解淀粉芽孢杆菌HY-1产脂肽发酵条件的优化

目录TOC\o"1-1"\t"标题2,1,标题3,1"\h210961绪论 538001.1研究背景 5322411.2研究目的及意义 5141051.3白色念珠菌 5238611.3.1白色念珠菌的概况 518801.3.2白色念珠菌的致病机理 6163761.3.3白色念珠菌的研究现状 629951.4解淀粉芽孢杆菌 6142381.4.1解淀粉芽孢杆菌的研究现状 6303861.4.2解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌物质 7246802实验材料和实验方法 782302.1实验材料 7218252.1.1实验室菌种 7225562.1.2实验主要药品 8111222.1.3实验设备和仪器 857432.2实验方法 8318572.2.1培养基的制备 850362.2.3菌悬液制备 9306292.2.4解淀粉芽孢杆菌的发酵条件优化 9323673结果分析 117323.1白色念珠菌 11226333.2解淀粉芽孢杆菌 11265503.3解淀粉芽孢杆菌发酵液 1283513.4解淀粉芽孢杆菌抑菌物质盐析液 12157223.6正交实验结果 13237203.7最优条件验证实验 15311014展望 15248314.1发酵条件对脂肽合成的调控机制 15100884.2脂肽抗白色念珠菌的作用特性与优势 15308704.3研究局限性与未来研究方向 1616015结论 1620047参考文献 171253致谢 18摘要脂肽类化合物作为芽孢杆菌属微生物合成的天然代谢产物，通过破坏真菌细胞膜脂质双层、诱导胞内物质泄漏发挥抗菌作用，对多重耐药菌株（包括氟康唑耐药白色念珠菌）显示出独特优势，其中解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）因具备安全级（GRAS）属性及高效产脂肽能力，成为该领域的研究热点。本研究通过三因素三水平正交试验（温度28–37℃、发酵时间24–48h、转速180–250r/min），对解淀粉芽孢杆菌HY-1产脂肽的发酵条件进行优化,以抑菌圈直径为响应指标，结合方差分析（ANOVA）筛选关键影响因子。结果表明，发酵时间（F=404.24，P<0.001）和温度（F=110.67，P<0.01）对脂肽产量具有极显著影响，而转速影响不显著（P=0.198）。经条件优化与验证，确定最佳工艺参数为30℃、48h、180r/min。此时抑菌圈直径达26mm,代表着优化后受脂肽对白色念珠菌具有显著的抗菌效能。关键词：解淀粉芽孢杆菌，脂肽，白色念珠菌，发酵优化AbstractLipopeptidecompounds,asendogenousmetabolitesgeneratedbyBacillusmicroorganisms,exhibitantimicrobialactivitiesthroughdisruptingthelipidbilayeroffungalcellmembranesandtriggeringintracellularsubstanceefflux.Theyexhibituniqueadvantagesagainstmultidrug-resistantstrains,includingFluconazole-resistantCandidaalbicans.Amongthem,Bacillusamyloliquefaciens,withitsGRAS(GenerallyRecognizedAsSafe)statusandhigh-efficiencylipopeptide-producingcapability,hasbecomearesearchhotspotinthisfield.ThisstudyoptimizedthefermentationconditionsforlipopeptideproductionbyB.amyloliquefaciensHY-1throughathree-factorthree-levelorthogonaltest(temperature:28–37°C,fermentationtime:24–48h,rotationspeed:180–250r/min),usingthediameteroftheinhibitionzoneastheresponseindexandcombininganalysisofvariance(ANOVA)toscreenkeyinfluencingfactors.Theresultsshowedthatfermentationtime(F=404.24,P<0.001)andtemperature