2025年微生物检验实践考核试题及答案

2025年微生物检验实践考核试题及答案一、操作技能题（共40分）1.革兰染色法操作（15分）要求：使用金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和大肠埃希菌（ATCC25922）混合菌液完成涂片、染色及镜检，记录操作步骤及注意事项，并描述镜下结果。2.血琼脂平板制备（10分）要求：按标准流程配制500ml血琼脂培养基（基础成分为牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15g，需添加5%脱纤维羊血），写出具体操作步骤（包括成分称量、溶解、调pH、灭菌、加血、倾注平板）及质量控制要点。3.细菌药敏试验（K-B法）操作（15分）要求：使用大肠埃希菌（ATCC25922）标准菌株，对头孢他啶（CAZ30μg）、环丙沙星（CIP5μg）、阿米卡星（AMK30μg）三种药物进行药敏试验，写出菌液浓度调整（麦氏比浊法）、涂布方法、药敏纸片放置、培养条件（温度、时间）及结果判读标准。二、简答题（共30分）1.简述肠道致病菌分离培养中SS琼脂的作用原理及使用注意事项（8分）。2.解释“卫星现象”的形成机制及其在流感嗜血杆菌鉴定中的意义（7分）。3.列举三种细菌耐药性检测的特殊方法（如超广谱β-内酰胺酶、耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介/耐药肠球菌），并说明其检测原理（15分）。三、案例分析题（共30分）患者资料：男性，58岁，因“发热伴咳嗽、咳脓痰3天”入院。既往有糖尿病史10年，血糖控制不佳。查体：T38.9℃，双肺可闻及湿啰音；血常规：WBC18.2×10⁹/L，中性粒细胞89%；胸部CT提示右肺下叶大片实变影。临床怀疑“社区获得性肺炎”，留取合格痰标本送微生物实验室检测。检验过程：-痰涂片镜检：革兰染色见大量中性粒细胞（＞25个/低倍镜视野），少量鳞状上皮细胞（＜10个/低倍镜视野），可见革兰阳性双球菌（矛头状，成双排列）。-分离培养：接种血平板和巧克力平板，35℃、5%CO₂环境培养18小时。血平板可见圆形、灰白色、α溶血小菌落；巧克力平板菌落形态相似。-初步鉴定：Optochin敏感试验（纸片法）阳性，胆汁溶菌试验阳性。问题：1.该患者痰标本是否符合合格标本要求？依据是什么？（5分）2.推测可能的病原体及依据（需结合涂片、培养及鉴定试验结果）（10分）。3.若需进一步进行药敏试验，应选择哪些关键药物？简述其判读标准（参考CLSI2024版）（15分）。微生物检验实践考核答案（2025年）一、操作技能题1.革兰染色法操作答案操作步骤：（1）涂片：取1滴生理盐水于载玻片，用接种环取混合菌液涂片，形成直径约1cm的均匀薄膜；（2）固定：涂片自然干燥后，通过火焰3次（手背距玻片约2cm，感觉微热即可）；（3）初染：滴加结晶紫染液覆盖涂片，作用1分钟后水洗；（4）媒染：滴加卢戈碘液覆盖涂片，作用1分钟后水洗；（5）脱色：滴加95%乙醇，轻轻晃动玻片至无紫色脱落（约20-30秒），立即水洗；（6）复染：滴加沙黄染液，作用30秒后水洗，吸水纸吸干。注意事项：-涂片厚度适宜，过厚易脱色不完全；-固定温度不可过高，避免细菌变形；-脱色时间是关键，革兰阴性菌脱色过度会被误染为阳性，反之阳性菌可能被误判为阴性。镜下结果：-金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌（紫色，葡萄串状排列）；-大肠埃希菌为革兰阴性杆菌（红色，短杆状排列）。2.血琼脂平板制备答案操作步骤：（1）成分称量：按比例称取牛肉膏1.5g（3g/1000ml×500ml）、蛋白胨5g、NaCl2.5g、琼脂7.5g，加入500ml蒸馏水；（2）溶解：加热搅拌至完全溶解，用1mol/LNaOH调pH至7.2-7.4（用pH试纸或pH计校正）；（3）灭菌：分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌15分钟；（4）加血：待培养基冷却至50℃左右（手感不烫），无菌操作加入25ml脱纤维羊血（5%比例），轻轻摇匀；（5）倾注平板：无菌条件下将培养基倒入无菌平皿（约15-20ml/平板），待凝固后倒置备用。质量控制要点：-无菌试验：随机抽取2-3块平板，35℃培养24小时，应无任何菌落生长；-性能测试：接种金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和流感嗜血杆菌（ATCC49247），观察前者是否溶血（β溶血）、后者是否生长（需X/V因子，血平板含V因子但不含X因子，故流感嗜血杆菌在血平板上生长受限，仅巧克力平板可生长）；-外观检查：培养基应透明、无沉淀，凝固后表面光滑无气泡。3.