏是siRNA体内分布的主要器官（因LNP等载体易被肝细胞摄取），但肝内免疫细胞（如枯否细胞、肝窦内皮细胞）可识别siRNA并引发炎症。通过肝细胞特异性靶向，可减少与枯否细胞的接触，降低免疫原性。-GalNAc-siRNA偶联物：N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）作为去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的配体，可介导肝细胞主动摄取，避免枯否细胞吞噬。Inclisiran通过GalNAc修饰，皮下注射后优先被肝细胞摄取，血浆半衰期长达数天，且几乎不激活TLR7/8，患者耐受性极佳。-LDL受体靶向：低密度脂蛋白（LDL）受体在肝细胞高表达，通过LDL肽或抗体修饰纳米粒，可实现肝细胞特异性递送。例如，LDL肽修饰的LNP-siRNA在肝脏中积累量较未修饰组提高5倍，而枯否细胞摄取量降低70%，IFN-α释放显著减少。3免疫豁免器官靶向：降低“免疫识别风险”对于中枢神经系统（CNS）、睾丸等免疫豁免器官，需突破生物屏障并避免激活局部免疫细胞。-血脑屏障（BBB）穿透：通过受体介导转运（如转铁蛋白受体抗体修饰）、吸附介导转运（阳离子纳米粒）或临时开放BBB（如聚焦超声），可递送siRNA至脑组织。例如，转铁蛋白受体抗体修饰的AuNPs-siRNA治疗阿尔茨海默病时，脑内siRNA浓度较非靶向组提高3倍，且小胶质细胞活化程度显著降低。-睾丸靶向：通过紧密连接调节剂（如EGF）或细胞穿透肽（如TAT）修饰，可促进siRNA穿越血睾屏障。例如，TAT修饰的PLGA纳米粒递送抗精子生成siRNA，睾丸组织中基因沉默效率达60%，而未修饰组仅10%，且未引发睾丸局部炎症。05联合免疫调节：多维度“协同减毒”联合免疫调节：多维度“协同减毒”对于高免疫原性siRNA或复杂疾病（如自身免疫病），单一策略可能难以完全抑制免疫激活，需联合免疫调节剂，实现“协同减毒”。1小分子免疫抑制剂联合使用-TLR信号通路抑制剂：如氯喹（TLR3/7/8抑制剂）、BAY11-7082（NF-κB抑制剂），可阻断siRNA触发的下游信号转导。例如，LNP-siRNA联合氯喹给药，小鼠血清中IFN-α水平降低80%，且基因沉默效率不受影响。-糖皮质激素：如地塞米松，可广泛抑制炎症因子释放，与siRNA联用可减轻急性免疫反应。例如，在siRNA治疗急性肝损伤模型中，地塞米松预给药可显著降低血清TNF-α、IL-6水平，提高小鼠生存率。2生物大分子调节剂协同递送-可溶性诱受体（sdecoy）：如可溶性TLR4（sTLR4），可与siRNA竞争结合PRRs，阻断免疫识别。例如，sTLR4与siRNA共包封于LNP中，小鼠脾脏中IFN-β表达降低90%，优于单独使用siRNA。-抗炎细胞因子：如IL-10、TGF-β，可通过调节性T细胞（Treg）抑制过度炎症反应。例如，IL-10修饰的PLGA-siRNA纳米粒治疗炎症性肠病时，结肠组织中IL-10水平升高，TNF-α降低，且免疫细胞浸润显著减少。3基因编辑工具联合应用利用CRISPR-Cas9或碱基编辑工具敲除免疫相关基因（如TLR3、TLR7、MAVS），可从基因层面降低细胞对siRNA的免疫敏感性。例如，在TLR7敲除小鼠中，未修饰siRNA的免疫原性降低95%，且基因沉默效率与野生型小鼠相当，为“免疫豁免”个体化治疗提供新思路。06挑战与展望：迈向“临床转化”的最后一公里