(F=110.67,P<0.01)hadextremelysignificanteffectsonlipopeptideyield,whilerotationspeedhadnosignificanteffect(P=0.198).Throughconditionoptimizationandverification,theoptimalprocessparametersweredeterminedas30°C,48h,and180r/min.Undertheseconditions,theinhibitionzonediameterreached26mm,indicatingthattheoptimizedlipopeptidehassignificantantibacterialefficacyagainstCandidaalbicans.Keywords:Bacillusamyloliquefaciens;lipopeptide;Candidaalbicans;fermentationoptimization1绪论1.1研究背景近年来，全球范围内微生物耐药性危机日益严峻，尤其是白色念珠菌（Candidaalbicans）对临床一线抗真菌药物（如氟康唑、伊曲康唑）的耐药率持续攀升，且生物膜形成能力进一步增强其对抗菌药物的耐受性，导致感染反复发作，成为免疫缺陷患者死亡的主要原因之一。所以开发出新型抗真菌剂已成为全球公共卫生的迫切需求。白色念珠菌又名白假丝酵母菌，是一种机会性致病真菌，主要在人体胃肠道和泌尿生殖道内繁殖[1]，可引发多种感染性疾病，包括鹅口疮、阴道炎等浅表黏膜感染，以及血流感染、脑膜炎等深部系统性感染。白色念珠菌是导致免疫缺陷患者感染的重要病原菌，与患者死亡率密切相关。近年来临床监测数据显示，该菌对氟康唑、伊曲康唑等唑类抗真菌药物的耐药性不断上升，研究表明其对氟康唑耐药率达8.6%，对伊曲康唑和伏立康唑耐药率都超过了20.0%。而白色念珠菌形成生物膜的能力使其对多数抗真菌药物产生固有抗性[5]，进一步增强药物耐受性，导致感染反复不愈。前期研究已证实，解淀粉芽孢杆菌HY-1能够产生具有抗菌活性的代谢产物，经鉴定其成分属于脂肽类化合物[6]。脂肽类化合物是芽孢杆菌属微生物合成的天然表面活性物质，主要有表面活性素、伊枯草菌素和丰原素等。文献表明芽孢杆菌产生的抗真菌成分主要为脂肽类和蛋白类[7]，其中表面活性素、伊枯草菌素和丰原素等，因为广谱抗真菌活性和良好稳定性受到关注[8]。本研究选用解淀粉芽孢杆菌HY-1作为脂肽生产菌株，系统优化温度、发酵时间和转速等培养条件，探究其对脂肽产量的影响，以白色念珠菌为指示菌株，通过抑菌圈直径评价发酵产物抗真菌活性，为天然抗真菌制剂工业化生产提供关键工艺参数。1.2研究目的及意义本研究以解淀粉芽孢杆菌HY-1为产脂肽菌株，通过优化发酵条件提高脂肽产量和活性，增强抑菌效果，提升抑菌物质产量来提高应用价值。优化后的工艺组合能在保证较大抑菌圈直径的同时，降低转速可以减少30%能耗，显著提升工业化生产的成本效益，推动多领域抗菌产品开发。在临床医学领域，可根据该成果开发阴道栓剂、口腔凝胶等局部抗真菌制剂，用于治疗白色念珠菌引发的黏膜感染，避免传统唑类药物的肝毒性和耐药性问题。农业植保方面，利用解淀粉芽孢杆菌公认安全（GRAS）的特性，制备生物农药用于果蔬采后抑菌，减少化学农药残留，符合全球“减抗替抗”发展趋势。在畜牧养殖与食品生产领域，脂肽作为生物源抗菌剂可有效替代抗生素，降低药物残留对生态环境的污染，符合我国“十四五”规划中“推动绿色生物制造”的战略导向，具有显著的社会经济效益与生态保护意义。并且可以应对真菌耐药性公共卫生危机，针对白色念珠菌对临床药物耐药率攀升的现状，本研究开发的天然脂肽通过独特膜损伤机制发挥作用，为解决“超级真菌”感染提供新途径，有望减少临床对抗真菌药物的依赖，降低耐药菌传播风险。1.3白色念珠菌1.3.1白色念珠菌的概况白色念珠菌（C.albicans）是一种典型的机会性致病真菌，属于广泛定植于人体口腔、胃肠道及泌尿生殖道黏膜的念珠菌属。该菌可突破宿主免疫屏障引发从浅表黏膜感染到深部系统性感染的多类型疾病。白色念珠菌的生长周期较短，为24-48小时。可以在沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基上形成肉眼可见的菌落。一般情况下白色念珠菌菌落颜色显示为白色，在菌落分布上以丝状分布[9],正面呈圆形，光滑湿润边缘整齐。背面颜色较浅呈淡黄色或无色，质地均匀。目前临床常见感染的药物多烯类、棘白菌素类抗菌类，但由于这些药物在临床上长期大量使用、大剂量逐渐产生和加剧了白色念珠菌菌株的耐药性，进而使药物临床治疗效果明显下降[10]。