细菌药敏试验（K-B法）操作答案操作步骤：（1）菌液制备：挑取大肠埃希菌（ATCC25922）纯菌落，接种于4-5ml生理盐水中，调整浊度至0.5麦氏单位（相当于1×10⁸CFU/ml）；（2）涂布：用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁挤压去除多余液体，均匀涂布MH琼脂平板（3个方向旋转涂布，最后沿平板边缘涂抹一圈）；（3）贴纸片：涂布后15分钟内，用药敏纸片分配器贴头孢他啶（CAZ）、环丙沙星（CIP）、阿米卡星（AMK）纸片，纸片间距≥24mm，距平板边缘≥15mm；（4）培养：平板倒置，35℃培养16-18小时（苛养菌需24小时，大肠埃希菌为非苛养菌）；（5）判读：用游标卡尺测量抑菌圈直径，对照CLSI2024版标准：-头孢他啶（CAZ）：敏感（≥21mm）、中介（18-20mm）、耐药（≤17mm）；-环丙沙星（CIP）：敏感（≥21mm）、中介（16-20mm）、耐药（≤15mm）；-阿米卡星（AMK）：敏感（≥17mm）、耐药（≤16mm）（无中介标准）。二、简答题1.SS琼脂作用原理及注意事项原理：SS琼脂为强选择性培养基，含胆盐、枸橼酸钠和煌绿，可抑制革兰阳性菌及部分大肠埃希菌等非致病菌生长；乳糖为碳源，中性红为指示剂，致病菌（如志贺菌、沙门菌）不发酵乳糖，形成无色透明菌落；非致病菌（如大肠埃希菌）发酵乳糖产酸，菌落呈红色。注意事项：-培养基pH需严格控制在7.0-7.2，偏碱会降低选择性；-煌绿浓度过高会抑制沙门菌生长，需按配方精确添加；-标本接种后需及时培养（≤2小时），避免志贺菌因延迟培养死亡；-部分沙门菌（如伤寒沙门菌）可能发酵乳糖（迟缓发酵），需结合生化试验确认。2.“卫星现象”机制及意义机制：流感嗜血杆菌生长需要X因子（血红素）和V因子（NAD）。当金黄色葡萄球菌与流感嗜血杆菌共培养时，葡萄球菌能合成并释放V因子（NAD），促进流感嗜血杆菌在其周围生长，形成“卫星现象”（流感嗜血杆菌菌落围绕葡萄球菌菌落生长）。意义：卫星现象是流感嗜血杆菌的初步鉴定依据之一。若在血平板上观察到葡萄球菌菌落周围有小菌落生长，可提示可能为流感嗜血杆菌，需进一步通过X/V因子需求试验确认（如使用含X、V因子的巧克力平板，或专用鉴定条）。3.三种细菌耐药性特殊检测方法及原理（1）超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）检测：采用双纸片协同试验（D试验）。原理：ESBLs可水解三代头孢（如头孢他啶、头孢噻肟），但可被克拉维酸抑制。将头孢他啶（CAZ）、头孢他啶/克拉维酸（CAZ/CLA）纸片相距30mm贴于MH平板，若CAZ/CLA的抑菌圈直径比CAZ大≥5mm，提示ESBLs阳性。（2）耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA/MRCNS）检测：采用苯唑西林纸片法或mecA基因检测。原理：MRSA携带mecA基因，编码青霉素结合蛋白PBP2a，对β-内酰胺类抗生素低亲和力。苯唑西林（1μg纸片）在35℃培养24小时，抑菌圈≤10mm（或≥11mm但需结合mecA检测）提示耐药；或直接PCR检测mecA基因。（3）万古霉素中介/耐药肠球菌（VISA/VRSA）检测：采用万古霉素E-test法或肉汤稀释法。原理：VISA/VRSA通过细胞壁增厚减少药物渗透，需精确测定MIC值。CLSI标准：肠球菌万古霉素MIC≤4μg/ml为敏感，8-16μg/ml为中介（VISA），≥32μg/ml为耐药（VRSA）；E-test法可直接读取MIC值，结合琼脂稀释法确认。三、案例分析题1.标本合格性判断符合合格标本要求。依据：痰涂片镜检中中性粒细胞＞25个/低倍镜视野，鳞状上皮细胞＜10个/低倍镜视野（符合美国临床实验室标准化协会CLSI标准：中性粒细胞≥25个且鳞状上皮细胞≤10个/低倍镜视野为合格痰标本），提示标本来自下呼吸道，污染少。2.病原体推测及依据可能病原体：肺炎链球菌。依据：（1）临床表现：老年男性，糖尿病史（免疫低下），发热、咳脓痰，胸部CT提示肺实变，符合肺炎链球菌肺炎典型症状（铁锈色痰为经典表现，但实际中可能不典型）；（2）涂片结果：革兰阳性双球菌（矛头状，成双排列），为肺炎链球菌典型形态；（3）培养特性：血平板α溶血（草绿色溶血），与肺炎链球菌一致（金黄色葡萄球菌为β溶血，肠球菌为γ或α溶血，但形态不符）；（4）鉴定试验：Optochin敏感试验阳性（98%肺炎链球菌对Optochin敏感，其他α溶血链球菌如草绿色链球菌耐药），胆汁溶菌试验阳性（肺炎链球菌可被胆汁溶解，其他链球菌不溶解）。3.药敏试验药物选择及判读标准（CLSI2024）关键药物：青霉素、头孢曲松、左氧氟沙星、万古霉素（备选）。判读标准：（1）青霉素：-非脑膜炎患者：敏感（MIC≤2μg/ml）、中介（MIC4μg/ml）、耐药（MIC≥8μg/ml）；-脑膜炎患者：敏感（MIC≤0.06μg/ml）、中介（MIC0.12-1μg/ml）、耐药（MIC≥2μg/ml）（因血脑屏障穿透性要求更高）。（2）头孢曲松：-非脑膜炎：敏感（MIC≤1μg/ml）、中介（MIC2μg/ml）、耐药（MIC≥4μg/ml）；-脑膜炎：敏感（MIC≤0