DB43∕T 956-2014 南方水稻黑条矮缩病毒检测方法RT-PCR法

南方水稻黑条矮缩病毒检测方法2014-10-21发布2014-11-20实施湖南省质量技术监督局发布I Ⅱ 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 15检测方法 2 25.2仪器设备 25.3操作程序 26检测后样品的处理 4附录A(规范性附录)相关试剂配制 5附录B(资料性附录)南方水稻黑条矮缩病毒侵染水稻典型症状 6附录C(规范性附录)RT-PCR电泳图 7Ⅱ本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省植物保护研究所提出。本标准由湖南省农业标准化委员会归口。本标准由湖南省植物保护研究所起草。本标准主要起草人：张松柏、刘勇、张德咏、罗香文、彭静。1本规程规定了南方水稻黑条矮缩病毒检测方法RT-PCR法的术语和定义、RT-PCR检测方定、检测后样品处理等技术要求。本规程适用于侵染水稻的南方水稻黑条矮缩病毒的室内检测。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB6682-2008分析实验室用水规格和试验方法。下列术语和定义适用于本文件。由白背飞虱传播的一种水稻病毒，主要危害水稻、玉米等禾本科作物，其危害水稻的典型反转录酶的作用合成cDNA,然后以cDNA为模板，利用特异性引物扩增得到目的片段。4缩略语下列缩略语适用于本标准。bp:碱基对dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸PCR:聚合酶链式反应DEPC:焦碳酸二乙酯2除另有规定外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水，规格符合GB6682-2008的相关规定。5.1试剂5.1.2AMV反转录酶(200U/μL)。5.1.51.5%琼脂糖凝胶：见附录A.2。5.1.650×TAE缓冲液：见附录A.3。5.1.7SYBRGreenI染色液(100×)5.1.8上样缓冲液：见附录A.4。5.1.9DEPC处理的灭菌双蒸水：见附录A.5。5.1.10异丙醇。5.1.11DEPC处理的灭菌双蒸水配置的75%乙醇：见附录A.6。5.1.125×AMV缓冲液5.1.1410×PCR缓冲液5.1.15DNA分子量标准。5.1.16引物：见附录A.7。5.1.17氯仿。5.2仪器设备5.2.1高速冷冻离心机：最高转速应大于12000rpm。5.2.2PCR扩增仪。5.2.3核酸电泳仪和水平电泳槽。5.2.4超低温冰箱(-80℃)。5.2.5凝胶成像系统。5.2.6通风橱。5.3操作程序5.3.1样品的采集和处理选择典型病症的水稻叶片，或者需要检测的水稻样品的叶片，用吸水纸吸干水检测，或在-80℃冰箱中冻存备用。采集的白背飞虱，用无水乙醇浸泡，或者40℃烘干，送至实验室检测，或在-80℃冰箱中冻存备用。5.3.2.1每100mg水稻叶片或白背飞虱，加入少量液氮研磨，然后加入1mL变性液，涡旋混匀，室温放置(5～10)min;5.3.2.2加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15sec,室温放置3min;12000rpm4℃离心10min。35.3.2.5沉淀用1mL75%乙醇洗涤2次；12000rpm4℃离心3min,弃上清，室温干燥(5～10)min。5.3.3RT-PCR检测总RNA提取液RT溶液(5×)随机六聚体引物(0.1μg/μ1)dNTP溶液(2.5mM/each)RNA酶抑制剂(50U/μ1)反转录酶(5U/μ1)DEPC处理ddH₂0取一干净离心管(DEPC水处理),按表1依次加入检测试剂，42℃孵育30min,85℃加热5min正向引物：5’>AGAGAA正向引物(10Pmol/L)PCR缓冲液(10×)Taq酶(5U/μL)灭菌ddH₂045.3.3.4PCR扩增1.5%琼脂糖凝胶的点样孔内，同时设置DL2000标准分子量DNA作为片段大小标准，80V电压电泳约30min。将电泳后的琼脂糖凝胶放置于凝胶成像系统内，打开紫外灯，在凝胶成像系统控制软件上观察PCR扩增条带。5.3.5结果判定在凝胶成像系统观察，电泳后的琼脂糖凝胶上，阳性对照出现一条1087bp大小的特异性条带，阴性对照没有该特异性条带。供试样品出现与阳性对照大小一致的特异性条带南方水稻黑条矮缩病毒；供试样品没有出现与阳性对照大小一致的特异性条带，判定为阴性，即该样品不带南方水稻黑条矮缩病毒(电泳图参见附录C)。6检测后样品的处理样品应保存于-80℃冰箱或集中销毁，用具应进行灭活处理。5附录A(规范性附录)相关试剂的配制A.1变性液将250g异硫氰酸胍、17.6mL0.75molL(pH7.0)柠檬酸钠和26.4mL10%(m/V)十二烷基肌酸钠溶293mL水中。65℃条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下可保存3个月，每次使用前按每50mL变性液加入0.35mL的14.4molL的β-巯基乙醇。变性液可在室温下避光保存1个月。A.21.5%琼脂糖凝胶的配制用琼脂糖1.5g,0.5×TAE电泳缓冲液100mL,混匀后在微波炉中完全融化，待冷至50~60℃时，摇匀倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。242gTris碱、57.1mL冰醋酸、37.2gNa₂EDTA2H2O,加ddH₂O定容至1L。A.4上样缓冲液(5×)TrisC1(pH8.0),在800mLdH₂O中溶解121gTris碱，用浓HCI调节pH至8.0。DEPC100μL,加超纯水至100mL,室温过夜，121℃高压15min,分装到1.5mLDEPC处理过A.6DEPC水75%乙醇用75mL无水乙醇，加DEPC水至100mL,混匀，4℃保存备用。检测引物序列如下。正向引物：5'>AGAGAATGGCAGACCTAGAGCG<3'反向引物：5³>TACAATGAAATTGACCAAGA引物合成后冻存于-20℃。待用时应稀释至10μmol/L浓度。扩增时2条引物在同一体系中，扩增结束后出现大小为1087bp的目的片段。6附录B(资料性附录)南方水稻黑条矮缩病毒侵染水稻的典型症状特点秧苗期感病的稻株，严重矮缩(不及正常株高1/3),不能拔节；本田初期感病的稻株，明显矮缩(约为正常株高1/2),不抽穗或仅抽包颈穗；分蘖期和拔节期感病稻株，矮缩不明显，能抽穗，但穗小、不实粒多、粒重轻；发病稻株叶色深绿，上部叶的叶面可见凹凸不平的皱褶，皱褶多发生于叶片近基部；拔节期的病株，地上数节节部有气生须根及高节位分枝；病株茎秆表面有乳白色大小约1-2mm的瘤状突起(手摸有明显粗糙感),瘤