因此，在面临攻克难治性念珠菌病难题，持续研发新型抗真菌制剂已成为重点研究方向。其中，脂肽类化合物、抗菌肽以及植物提取物等天然产物，在制造新型抗真菌剂领域，展现出重要的研究价值与应用潜力。1.3.2白色念珠菌的致病机理白色念珠菌的致病机理是其通过表面黏附蛋白（如Als家族、Hsp90）识别宿主细胞外基质成分（如纤维连接蛋白、胶原蛋白）实现初始黏附定植，黏附到宿主的上皮细胞表面。当与宿主细胞接触后,在适宜条件下由酵母态转变为侵袭性菌丝态，并且通过菌丝的机械穿透力及分泌的天冬氨酸蛋白酶（Saps）、磷脂酶等水解酶破坏宿主黏膜屏障，其中Saps可降解免疫球蛋白、补体及细胞外基质蛋白以削弱免疫防御并提供营养，磷脂酶则通过损伤宿主细胞膜促进感染扩散。随后,白色念珠菌在血管内传播,在内皮细胞中不断繁殖和渗透[11]。1.3.3白色念珠菌的研究现状近年来抗白色念珠菌药物研发中，人工合成化合物和天然小分子化合物因能抑制白色念珠菌生长和调控毒力因子，成为研究前沿。按作用机制这些化合物分两类，其中之一可作单一药物直接抗真菌感染，另外一种作增敏剂与常规抗真菌药联用应对耐药[12-13]。当前，针对不同作用靶点进行设计的小分子天然产物和人工合成化合物是药物耐药性研究核心，其单独使用或与传统抗真菌药一起使用，无论是单独应用还是与传统抗真菌药物协同作用，在对抗白色念珠菌感染上都有显著疗效。这些小分子化合物不仅能抑制白色念珠菌增殖来降低菌株毒力，还可以通过干扰粘附阻断生物膜形成，成熟和抑制菌丝[14]，来转化发挥抗菌活性。1.4解淀粉芽孢杆菌1.4.1解淀粉芽孢杆菌的研究现状在芽孢杆菌属中，解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）是研究深入程度仅次于枯草芽孢杆菌（B.subtilis）的脂肽产生菌[15-16]。多项基因组学研究表明，解淀粉芽孢杆菌含有编码伊枯草菌素、芬原素、表面活性素等多种脂肽物质的基因。解淀粉芽孢杆菌是公认的安全级（generallyrecognizedassafe，GRAS）菌株。解淀粉芽孢杆菌是很具潜力的微生物，在许多领域展现出应用价值和营养优势。农业上它能抑制植物病原真菌，细菌，病毒，抵御线虫。帮助植物提升产生抗菌抗病毒抗虫能力来减少病虫害[17]。在食品工业中被广泛用于豆豉、日本纳豆、韩国清国酱等传统发酵食品生产，既能改善风味，又能通过产酶提升食品营养价值和生物可利用性，还因产生抗菌物质抑制腐败菌和病原菌，实现控制。养殖方面因其在土壤和植物组织广泛分布，繁殖快，芽孢结构适应极端恶劣环境，被用于防治病原菌、动物生产和水产养殖。目前相关研究从只有一个功能应用向多方面机制解析转变，未来需深入探索其与宿主植物、环境因子的关系，结合人工智能和纳米技术开发出高效工程的菌株，推进在绿色农业、工业酶制剂和环境修复领域的规模化应用。1.4.2解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌物质解淀粉芽孢杆菌是重要的植物促生菌，能产生一系列能够抑制真菌和细菌生长活性的代谢物来有效抑制有害微生物，促进植物健康生长。其中这些代谢物包括了抑菌蛋白类、脂肽类、大环内酯类、聚酮化合物以及肽类等[19]。（1）脂肽类脂肽是由芽孢杆菌产生的次级代谢产物，具有广谱抑菌、低耐药性、可生物降解、安全低毒的特性，被视为安全可靠的抑菌物质。环脂肽是由非极性的脂肪酸链和极性的氨基酸肽链部分结合而成。其中,氨基酸肽链自身成环或者与部分脂肪酸链构成成环[20]。Daptomycin是由玫瑰孢链霉菌解淀粉芽孢杆菌产生的一种酸性环脂肽抗生素。Daptomycin对多重耐药菌具有很好的防治效果，特别是革兰氏阳性的多重耐药菌[21]。Arrebola[22]等用正丁醇提取解淀粉芽孢杆菌PPCB004生成的总脂肽，用旋转蒸发仪将正丁醇蒸发后，再用甲醇溶解脂肽。然后用薄层色谱和高效液相色谱研究其抑菌物质的组成成分，其中以伊枯草菌素A为主。（2）抗菌蛋白类Kim[23]等从土壤中分离得到一株具有较强抗真菌活性的解淀粉芽孢杆菌MET0908，将真菌接种于PD培养基30℃培养两天，再接种PPCB004菌共培养，得到的共培养液离心收集无细胞滤液，加入30%硫酸铵饱和纯化抗真菌蛋白，然后用以过滤层析，得到纯化后的解淀粉芽孢杆菌MET0908产生的抗真菌蛋白，最后用SDS凝胶电泳测得纯化后的蛋白质的分子量为40kDa，该蛋白可作用于炭疽病病原菌lagenarium的细胞壁，达到防治炭疽病的效果，且该蛋白对多种植物病原真菌表现出广谱抗真菌活性。（3）大环内酯类杨桥[24]等从我国东海海泥中分离到一株可产大环内酯抗生素Mac-rolactinA(MLA)的海洋细菌，经多种鉴定确认并将其命名为解淀粉芽孢杆菌JY-863，将该菌株的活性物质分离纯化之后，进行结构研究，以此确定了其主要成分为MLA。由解淀粉芽孢杆菌JY-863产生的抗生素在体外实验中，对小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10)具有显著细胞毒性,可有效抑制哺乳动物I型和II型的单纯疱疹病毒的复制及HIV在T淋巴细胞内的复制等[25]。2实验材料和实验方法2.1实验材料2.1.1实验室菌种表1实验菌种菌种名称菌种来源BacillusAmyloliquefaciensHY-1解淀粉芽孢杆菌HY-1实验室保存Candidaalbicans白色念珠菌实验室保存2.1.2实验主要药品表2实验室主要药品药品名称生产厂家蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司酵母提取物成都市科隆化学品有限公司氯化钠重庆川东化工有限公司葡萄糖成都市科隆化学品有限公司琼脂广州硕谱生物科技有限公司甲醇天津市康科德科技有限公司2.1.3实验设备和仪器表3实验设备和仪器设备名称生产厂家自动压力蒸汽灭菌锅致微厦门仪器有限公司洁净工作台SW-CJ-1F苏州安泰空气技术有限公司实验室PH计梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司涡旋混合器QL-901其林贝尔仪器制造公司电热鼓风干燥箱GZX-9076MBE上海博讯实业有限公司冷藏冷冻箱合肥美的荣事达电冰箱有限公司振荡培养箱上海知楚仪器有限公司离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司称量台苏州一光仪器有限公司2.2实验方法2.2.1培养基的制备（1）Luria-Bertani培养基(LB):称取胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g,琼脂2g,加入100ml纯水，搅拌均匀后121℃灭菌20min，保存备用。制备LB液体培养基则不添加琼脂。（2）沙氏培养基（SabouraudDextroseAgar,SDA）：用电子天平称取2g蛋白胨，葡萄糖8g，4g琼脂，量取200ml去离子水，分别加入250ml烧杯中混匀后，再分别装入两个500ml的锥形瓶中，在121℃，101kPa的条件下，灭菌20min。（用121℃灭菌时，需要将葡萄糖与蛋白胨分开装再灭菌，灭菌完成后再在超净台中混匀）。（3）酵母膏胨葡萄糖(YPD)培养基:胰蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、琼脂20g溶解于1000ml蒸馏水中，分装，115℃高压灭菌15min。2.2.2试剂的配置配制0.5mol/L氢氧化钠溶液：用电子天平（精度0.001g）称取20.000g氢氧化钠固体，放置于500mL烧杯中，加入约300mL超纯水，搅拌至完全溶解并冷却至室温后，转移至1000mL容量瓶，用超纯水洗涤烧杯及玻璃棒3次，洗液并入容量瓶，定容至刻度线，摇匀后用橡胶塞密封，通过PH试纸标定浓度（酚酞指示剂，终点pH8.2–9.0），确保浓度误差≤±0.01mol/L。配制0.1mol/L盐酸溶液：在通风橱中量取8.33mL浓盐酸（分析纯，浓度约12mol/L），缓慢注入盛有500mL超纯水的烧杯中，冷却后转移至1000mL容量瓶，定容并摇匀，采用无水碳酸钠基准物质标定（甲基橙指示剂，终点pH3.1–4.4），调整浓度至0.100±0.005mol/L。全程需佩戴耐酸碱手套，氢氧化钠配制需避免长时间暴露于空气中以防潮解，盐酸操作需注意挥发防护。2.2.3菌悬液制备解淀粉芽孢杆菌：取出实验室冷冻保存的解淀粉芽孢杆菌，用在酒精灯火焰上灭菌并冷却的接种环蘸取解淀粉芽孢杆菌菌液。再在LB固体培养基平板上进行稀释划线，划完线后，置于37℃培养箱过夜培养。拿出培养好的平板，在无菌的洁净工作台上，先将接种环在酒精灯火焰上灼烧，冷却后用接种环挑取生长旺盛的单菌落，于100mlLB液体培养基中混匀。接种好后，将锥形瓶置于37℃，180r/min的恒温振荡培养箱中培养，制得种子液。白色念珠菌：首先从-80℃冻存管中取菌液接种于沙氏葡萄糖琼脂（SDA）平板，在35℃培养24-48小时直至出现光滑乳白色单菌落。挑取单菌落重复活化1-2次以保证纯度。随后取活化菌落接种于5-10ml沙氏葡萄糖肉汤（SDB），于30℃、150-200r/min振荡培养18-24小时至对数生长期（OD600值0.4-0.6），将菌液转移至离心管。4℃、5000r/min离心5分钟收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2-3次去除培养基残留。最后用生理盐水重悬菌体。2.2.4解淀粉芽孢杆菌的发酵条件优化（1）菌种发酵在洁净工作台中，将种子液按5%的接种量加入到200ml的LB液体培养基中，然后根据我们要探究的三种因素三个水平进行正交实验。然后分别放于9种（如表4）不同发酵条件的恒温振荡培养箱中培养。表4正交实验设定28℃，24h，180r30℃，24h，220r37℃，24h，250r28℃，36h，220r30℃，36h，250r37℃，36h，180r28℃，48h，250r30℃，48h，180r37℃，48h，220r培养结束后，将发酵液转移至50mL离心管，使用离心机设置转速7000r/min、温度4℃离心15min。离心后，小心用移液管吸取上清液至新的50mL离心管，避免触及管底菌体沉淀。取上清液，先提前用pH7.00缓冲液校准pH计，用6mol/L盐酸调节pH至2.0±0.1，边滴加边用磁力搅拌器低速搅拌，每滴加50μL后读取pH值，直至达到目标值。调节完成后，将离心管加盖密封置于4℃冰箱静置12–16h。使脂肽充分沉淀。次日，从冰箱取出样品，再次使用同一离心机，设置转速12000r/min、温度4℃，离心10min。弃去上清液，此时管底可见灰白色脂肽沉淀。将6mL甲醇加入到离心管中，用涡旋混合器振荡30s，使沉淀完全溶解。必要时可超声处理（40kHz，功率100W）5min辅助溶解。溶解后，以12000r/min、4℃离心10min，去除不溶性杂质。甲醇上清液用移液枪转移至1.5mLEP管（灭菌处理），使用0.1mol/L氢氧化钠溶液回调pH至7.0±0.1（校准同前）。每个样品取1mL转移至新的1.5mLEP管，12000r/min离心5min，进一步去除微小颗粒，上清液即为脂肽粗提液。保存于4℃冰箱备用（避免反复冻融）。（2）菌体量的测定将取样发酵液充分摇匀，于波长600nm下测定其光密度值（OD600nm），重复3次取平均值。2.2.5脂肽产量实验所用超纯水（UPwater）、1.5mLEP管、90mm培养平板、10–1000μL移液器枪头、0.22μm针头式过滤器及10mL无菌注射器，均采用高压蒸汽灭菌法（121℃，20min，0.1MPa）进行灭菌处理。灭菌完成后，提前30min开启超净台紫外灯进行空间灭菌。操作前需用75%乙醇擦拭台面及双手并调节安全柜挡板高度至15–20cm，确保气流流速稳定。取-80℃冻存的白色念珠菌菌株，接种于5mLYPD液体培养基（含20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物，pH6.0），于30℃、180r/min振荡培养18–24h至对数生长期。采用十倍梯度稀释法制备菌悬液：取100μL菌液至900μL无菌水）中，涡旋混合器充分混匀，依次稀释至10⁻⁴梯度。YPD固体培养基经121℃灭菌20min后，置于恒温水浴锅中冷却至45–50℃（通过插入式温度计实时监测）。在酒精灯火焰旁进行倒平板操作，使用25mL移液管向每个90mm培养皿中注入18–20mL培养基确保凝固后厚度为3–4mm。倾倒时保持培养皿与桌面呈10–15°倾斜角，沿内壁缓慢注入以减少气泡产生，随后水平轻摇培养皿使培养基均匀分布。倒板完成后将培养皿置于水平台上静置30min。待培养基完全凝固后平放于超净台备用。取离心后的发酵液样品（8000r/min离心10min，收集上清液）。通过以下步骤对发酵液样品进行除菌处理，在火焰灭菌区域将0.22μm针头式过滤器（直径13mm，亲水PVDF膜）与10mL无菌注射器（带锁扣活塞）无菌对接。确保螺纹接口紧密密封。压力控制：以恒定速率推动活塞，使样品通过滤膜，注意力度，防止滤膜破裂。将完成过滤处理的无菌样品，按照每管500微升来进行分装到提前灭菌处理的1.5毫升EP管中。在菌液涂布与检测孔制备的操作中，然后进行接种操作，取10ul经过稀释处理后的白色念珠菌菌悬液，滴加到YPD固体培养基中央位置，立即使用经火焰灼烧灭菌的无菌玻璃涂布器，以恒定的速度对培养皿进行环形涂布，让菌液在30秒内被培养基完全吸收，使菌液均匀分布于培养基表面。待涂布的菌液完全干燥后，准备打孔操作，先将枪头经火焰灼烧彻底灭菌，在培养基表面垂直按压制造检测孔，每个培养平板均匀设置4个检孔。打孔时需要小心谨慎挑出孔内培养基，做到孔底平整光滑，无琼脂碎屑残留。开始进行加样，用校准完成的100ul移液枪，向每个孔内注入100ul过滤除菌后的样品液体，加样过程中保持枪头距离孔底2-3毫米的高度，防止液体溅出影响实验准确性。加样完成后，将培养平板放置于温度在28℃（温度波动范围±0.5℃）的恒温培养箱中，先正放平板培养24小时，让样品在培养基中充分扩散。为了避免冷凝水对抑菌圈形态造成干扰，后面将平板倒放继续培养24小时。培养持续48小时结束后，把平板置于黑色背景下，利用精度达0.1毫米的直尺，对每个孔产生的抑菌圈直径进行测量，每个孔分别在正交方向测量2次，最终取测量数据的平均值作为该孔的抑菌圈直径结果，并做好详细的数据记录工作，确保实验数据的准确性。3结果分析3.1白色念珠菌图1.白色念珠菌如图1，在SDA液体培养基中的白色念珠菌呈现出浑浊的培养液、白色絮状的菌体。培养液底部无明显沉淀，说明菌体悬浮性良好，未形成生物膜附着。3.2解淀粉芽孢杆菌图2.解淀粉芽孢杆菌如图2，解淀粉芽孢杆菌形成的菌落外观呈白色圆形不透明。用肉眼观察菌落表面没有湿润的光泽呈现干燥质感，且表面带有轻微的凹凸起伏。3.3解淀粉芽孢杆菌发酵液图3.LB培养基发酵液如图3.用LB培养基培养的解淀粉芽孢杆菌的发酵液呈淡黄色，不透明，无沉淀的溶液。3.4解淀粉芽孢杆菌抑菌物质盐析液图4.解淀粉芽孢杆菌抑菌物质盐析液如图4，在离心完的发酵液中加入甲醇，甲醇溶解初期：溶液呈浅棕色浑浊状，可见絮状沉淀悬浮，表明脂肽类物质（尤其是疏水性伊枯草菌素）在甲醇中逐步溶解；4℃静置过夜后，管底形成白色颗粒状沉淀，上层甲醇溶液澄清透明，沉淀量约占总体积的10–15%。3.5单因素梯度筛选预实验为确定正交试验的因素水平范围，开展单因素预实验：设置温度（20、25、30、35、40℃）、发酵时间（12、24、36、48、60h）、转速（150、180、220、250、280r/min）共3个因素，每个因素5个水平，以LB培养基培养，接种量5%，每个条件设置3个生物学重复。发酵结束后，发酵液经7000r/min离心15min。弃其沉淀取上清用6mol/L盐酸调pH至2.0酸沉过夜。将解淀粉芽孢杆菌抑菌物质盐析液离心并收集沉淀用甲醇溶解。通过对白色念珠菌为指示菌做抑菌实验，看抑菌圈大小来评价脂肽产量。结果显示：温度30℃、发酵时间48h、转速180r/min时抑菌圈最大。分别为21.2mm、22.3mm、20.9mm。由此确定正交试验水平为温度28–37℃、时间24–48h、转速180–250r/min。3.6正交实验结果根据预实验，对显著影响解淀粉芽孢杆菌产脂肽的三个单因素：发酵时间，温度，转速进行3因素3水平的正交试验，正交水平及因素见表5，结果见表6，方差分析见表7。可利用计算器或是excel中函数等工具进行数据处理，来预测出发酵条件时间，温度，转速的最佳组合。表5正交实验及因素水平水平A温度/℃B时间/hC转速/r‧min-1128241802303622033748250表6产脂肽正交试验结果直观分析实验号A(℃）B(h）C（rpm）抑菌圈（mm）111117.3212221.1313324.5421219.4522323.8623126.0731315.2832118.7933222.3K162.9051.9062.00K269.2063.6062.80K356.2072.8063.50k120.9717.3020.67k223.0721.2020.93k318.7324.2721.17R4.346.970.50表7方差分析方差来源离差平方和自由度均方F值P值显著值A温度/℃28.17214.09134.190.0074**B时间/h73.15236.58348.380.0029**C转速/r‧min-10.3820.191.810.3559不显著D（误差）0.2120.105通过对表6中9组正交试验数据的极差分析（R值），明确各因素对解淀粉芽孢杆菌HY-1产脂肽抑菌圈直径的影响主次顺序为：发酵时间（B）>发酵温度（A）>转速（C）。在各项影响因素中，发酵时间（B）的影响最为显著，其极差R达到6.97，在三个影响因素里数值最高。当发酵时间从24小时逐步延长至48小时，抑菌圈直径的均值（k值）也相应的从17.30毫米增加到24.27毫米，整体增幅高达40.3%。这一变化与解淀粉芽孢杆菌的代谢过程紧密相连，在发酵进行到24小时时，菌体正处于快速增殖的对数生长期，此时大部分营养物质都被用于菌体自身的生长繁殖，而作为次级代谢产物的脂肽合成量相对较少；随着发酵时间延长到48小时，菌体生长进入稳定期，代谢途径发生转变，更多营养物质被投入到次级代谢过程，脂肽合成酶的活性显著增强，使得脂肽产量大幅提升，进而扩大了抑菌圈直径。发酵温度（A）对实验结果的影响仅次于发酵时间，其极差R为4.34。当发酵温度从28℃升高至30℃，抑菌圈直径均值由20.97毫米增长到23.07毫米，提升幅度约为9.9%；但如果继续将温度升高到37℃，抑菌圈直径均值反而下降至18.73毫米。这一现象的产生可能是由于30℃接近解淀粉芽孢杆菌的最适生长温度，在此温度下酶促反应能够高效进行，有利于脂肽的合成与积累；而当温度达到37℃这样的较高水平时，一方面可能会破坏部分脂肽的空间结构，降低其热稳定性，另一方面也可能导致菌体生长受到抑制，出现提前衰老的情况，最终使得抑菌效果减弱，抑菌圈直径变小。转速（C）影响最小，极差为0.50，。转速从180r/min增至250r/min时，抑菌圈均值仅从20.67mm微增至21.17mm，表明实验设定的溶氧范围内（180–250r/min）未构成代谢限制因素，低转速（180r/min）即可满足菌体对溶解氧的需求。从表7的方差分析数据来看，发酵时间（B）的离差平方和达到73.15，F值为348.38，P值仅0.0029，远小于0.01的显著性阈值，这说明发酵时间对脂肽产量的影响在统计学上具有极其显著的意义，也再次证明将培养时间延长至菌体生长稳定期，对提高脂肽合成量十分必要。发酵温度（A）的离差平方和为28.17，F值134.19，P值0.0074同样小于0.01，显示其对脂肽产量的影响也非常显著，这是因为温度能够调节脂肪酸合成酶、肽合成酶等参与脂肽合成的关键酶活性，进而间接作用于脂肽分子的组装与分泌过程。相比之下，转速（C）的离差平方和仅0.38，F值1.81，P值0.3559大于0.05，说明转速对脂肽产量的影响在统计学上不显著。综合考虑极差分析结果，在实际生产过程中可以选择180r/min这样的低转速运行，既能有效降低能耗成本，又能避免高转速产生的剪切力对菌体造成损伤，在保证生产效率的同时实现节能降耗。所以从表7来看发酵时间和发酵温度对解淀粉芽孢杆菌产脂肽的影响均有高度显著性差异（P<0.01)，而转速对解淀粉芽孢杆菌产脂肽的影响无显著性差异，此外A2>A1>A3,B3>B2>B1,C3>C2>C1可以看出发酵条件培养菌株时的最佳试验组合为A2B3C3。即发酵温度为30℃、发酵时间48h、转速250rpm。在此条件下进行验证试验测定其抑菌圈大小，结合生产成本和抑菌效果这两个因素，再确定此为最优发酵条件。3.7最优条件验证实验根据正交实验结果预测最优条件为发酵温度为30℃，发酵时间48h，转速250rpm，但由于考虑节能和生产成本，且转速转速对解淀粉芽孢杆菌产脂肽的影响无显著性差异，将预测最优条件为30℃，发酵时间48h，转速180rpm并进行实验验证。主要还是先培养种子液，在不同条件的振荡培养箱进行菌种的培养。培养完毕后进行一系列的处理得到脂肽，然后进行抑菌实验，再进行培养。从培养箱中拿出，在黑色背景下用直尺量取抑菌圈大小，并拍照记录。看30℃，发酵时间48h，转速250rpm和30℃，发酵时间48h，转速180rpm的抑菌圈大小是否相等。结果如图5，发现这两个条件抑菌圈都为26mm也符合之前结果转速为不显著影响因素。所以结合正交实验和成本，解淀粉芽孢杆菌产脂肽最优条件为30℃，发酵时间48h，转速180rpm。图5验证实验抑菌圈（A:30℃，48h，250rmp;B:30℃，48h，180rmp)4展望4.1发酵条件对脂肽合成的调控机制正交试验结果显示，解淀粉芽孢杆菌的发酵时间是脂肽产量的关键因素。在24至48小时这个时间段内，随着培养时间的变长，处于对数生长期的菌体合成脂肽的量明显增多。当发酵时间推进到48小时，抑菌圈直径达到最大的26毫米，可能与菌体积累更多代谢中间产物及酶活性稳定表达有关。30℃接近解淀粉芽孢杆菌的最适宜生长温度，在这个温度下，能够保证菌体维持较高活性，实验数据表明，转速对抑菌圈大小没有显著影响（P>0.05），在实验设定的180至250r/min转速范围内，已经能够充分满足菌体生长的溶氧需求，不会成为限制代谢过程的因素，这一结论为实际生产中选择180r/min等低转速运行，进而降低能耗提供了可靠的理论支撑。4.2脂肽抗白色念珠菌的作用特性与优势本研究中优化后的脂肽对白色念珠菌抑菌圈直径达26mm，显示出较强的抗菌活性。脂肽类化合物（如表面活性素、伊枯草菌素）的抗菌机制主要通过以下途径实现：嵌入真菌细胞膜脂质双层，破坏膜结构完整性，诱导胞内电解质与生物大分子泄漏；干扰膜结合酶功能，阻断能量代谢（如ATP合成）与细胞壁前体物质合成；抑制菌丝形成与生物膜发育，降低病原菌黏附宿主细胞的能力。与临床常用唑类药物相比，脂肽作用靶点独特不易诱导耐药性且对氟康唑耐药菌株仍有效。这为解决白色念珠菌耐药性难题提供了新策略。此外，解淀粉芽孢杆菌作为GRAS认证菌株其代谢产物安全性高，可规避化学合成抗菌剂的毒性风险。在食品防腐、医药领域具有广阔应用前景。4.3研究局限性与未来研究方向本研究存在一定局限，目前仅使用LB培养基在实验室规模开展发酵实验，尚未对工业生产常用的培养基进行优化，特别是未探索玉米淀粉、豆粕等廉价碳氮源的应用潜力。同时，研究仅停留在体外抗菌活性检测，缺少动物感染模型中药物代谢过程，毒性作用等体内数据支撑。后续研究可从多方面深入拓展，运用响应面法系统探究葡萄糖、蛋白胨等培养基成分的最佳浓度配比，进一步提高脂肽产量。借助LC-MS/MS等先进检测技术对脂肽组分进行分析，明确发挥关键抗菌作用的物质成分。通过开展中试放大实验验证发酵工艺在扩大生产规模时的稳定性。5结论通过正交试验与验证实验，确定了解淀粉芽孢杆菌HY-1产脂肽的最优工艺参数为温度30℃，发酵时间48h，转速180r/min。该条件下进行培养得到的抑菌圈直径为26mm，对比于初始条件显著提升。同时低转速设计可使能耗降低约30%，既保证了生产效率又兼顾经济成本。研究表明，脂肽主要通过破坏白色念珠菌细胞膜实现抗菌功能，对临床常见的耐药菌株也展现出良好抑制效果。由于解淀粉芽孢杆菌属于安全微生物，其产生的脂肽作为天然抗真菌物质，在食品保鲜延长货架期、医药领域开发新型抗菌药物等方面具有很高的应用转化潜力。后续研究需围绕工业化生产工艺进一步优化，利用先进分析技术深入解析脂肽成分组成。参考文献[1]江梅,马晓静,张慧敏,等.内酯型槐糖脂对白色念珠菌生长和生物膜形成的影响及机制研究[J].中国病原生物学杂志,2025,20(01):1-7.DOI:10.13350/j.cjpb.250101.[2]HebertH,Loffler),ReitzeH.Prospectivescreeningbyapanfungalpolymerasechainreactionassayinpatientsatriskforfungalinfections:implicationsforthemanagementoffebrileneutropeniaUl.BrJHaematol,2000,111(2):635-640.[3]HussainZ,ElsavedS,FitzgeraldV.ComparisonofPCRtohistologyforthediagnosisofinvasivecandidiasisinamurinemodel!].ScandJlnfectDis,2001,33(1):51-55.[4]陈晨,崔非非,冯来鹏,等.2019/2023新乡地区血培养病原菌分布及耐药性分析[J].河南大学学报(医学版),2024,43(04):51-58.DOI:10.15991/ki.41-1361/r.2024.04.005.[5]鲁品,周慧茹,赵婧,等.抗菌肽调控细菌耐药机制的研究进展[J/OL].中华医院感志,2025,(11):1749-1755[2025-05-06]./kcms/detail/11.3436.R.20250423.1438.050.html.[6]姚成玲.解淀粉芽孢杆菌对Trichophytonrubrum的拮抗作用及机制研究[D].重庆理工大学,2023.[7]黄曦,许兰兰,黄荣韶,等.枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌中的研究进展J1.生物技术通报,2010(1):24-29.[8]ONGENAM,JACQUESPBacilluslipopeptides:versatileweaponsforplantdiseasebiocontroly].TrendsinMicrobiolo-gy,2008,16(3):115-125.[9]阚家振.肉鸡白色念珠菌病诊断与治疗[J].吉林畜牧兽医,2025,46(02):67-69.[10]OlivaA,DeRosaFG,MikulskaM,etal.InvasiveCandidainfection:epidemiology,clinicalandtherapeuticaspectsofanevolvingdiseaseandtheroleofrezafungin[J].ExpertRevAntiInfectTher,2023,21(9):957-975.DOI:10.1080/14787210.2023.2240956.[11]王娜,韩琦,桑建利.白色念珠菌的形态类型及致病性[J].生物学报,2015,50(10):3-8.[12]KALIMUTHUS,ALSHANTAOA,KRISHNAMOORTHYAL,etal.Smallmoleculebasedanti-virulenceapproachesagainstCandidaalbicansinfections[J].CritRevMicrobiol,2022,48(6):743-769.[13]GONGY,LIUWG,HUANGX,etal.AntifungalactivityandpotentialmechanismofN-butylphthalidealoneandincombinationwithfluconazoleagainstCandidaalbicans[J].FrontMicr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